900MHz微波辐射对γ射线致小鼠造血系统损伤的影响.docx

1、900MHz微波辐射对射线致小鼠造血系统损伤的影响低强度微波对射线辐射的防护作用及其可能机制吴兴宇 苏州大学放射医学与公共卫生学院 苏州 215123【摘要】 目的 研究低强度微波对受照射小鼠的辐射防护作用及其可能机制。方法 96只雄性昆明小鼠随机分为对照组、微波照射组（120W/cm2，900MHz，SAR=0.4W/Kg，简称微波组）、射线照射组（5Gy，简称电离组）及微波与射线复合照射组（120W/cm2+5Gy，简称复合组）。微波组与复合组小鼠先接受功率密度为120W/cm2的微波照射，1h/d，持续14d，第15d给予电离组和复合组5.0Gy 60Co-射线一次性全身照射。于照射后3

2、d、6d、9d及12d处死动物，固定胸骨及脾脏，作病理观察，流式细胞仪检测受照射小鼠的脾细胞凋亡率，同时测定血清中抗氧化酶和脂质过氧化物水平。结果 骨髓病理切片显示，单独射线与复合照射均可导致骨髓组织经历典型的凋亡坏死、空虚、再生修复和恢复4个阶段的病理改变，但复合组的病变轻于电离组，恢复也更快；脾损伤病变过程与骨髓造血组织基本相似，复合组病变轻于电离组；流式细胞仪结果显示，照后第6d、第9d复合组脾细胞凋亡率显著低于电离组；氧化损伤检测表明复合组血清SOD水平较电离组升高，脂质过氧化水平显著降低。结论 特定强度的微波辐射具有一定的辐射防护作用，其作用机制可能与抑制辐射诱导的造血细胞凋亡和抗氧

3、化损伤作用有关。【关键词】低强度；微波；辐射防护Study of radiation protection and possible mechanisms for low intensity microwave Wu Xing-yuSchool of Radiation Medicine and Public Health, Sowchow University, Suzhou 215123, China Abstract Objective To investigate radiation protection and possible mechanisms of low intensity

4、 microwave on -ray exposed mice. Methods 96 healthy Kunming mice were randomly divided into the following four groups: normal control, microwave (120W/cm2,900MHz), -ray irradiation(5Gy), combined exposure of microwave and -ray (120W/cm2+5Gy). The microwave group and combined group were exposed to 12

5、0W/cm2 microwave firstly, 1h/d, sustained 14 days, then the ionization and combined group were exposed to 5.0Gy 60Co-ray irradiation at the 15th day. Animals were sacrificed at the third，6th，9th and 12th day after irradiation. The sternum and spleen paraffin section were produced, and the histologic

6、al changes were observed. Apoptosis rate of mice splenic cells in each group was examined by flow cytometry, and serum concentration of antioxidase and lipid peroxide was detected at the same time. Results Bone marrow was obviously injured either by radiation or microwave exposure, characterized by

7、undergoing four- phase lesions, namely apoptosis-necrosis, void, regeneration and recovery phase. Compared to-ray group, the pathological changes in combined group were slighter and the recovery was quicker. The pathological injuries of spleen were similarly to that of bone marrow. Injuries in the c

8、ombined group were slighter than -ray group. It is also showed that apoptosis rate of splenic cells in combined group was significantly lower at the 6th and 9th day after -ray radiation from FCM results. Assays of oxidative damages suggested that serum SOD level in combined group increased while lip

9、id peroxide level decreased significantly. Conclusion Low intensity microwave may exert protection effects on injuries induced by ionizing radiation. The underlying mechanisms might be related with suppression on the hematopoietic cells apoptosis induced by -ray radiation, inhibition of oxidative da

10、mages, and thus enhanced reconstruction of the hematopoietic system.Key words Low intensity; microwave; radiation protection大剂量电离辐射对机体有明显损伤作用。近年来不少报道指出，低强度微波预处理可以显著减轻电离辐射的健康危害1-5。沈世人1等报道，毫米波照射可以减轻60Co射线所致小鼠骨髓损伤。赵阿津4等研究表明，脉冲电磁场对放疗后继发性水肿有明显消退作用，与放疗同时进行可以避免放疗引起的不利健康症状。国外的一些科学家分别采用大鼠、小鼠、狗、鸡胚等实验动物，初步研究了不

11、同频率、不同强度的电磁辐射和电离辐射的复合作用，结果表明，非电离辐射可以降低电离辐射对实验动物的损伤，如死亡率，畸变率降低，存活时间延长等。效应大小与电磁辐射的强度、频率及照射时间等有关2,3,5。一般认为，微波辐射功率密度不超过10mW/cm2为低强度微波（low intensity microwaves, LM）6。本实验室在前期研究工作的基础上7，筛选出900MHz，120W/cm2这一剂量的微波具有显著的保护效应，能够降低电离辐射后的小鼠死亡率，延长小鼠的存活时间，减弱电离辐射引起的外周血白细胞下降；而电离辐射对机体的重要危害之一是产生大量的自由基，破坏体内氧化-抗氧化的平衡，造成造血

12、细胞等的损害8，因此，本实验拟从氧化损伤的角度，观察低强度微波对辐射损伤小鼠抗氧化系统的影响，并结合脾细胞凋亡率的检测，初步探讨其抗辐射的可能作用机制。材料与方法1. 实验动物：清洁级雄性昆明小鼠96只，体重1822g, 上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK(沪)2007-0005。动物饲养于空调室内，室温232，相对湿度50%60%,光照12 h。2.照射条件：（1）如图1所示，电磁辐照系统由信号发生器、功率放大器和GTEM电磁辐照室组成。信号发生器发出的信号由功率放大器放大输入GTEM电磁辐照室内，经过室内的天线产生均匀的电磁场。内部的电磁场功率密度由探头接收后经电脑读出

13、。经计算，本实验条件下微波剂量SAR为0.4W/Kg。（2） 60Co射线源，由苏州大学辐照中心提供。60Co射线一次性全身照射，总剂量为5.0Gy，剂量率为1Gy/min。图1 电磁辐照系统示意图3.主要仪器与试剂：756型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；倒置相差显微镜（Olympus CK-40）；AY220电子天平（SHIMADIU CORPORATION JAPAN）；FC500 流式细胞仪（Beckman Coulter）。 Annexin-FITC细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物）；超氧化物岐化酶（SOD）测试盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）4.

14、动物分组及处理 ：小鼠随机分为对照组、微波组（120W/cm2微波）、电离组（5Gy射线）、复合组（120W/cm2微波+5Gy射线），每组24只。微波组和复合组小鼠置于可透射电磁波的有机玻璃限制盒内，在反射系数近似为零的GTEM电磁辐照室中，放于均匀接受电磁场的辐照平台上，给予900MHz微波整体照射，1h/d，持续14d，对照组与电离组置于同一环境但不予微波照射。于第15d给予电离组和复合组小鼠5.0Gy 60Co-射线一次性全身照射。分别在电离辐射后第3、6、9、12d 4个时相点处死动物，检测各项指标，每组每个时相点6只。5.形态学观察：分别在电离辐射后3d、6d、9d、12d每组处死

15、6只小鼠，取胸骨及脾脏， Hellys液固定，石蜡包埋，苏木精-伊红（Heidenhain-Eosin,H-E）染色，进行组织形态观察。6.流式细胞仪检测细胞凋亡：颈椎脱臼处死小鼠，取出脾脏。0.9%生理盐水浸泡片刻后，在60mm培养皿中加入2ml 0.9%生理盐水，用注射器活塞在筛网上研磨脾组织，收集脾细胞至15ml离心管中，加入双蒸水5ml，静置 2030s，立即加入1.8% Nacl溶液，1500rpm离心5min，弃上清。加入1ml0.9% Nacl溶液重悬细胞，加入5ml双蒸水2030s，立即加入5ml 1.8% Nacl溶液，1500rpm离心5min，弃上清，即可得纯净的脾细胞。

16、采用上述方法收集各组脾细胞，调整细胞浓度为5 1051 106 /ml,将细胞用预冷的PBS 溶液洗2 次；加入200L结合缓冲液(binding buffer) 后混悬细胞,再加入10L Annexin-(20g/ mL) 和5L PI (50g/mL)，轻轻混匀,室温反应15 min ；再加入300L binding buffer，1 h 之内上流式细胞仪检测细胞凋亡率。7.血清SOD活力、MDA水平的检测：分别在电离辐射后3d、6d、9d、12d采用小鼠眼球摘除法取血，分离血清。按照说明书方法，测定血清中总SOD的活性和MDA的水平。8.统计学处理：数据以s表示。定量资料采用完全随机设计

17、多组之间两两均数比较的SNK法检验，率的比较采用秩和检验，统计学处理用SAS8.2软件。结 果1.对骨髓损伤的影响：对照组骨髓细胞增殖活跃，造血细胞均匀地分布在骨髓腔中（图2-a）。微波组骨髓未见明显变化。5Gy射线照射后，小鼠骨髓出现明显的造血损伤和重建的过程，照后3d，电离组造血细胞明显减少，呈现凋亡的典型改变：核固缩、边移、核碎片和凋亡小体形成等，脂肪细胞增多，出现大片空白区，间质广泛出血，血窦充盈（图2-b）；复合组骨髓腔内造血细胞减少较电离组轻，造血组织容积较电离组明显增高，间质出血、水肿较轻（图2-c）； 照后6d，电离组骨髓腔呈现“空虚期”，造血细胞极度减少，血窦结构几乎完全崩毁

18、，髓腔内广泛出血，呈“血湖”状（图2-d）；复合组造血细胞较电离组增生明显，以红系、粒系等幼稚造血细胞为主（图2-e）；照后9d电离组与复合组造血细胞均呈进行性增多，各系细胞再生灶明显，小梁附近、骨皮质及血窦旁见大量幼稚红细胞、粒细胞及巨核细胞成簇状再生，复合组恢复较电离组快（图2-f）；照后12d，复合组各系不同阶段造血细胞比例及形态基本恢复至正常状态，电离组仍未完全恢复，造血细胞较少，间质仍有轻度弥漫性出血及水肿。图2 低剂量微波与射线照射后小鼠骨髓组织学病理观察图2-a 对照组小鼠骨髓细胞腔（100）图2-b 电离组射线照后3d小鼠骨髓（400）图2-c 复合组射线照后3d小鼠骨髓（40

19、0）图2-d 电离组射线照后6d小鼠骨髓（100）图2-e 复合组射线照后6d小鼠骨髓（100）图2-f 射线照后9d小鼠骨髓（400）2.对脾脏损伤的影响：对照组脾脏组织中红髓和白髓界限清晰，小梁清楚，生发中心明显，可见白髓中央小动脉；白髓内淋巴细胞丰富，边缘区可见到个别散在的凋亡细胞，余未见异常（图3-a）。微波组脾结构未见异常。5Gy射线照射后3d，电离组白髓数量极度减少，脾小体体积明显变小，生发中心几近消失，呈枯萎状，淋巴窦扩张、充血（图3-b）。复合组白髓数量减少较电离组明显减轻，生发中心仍可见一定量的淋巴细胞，红髓脾窦充血、出血明显（图3-c）。照后6d，电离组生发中心淋巴细胞仍明

20、显减少，高倍镜观察可见淋巴组织疏松，白髓及边缘区内出现较多散在或灶状分布的凋亡细胞，凋亡淋巴细胞的形态以胞核浓集或聚集于四周较多见（图3-d）。复合组淋巴组织较电离组密集，凋亡细胞数相对较少，白髓内始见淋巴细胞增生（图3-e）。照后9d，电离组脾损伤与修复共存，淋巴细胞始见增生，伴或不伴有间质纤维组织的轻微增生；照后12d，淋巴细胞持续增生，间质纤维组织增生更加明显（图3-f）。复合组各时相点恢复情况均较电离组早，照后12d，复合组脾小体（尤其生发中心）基本恢复至正常状态。 图3 低强度微波与射线照射后小鼠脾组织病理学观察图3-a 对照组小鼠脾脏组织（100，中央小动脉，最大脾小体直径为31.

21、7m）图3-b 电离组射线照后3d脾脏组织（100， 最大脾小体直径为21.6m）图3-c 复合组射线照后3d脾脏组织（100）图3-d 电离组射线照后6d脾脏组织（400）图3-e 复合组射线照后6d脾脏组织（400）图3-f 电离组间质纤维组织增生（400）3.对射线损伤小鼠脾细胞凋亡率的影响：表1显示了流式细胞仪检测脾细胞凋亡结果，图4显示了各组小鼠脾细胞的凋亡趋势。由表1和图4可见，与正常对照组相比，微波组在照后3d脾细胞凋亡率显著升高（p0.05），以后逐渐降低，至照后9d降至最低水平，显著低于正常对照组（p0.01）。5.0Gy电离辐射后，电离组与联合组小鼠的脾细胞凋亡率均上升，在

22、照后各个时相点均高于对照组。但与单独电离组相比，联合组在各个时相点的凋亡率均较低，尤其在照后6d、9d（p0.05），提示预先微波处理对电离辐射诱导的细胞凋亡可能存在一定的抑制作用。Table 1 Apoptosis Rate of mice After 900MHz Microwave and/or -ray ExposureGroupApoptosis rate (%)3d6d9d12dNormal control24.178.2322.3611.0720.49.2824.7110.91Microwave alone42.185.9022.975.717.431.7622.649.17Io

23、nization alone32.8418.1338.654.8239.0512.4523.8913.94Combined group32.1616.6023.0215.18*25.3711.62*21.767.76注： p0.05, p0.01 vs. normal control；p0.05 vs. ionization alone2.4 对射线损伤小鼠血清SOD、MDA水平的影响 如表2所示，与正常对照组相比，电磁组小鼠血清SOD水平在照后各时相点均明显升高（p0.05），照后第9d显著高于正常对照组（p0.01）；5Gy射线照射后3d，电离组小鼠血清SOD水平显著降低，与电离组相比，联

24、合组小鼠血清SOD水平较高（p0.05），且呈逐步上升趋势，于照后第9d、12d显著高于单独电离组（p0.05）。 Table 2 Serum SOD Concentration of mice After 900MHz Microwave and/or -ray ExposureGroupSOD Concentration（U/ml）3d6d9d12dNormal control 83.252.6781.173.2583.44.3982.653.62Microwave alone94.374.4598.794.87117.463.9293.002.29Ionization alone71.4

25、8.1481.671.4687.74.1490.811.34Combined group85.512.41*85.646.9896.619.49*107.582.33*注： p0.05, p0.01 vs. normal control；p0.05 vs. ionization alone 如表3所示，与正常对照组相比，电磁组小鼠血清MDA水平在照后第6d显著降低（p0.05），照后第9d也低于正常对照组，但无明显统计学差异。5Gy射线照射后3d，小鼠血清MDA含量显著升高。与单独电离组相比，联合组小鼠MDA含量在照后第6d显著低于单独电离组（p0.01），照后第9d、第12d仍较低（p0.0

26、5），提示低强度微波预处理一定程度上抑制了电离辐射的氧化损伤。 Table 3 Serum MDA Concentration of mice After 900MHz Microwave and/or -ray ExposureGroupMDA Concentration (nmol/ml)3d6d9d12dNormal control 5.920.486.130.535.860.474.070.69Microwave alone6.221.034.260.515.001.064.321.48Ionization alone9.060.158.541.015.561.224.551.24Co

27、mbined group8.750.226.361.44*4.840.47*4.170.44*注： p0.05vs. normal control；p0.05 ,*p0.01 vs. ionization alone 讨 论 近年来，随着微波凝固治疗（microwave coagulation therapy, MCT）、微波理疗、微波辐射辅助肿瘤化疗应用于临床，对微波的生物学作用及其机制的研究已成为医学、细胞学研究的热点9；同时，不少文献报道指出，微波对电离辐射效应的影响，与两种辐射的照射时间、先后次序以及间隔时间有关。在电离辐射之前给予微波照射, 一般可使电离辐射的效应减轻10,11。因此

28、，对于低强度微波辐射防护效应的研究正逐渐受到人们的重视。本实验发现，5.0Gy射线照射前，预先给予小鼠120W/cm2 900MHz微波照射能够显著减轻造血系统辐射损伤，复合组骨髓组织恢复加快，各系细胞增生明显，尤以幼稚红系、粒系细胞增生最为突出；脾小体萎缩及淋巴细胞凋亡程度明显减轻；造血组织容积显著高于电离组。实验采用“骨髓病理学改变”这个判断辐射造血损伤程度的金标准，再次证实电离辐射之前给予低强度微波预处理，能够显著拮抗电离辐射对造血系统的损伤。关于低强度微波对电离辐射损伤防护的效应机制，目前仍不明确。研究显示，电离辐射作为一种非特异性的物理刺激因子，可对自由基的活性产生影响12。射线产生

29、的羟自由基作用于生物膜脂质双层中的不饱和脂肪酸，使体内发生脂质过氧化反应，产生大量脂质过氧化物，引起体内酶或其它清除自由基相关物质的变化，破坏了体内自由基产生与清除的平衡，导致机体抗氧化能力下降，从而出现不同程度的辐射损伤13。范雪云14对医用X射线工作者的调查显示，此类人员体内SOD活性明显高于对照组，认为是低剂量率辐射刺激后，机体产生氧自由基，诱导SOD活性增高、自由基清除功能增强所致。本实验也观察到单独微波组小鼠体内SOD活性显著高于对照组，5.0Gy射线照后第3d、9d及12d，联合组SOD活性也显著高于电离组，提示低强度微波预处理可能会刺激小鼠体内SOD表达上调，减轻电离辐射引起的氧

30、化损伤。MDA是脂质氧化的终产物之一，实验研究中常用其代表自由基水平15。本次实验中，射线照射后联合组小鼠体内MDA含量在各时相点均低于电离组，再次证实微波预处理可以一定程度上增强SOD酶活性，减轻自由基引起的氧化损伤，从而发挥辐射损伤的防护作用。本次实验还发现，微波照射能够显著降低辐射损伤后的脾细胞凋亡率，促进脾淋巴细胞的增生。郭鹞等16也曾报道，60Hz磁场能够降低X线诱导的乳腺癌细胞凋亡，且这种效应存在着时间窗口特征。特定频率和强度的微波可能通过影响膜电位、改变信号转导等机制增强造血细胞的电离辐射抗性，促进造血损伤的恢复。此外，有人认为，微波能够促进骨髓细胞“优胜劣汰”，通过选择性地促进

31、受损严重的细胞死亡17，促进骨髓造血库循环更新，从而增强骨髓细胞的辐射抗性。宋国丽等18认为微波还可能通过改变造血微环境对造血系统发挥调节作用。这些都将是今后的研究方向。总结我们的实验结果，初步认为低强度微波预处理通过提高小鼠血清SOD活性，及时清除机体细胞内ROS分子，有效减轻电离辐射引起的氧化损伤（降低MDA含量）；通过降低辐射损伤后的脾细胞凋亡率，促进脾淋巴细胞的增生，从而促进造血重建。然而要全面阐明低强度微波的防护机制，还需要更进一步的深入研究。参考文献1沈世人，陈景藻，刘守礼等. 毫米波照射对小鼠外周血象及60Co 射线照射后骨髓细胞CFU-C生成量的影响J. 第四军医大学学报, 1990, 11(2): 99-102.2Michaelson SM, Thomson RA, Quinlan WJ, et al. Tolerance of dogs to microwave exposure under various conditionsJ. Ind Med Sung, 1961,