1、血管生成实验步骤实验方法完善版血管生成实验步骤-实验方法完 善版无论原发性肿瘤还是继发性肿瘤,一旦生长直 径超过12 mm都会有血管生成。这是由于肿 瘤细胞自身可分泌多种生长因子,诱导血管生 成。多数恶性肿瘤的血管生成密集且生长迅速。 因此,血管生成在肿瘤的发展转移过程中起到重 要作用,抑制这一过程将能明显阻止肿瘤组织的 发展和扩散转移。于是体外的血管生成实验就能 很好的模拟肿瘤的血管发生过程,并且适合研究 药物对这一过程的影响实验。图一 血管生成镜检图实验材料和实验方法1.实验材料2.实验方法:2.1实验流程介绍图二 实验流程图(提前将Matrigel融化,铺于ibidi血管生 成载玻片的下
2、孔中,待胶凝后,将细胞悬液加入 血管生成载玻片上孔中,成管后使用显微镜观 察。2.2耗材结构介绍 * 4 mm 右mm(Matrigel铺在下孔,细胞铺在Matrigel上,上孔充满培养基)2.3数据分析流程介绍图四 实验结果收集和分析流程图(在特定的时间点采集图片,并且进行图像分 析(Wimasis全自动分析)测量小管长度,成环 数,细胞覆盖面积和结点。之后在对测量结果进 行统计分析以说明实验结果。)一.实验步骤1、准备基质胶1.实验前一天将Matrigel置于冰盒中,放入 4。C冰箱,使胶能过夜缓慢融化。(注意:同样 要准备一些4C预冷的枪头用于吸取Matrigel )2.开始实验前,将M
3、atrigel始终保持放在冰 盒中。3.打开灭菌包装,取出ibidi 血管生成载玻片。4.每孔中加入10卩l Matrigel。注意枪头要垂直于内孔的正上方加入 Matrigel,防止有Matrigel流经上孔而留下残留胶。由于Matrigel流动性不强,并且有可能移液 枪不准确,有可能打入10卩l的胶,却不能填满 血管生成载玻片的下孔一一这样,必然会影响到 实验的成像结果。如何判断是否加入了合适体积的 Matrigel :我们只需用一张格子纸就能知道自己的移液 枪调整到多少能正好把下孔填满。如上图所示,垂直透过每个孔看下面的格子 纸,如果格子被缩小了,那么就说明胶没加满, 格子被放大了,那么
4、胶就加多了,格子没发生什 么变形,这才是刚刚加满下孔的状态。2、凝胶1.盖上ibidi血管生成载玻片的盖子。2.准备一个10cm的培养皿,放入浸过水的纸 巾,制成一个湿盒。3.将ibidi血管生成载玻片放入培养皿中,盖 上培养皿盖。4.将整个培养皿放入培养箱中,静置 30分钟 左右,等待胶凝结。5.等待同时准备细胞悬液。3、铺细胞加入细胞的量直接影响实验结果,所以在正式 实验开始之前,要对不同类型的细胞和使用数量进行预实验。获得最佳比例的细胞密度。我们今 天的实验使用HUVE细胞,每孔种10000个细胞 即可。1.准备密度为2*105cells/ml的细胞悬液,充 分混匀。2.将胶已经凝固的i
5、bidi血管生成载玻片从 湿盒中取出。3.每孔加入50卩l的细胞悬液,注意保持枪头 垂直在上孔的上方,不要接触下孔的凝胶。可以 使用排枪。4.同样用格子纸查看是不是加了足够量的液 体,如果没有,加入无细胞的培养基,使上孔液 体正好加满。5.盖上盖,静置,一段时间后,所有细胞都会 沉下去落在Matrigel的表面。Sinking process of cells. After minutes all of the cells have fallen to the ound4、采集图像并统计结果可以按照细胞的生长速度定时采集图像, 并且 对其成管长度,覆盖面积,成环数,结点数进行 测量和记录,并且
6、对其进行统计分析Lp picturvt with b tGx magnificftticn at 0d 2t end 4 houre5、免疫荧光染色根据需要,可以对成管结果进行免疫荧光染 色。小心的移除上孔内培养基,注意不要碰到胶或 者细胞网络加入50卩I用无血清培养基稀释的 calcei n (12.5 卩1 calcei n stock 1 yg / y I),使其终浓度为 6.25 卩g/ml (1:160)。在室温下避光孵育30分钟。使用PBS清洗三次,注意,PBS要缓缓加入上 孔,以免冲击掉细胞。使用 485 nm/ 529 nm进行免疫荧光成 像。实验优势1.这个实验方法能节省更多基质胶,降低实验 成本;2.分上下孔的ibidi血管生成载玻片能去除 凹液面,使成像效果更好。图五 成像对比(左侧ibidi血管生成载玻片无凹液面,整个 视野成像清晰;右侧96孔板有凹液面,中间清 晰周围模糊。)
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