基于生物信息学与生物技术开发植物分子标记的研究进展精.docx

1、基于生物信息学与生物技术开发植物分子标记的研究进展精分子植物育种，2009年，第7卷，第1期，第130136页Molecular Plant Breeding, 2009, Vol.7, No.1, 130136专题介绍Review基于生物信息学与生物技术开发植物分子标记的研究进展张征锋1肖本泽2*1华中师范大学遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室, 武汉, 430079; 2华中农业大学植物科学与技术学院, 武汉, 430070*通讯作者, benzexiao摘要各种序列数据库的迅猛增长与生物信息软件的不断开发使基于序列资源的标记开发更加便捷，各类分子生物学技术的涌现及高通量检测平台的建设为

2、实验室开发分子标记提供了强有力的技术支持。本文从生物信息学角度概述了SNP 、SSR 等分子标记开发的方法、特点及应用现状，并介绍了利用分子生物技术开发SSR 、SRAP 、TRAP 标记的手段及从RAPD 、AFLP 等标记向单位点特异性PCR 标记(如SCAR 、CAPS 、dCAPS 等 转化的进展。最后，对不同植物标记开发策略的选择及以上各种技术在功能标记开发中的应用前景作了展望。关键词标记开发, 生物信息学, 生物技术, 功能标记The Progress of Development for Plant Molecular Markers Based on Bioin-formati

3、cs and BiotechnologyZhang Zhengfeng 1Xiao Benze 2*1Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology, Central China Normal University, Wuhan, 430079; 2College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan, 430070*Corresponding author, benzexiaoAbstract The

4、 genome sequencing and expressed sequenced tag (ESTprojects generated a vast amount of se-quences data. Simultaneously, the increasing bioinformatics software facilitates the development of molecular mark-ers. Additionally, to develop molecular markers in laboratory will benefit from the advanced bi

5、otechnology and con-struction of batch of operation systems. The methods, characteristics and corresponding application of developing SNP and SSR based on bioinformatics and developing SSR, STAP, TRAP on biotechnology were reviewed. The progress of conversion of RAPD and AFLP to single-locus specifi

6、c PCR markers were also presented. Finally, how to select suitable technique for different plants and develop functional markers are elucidated. Keywords Marker-developing, Bioinformatics, Biotechnology, Functional marker基金项目：本项目由国家自然科学基金(30800680资助分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种新的遗传标记形式。自从1980年Botste

7、in 等首次提出用RFLP 作为遗传标记构建遗传连锁图谱以来，分子标记技术及其应用研究日新月异，相继出现了二十多种DNA 分子标记方法，构成了分别以RFLP 、SSR 及SNP 为代表的三代分子标记。按其技术原理，可分为三大类：第一类是以分子杂交为基础的标记技术，主要是RFLP 。第二类是以PCR 反应为基础的一系列分子标记技术，如RAPD 、SCAR 、STS 和SSR 等。第三类是以酶切和PCR 为基础的分子标记技术，主要有AFLP 和CAPS 等(表1 。近20年来分子标记对植物遗传和育种研究的发展起到了革命性的作用，其应用涉及到重要性状基因或QTL 的定位、遗传图谱的构建、种质资源遗传

8、关系的确定、杂种优势群的划分、比较图谱分析、分子标记辅助选择及图位克隆等多个领域。本文重点介绍利用生物信息学及分子生物学手段开发分子标记的研究进展。1利用数据库序列信息和生物信息学手段开发新的分子标记随着表达序列标签EST 计划的实施及水稻等模式作物中基因及全长cDNA 的克隆，大量的DNA 序列信息被储存在公共数据库。另外拟南芥、水稻等基因组测序工作的完成及其它一些重要生物基因组测序工作的相继开展(Meinkeet al., 1998; Goff et al., 2002; Yu et al., 2002; Timmermans et al., 2004 ，为利用生物信息学手段开发分子标记提

9、供了大量有益的信息。通过利用计算机程序，可以从GenBank 等数据库中将这些序列下载并识别出其中的SSR 、SNP 等潜在的多态性位点。1.1SNP 的生物信息学开发SNP 是指基因组内DNA 中某一特定核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等变化(Lander,1996 。在遗传学分析中，SNP 作为一种遗传标记得以广泛应用，主要源于这几个特点：(1密度高；(2遗传稳定性高；(3易于实现分析的自动化。目前SNP 的检测技术有多种，DNA 芯片由于具有高度集成化、并行化、多样化、微型化等优点而成为最理想的SNP 检测技术(Ngand Liu, 2006 。生物信息学的SNP 挖掘方法主要是基

10、于“冗余”数据库。国际主要的核酸数据库允许不同的机构在任意时间向数据库中提交各种序列，由此造成某一特定区段的序列在数据库中存在多个拷贝，它们可能来源于同一物种不同品系、同种材料不同组织发育时期等，之间存在多态性。为SNP 的开发提供了丰富的资源。目前应用EST 数据库已在人类(Garget al., 1999; Picoult-Newberg et al., 1999; Brumfield et al., 2003 ，拟南芥(Schmidet al., 2003 、玉米(Usecheet al., 2001; Batley et al., 2003 等许多生物中进行SNP 的开发，在如内含子区

11、、3 非翻译区、BAC 末端序列等非编码区的序列是发掘SNP 的很好的资源而且其多态性的检测频率是编码区的表1几种常用标记系统Table 1Some universal systems of molecular markers 标记类型Types of markersSinge Nucleotide Polymorphism Coding SNP, non-coding SNPSimple Sequence Repeat, Microsatellite EST-SSRsRestriction Fragment Length Polymorphism Random Amplified Polym

12、orphic DNA Amplified Fragment Length Polymorphism Sequence Characterized Amplified Regions Cleaved Amplified Polymorphic SequenceDerived Cleaved Amplified Polymorphic Sequence Inter-simple sequence repeatSequence-Related Amplified Polymorphism Target Region Amplified Polymorphism简写Abbreviations SNPc

13、SNP, ncSNP SSR cSSR RFLP RAPD AFLP SCAR CAPS dCAPS ISSR SRAP TRAP参考文献ReferencesLander, 1996Lopez et al., 2005Tautz, 1989Varshney et al., 2005Botstein et al., 1980Williams et al., 1990Vos et al., 1995Paran and Michelmore, 1993Konieczny and Ausubel, 1993Neff et al., 1998Zietkiewicz et al., 1994Li and

14、Quiros, 2001Hu and Vick, 20033倍(Zhuet al., 2003 。Lopez 等(2005对木薯分别利用生物信息学方法对EST 序列数据库及PCR 方法对非编码区序列在5个栽培种中进行SNP 分析，结果表明：EST 序列中509bp 一个SNP ；而在3EST 和BAC 末端序列中62bp 出现一个SNP 。Liu 等(2007通过对籼稻品种广来10096个全长cDNA 的测序并与基因组数据库粳稻的序列比对发现，由于SNP 、插入缺失等序列多态性而引起45.8%的氨基酸水平替换。由于SNP 的特点，利用它可以构建出非常精细的遗传图谱；在GenBank (www.

15、ncbi.nlm.nih.gov的SNP 数据库中，400万的水稻SNP 已被定位到水稻基因组(Lianget al., 2008 。1.2微卫星标记的生物信息学开发SSR 标记因其重现性好、可检测位点多、共显性且均匀覆盖整个基因组等优点成为育种家和遗传学家研究的有效工具。由序列信息开发SSR 主要从BAC 末端、基因间序列等非编码序列及从EST 等编码序列中开发，前者称为基因组SSR ，具有更高的多态性而在区分关系相近的基因型时更加有效；后者称为EST-SSRs ，来自转录本的特性赋予了其更高的价值：通过同源性检索可以推断其功能；可用于对自然群体和种质收集的功能多样性分析；高水平的可转移性使

16、之在比较定位和进化研究中可作为锚定标记。1.2.1EST-SSRs 的识别、频率及分布Morgante 与Olivieri 早在1993年就开发对植物EST-SSRs 进行鉴定。然而当时可利用的公共序列数据非常有限(5000kb 。在单子叶植物及双子叶植物中鉴定率分别只达到64.6kb 和21.2kb 一个EST-SSRs 。随后，EST 计划的实施产生了大量序列基于生物信息学与生物技术开发植物分子标记的研究进展The Progress of Development for Plant Molecular Markers Based on Bioinformatics and Biotechn

17、ology131分子植物育种Molecular Plant Breedingwww.molplantbreed.org推动了基因内SSRs 的识别。Varshney 等(2005估计了大麦75.2Mb 、玉米54.7Mb 、水稻43.9Mb 、黑麦3.7Mb 、高粱41.6Mb 和小麦37.5Mb 的表达区域SSR 密度，平均覆盖率为6.0kb 一个SSR 。然而，Morgante 等(2002在水稻、玉米和小麦中报道了分别为2.1kb 、1.1kb 、1.3kb 的更高的SSRs 频率。值得注意的是由于在识别SSRs 的标准上的差异导致SSRs 的频率及不同长度、不同重复单位的出现频率在不同

18、研究中差异较大。最常见的为3个核苷形成的重复(trinucleotiderepeats, TNRs ，其次是2个核苷(dinucleotiderepeats, DNRs 或4个核苷形成的重复(tetranucleotiderepeats, TTNRs 。Varshney 等(2005研究发现在禾本科作物EST 数据库中TNR 出现频率最高，为54%78%；DNR 和TTNR 则分别为17.1%40.4%和3%6%。不同重复模体的频率和分布在不同研究中均有差异：小麦中TNRs 变化为49%83%，DNRs 与TTNRs 的出现频率在不同研究中则变化不大(Kantetyet al., 2002;

19、Morgante et al., 2002 。1.2.2多态性水平由于转录区的DNA 序列保守性较强，EST-SSRs 的多态性一般低于基因组SSR 。然而最近在对猕猴桃EST-SSRs 进行发掘并定位时发现，其中93.5%具有多态性而且在种内杂交产生的群体中有分离。另外，3 非翻译区EST-SSRs 的多态生检测率高于5 非翻译区。Scott 等(2000发现来自不同区域的EST-SSRs 的其多态性有所差异，3UTR 的EST-SSRs 在栽培种间具有最高的多态性；5UTR 的EST-SSRs 在不同的种间具有最高的多态性；而编码区的EST-SSRs 在不同的属间具有最高的多态性。胥猛和李

20、火根(2008通过对6520条鹅掌楸EST 序列进行检索，在364条ESTs 中发现394个SSRs ，鹅掌楸EST-SSRs 平均密度为每8.5kb 含有1个SSR ；其中二核苷酸重复单元的SSRs 类型最多，占总数的61.9%。利用SSR-ESTs 序列共设计176对EST-SSR 引物，扩增后多态性引物占36.9%。这批EST-SSR 引物具有较高通用性，85%在中国马褂木中有扩增，54%在白玉兰中有扩增。EST-SSRs 的开发对于比较作图来讲非常重要。一个可以在不同的物种中扩增出同源位点的EST-SSRs 引物数据库对育种家和遗传学家来讲非常有用，尤其是对小而资金不足的作物更是如此，

21、因为它们位于基因编码区，具有很强的保守性。2利用分子生物学实验技术开发新的分子标记从实验室开发新的分子标记方式来讲可将其分为3类：第一种包括RAPD 、SSR 、AFLP 、SRAP 等，因其具有共同点，即不需要预知DNA 序列信息、检测位点随机性强而将其称为非特异性标记；第二种主要包括FLP 、SSR 、SCAR 、CAPS 等，其特点是预先需了解DNA 序列信息以制备探针或设计引物、检测位点特异性高，在此将其称为特异性标记，它们的开发主要从感兴趣的非特异性标记转换而来；另一种则是根据已知序列设计特异的单侧引物与另一侧用非特异性引物组合扩增，特将此类标记称为中间型标记，如TRAP 标记。2.

22、1新型非特异标记SRAP 的研究相关序列扩增多态性(sequence-relatedamplified polymorphism, SRAP 由美国加州大学Li 与Quiros 博士于2001年提出。引物设计是SRAP 分析的核心。SRAP 标记分析共有两套引物。在一组正向SRAP 引物中使用“CCGG ”序列，其目的是使之特异结合ORFs 区域中的外显子；反向引物的3 端含有核心AATT ，其目的是为了提高多态性。研究表明外显子一般处于富含GC 区域，如拟南芥2和4号染色体的全序列中，外显子CG 比例分别为46.5%和44.08%，而内含子中则为32.1%和33.08%(Linet al.,

23、 1999 。由于内含子、启动子和间隔序列在不同物种甚至不同个体间变异很大，富含AT 的区域序列通常见于启动子和内含子(Liand Quiros, 2001 ，这就使得有可能扩增出基于内含子与外显子的SRAP 多态性标记。Li 和Quiros (2001利用同一引物组合，从甘蓝类不同作物中(包括花椰菜、表花菜等 可获得多个SRAP 标记，且在不同实验中多态性条带重复性极好；同时，在花椰菜DH 植株与青花菜杂交产生的F 2群体cDNA 中检测到281个多态性SRAP 标记，构建了由cDNA-SRAP 标记组成的转录图谱。2.2新型中间型标记TRAP 的研究靶位区域扩增多态性(targetregi

24、on amplified poly-morphism, TRAP 标记由美国农业部北方作物科学实验室Hu 与Vick 于2003年提出。SRAP 使用两个任意引物；而TRAP 是使用任意引物与长度为1620个核甘酸的固定引物，任意引物与SRAP 所用的一样，为一段以富含AT 或GC 为核心、可与内含子或外显子区配对的随机序列；固定引物以公用数据库中的靶EST 序列设计而来。Hu 与Vick (2003设计了与向日葵EST 数据库中编码富含亮氨酸重复(LRR类似蛋白序列配对的固定引物，利用TRAP 标记分析，对向日葵属16个野生种及2个杂交种的遗传变异性进行评估。结果132基于生物信息学与生物技

25、术开发植物分子标记的研究进展The Progress of Development for Plant Molecular Markers Based on Bioinformatics and Biotechnology表明TRAP 标记可用于评估向日葵的遗传多样性分析，聚类结果与经典分类相一致；其中一个TRAP 引物结合到与抗病性有关的基因序列。张丽等(2008利用24对TRAP 引物对16个玉米自交系进行了遗传多样性分析, 共扩增出475条具多态性的谱带，平均多态性信息量为0.9044，平均多态性比率为84.8%。对16个自交系类群划分结果与系谱分析结果基本一致。表明TRAP 技术在遗传

26、多样性分析别和重要目的农艺性状的基因定位方面存在广泛的应用前景。3特异性分子标记的研究3.1SSR 分子标记的开发策略传统的SSR 分子标记开发需先制备基因组DNA 片段，筛选较小DNA 片段，连接载体并转化大肠杆菌，构建基因组文库。用人工合成带放射性同位素或非放射性标记的SSR 探针进行文库筛选。对阳性克隆进行测序，根据SSR 重复的侧翼序列信息设计引物。这种方法工作量大，近年来有些学者相继提出一系列高效的SSR 标记开发策略。3.1.1基于RAPD 富集SSR为避免基因组文库构建和筛选阳性克隆，Cifarelli 等(1995提出利用SSR 与随机扩增产物杂交的开发策略，并在糖用甜菜、橄榄

27、、向日葵上成功分离出SSR 。其主要程序是：先进行RAPD 扩增，琼脂糖凝胶电泳分离扩增条带。再将RAPD 扩增产物转到硝酸纤维膜上，并用地高辛标记的特异SSR 探针与扩增产物进行杂交。对阳性条带进行回收、克隆、测序。序列分析表明，两端为RAPD 引物，内部包含SSR 序列。3.1.2基于ISSR-PCR 的SSR 分离ISSR 标记是与基于RAPD 的分离策略相比，ISSR-PCR 基础上的分离方法同样避免了文库的构建与筛选，而且避免了SSR 富集的随机性，从而大大缩短了时间，降低了研究费用。Fisher 等(1996年设计5 KKVRVRV(CT63 为简并引物对基因组DNA 进行PCR

28、扩增。对简并引物多基因座PCR 产物克隆，随机选取8个克隆测序，结果表明，各SSR 相异，且序列两侧均有SSR 存在，重复数612不等。该方法的优点在于不仅可方便快捷建立SSR 富集文库，而且只需设计合成SSR 一侧引物序列，就可与原简并引物配合使用，省去了设计合成SSR 另一侧引物的费用。3.1.3建立序列标签文库获得SSR 引物序列Hayden 和Sharp (2001通过建立序列标签文库富集SSR 。该方法结合ISSR-PCR 扩增、选择性杂交、酶切、连接等技术，将从基因组中筛选捕获的多个含SSR 一侧保守序列的片段连接后克隆到质粒载体中，建成序列标签库。该序列标签库中每个克隆都含有多个

29、SSR 一侧保守序列，可用于设计SSR 引物，大大提高了工作效率。另外，还有基于引物延伸(Ostranderet al., 1992 、基于选择杂交(Karagyozovet al., 1993 等方法，这些方法各有优缺点，其相应技术原理可参考相应文献，这里不再一一赘述。相比之下，基于ISSR-PCR 扩增的富集方法所需设备简单，技术成熟，适合于多数实验室开展工作。3.2利用RFLP 和RAPD 转化为特异性的PCR 标记Causse 等(1994构建了包含800个RFLP 标记的水稻遗传连锁图。但该技术检测步骤较多，周期长，检出的多态性较少。基于PCR 技术的RAPD 分子标记多态性检出率高

30、，操作简便、快速，但对反应条件极为敏感，重演性相对较差(Welshand McClelland, 1991 。通过对基因组DNA 克隆的双向末端测序并依据末端序列设计引物，William 等(1991将RFLP 标记转换为SCAR 标记。这些引物直接以基因组DNA 为模板进行PCR 反应扩增多态性区域。如果扩增产物没有长度多态性，对PCR 片段进行限制性酶切，如果其内部序列存在酶切位点的差异，则这样可以将改标记转化为CAPS 标记。RAPD 标记快捷方便，不需预知序列信息，但较低的稳定性限制了其应用。Paran 和Michelmore (1993及Nair 等(1995;1996 通过将与抗虫

31、基因连锁的RAPD 标记转化为SCAR 标记，提高了标记的可靠性及特异性。3.3利用AFLP 标记开发特异性分子标记的策略AFLP 技术是Vos 等(1995发明的一种标记，其原理是将基因组用限制性内切酶消化后，两端连接上接头，用根据接头核苷酸序列和酶切位点特征设计的引物进行两轮PCR 扩增。它具有多态性丰富、检测效率高、重现性强、覆盖整个基因组及无需预知序列信息等优点。然而，由于AFLP 标记操作繁杂且比较昂贵，有必要将其转化为单位点、易操作的标记类型。近年来，关于将AFLP 转化为单位点易操作标记被相继报道(Shanet al., 1999; Meksem et al., 2001; Br

32、ugmans et al., 2003 ，本文综合多篇文献及个人实践体会筛选整合一套适宜普通实验室进行AFLP 转化的技术路线。3.3.1对共显性AFLP 标记的转换AFLP 标记多数情况下表现为显性，当不同材料中选择性扩增片段有长度差异时就表现为共显性。133分子植物育种Molecular Plant Breedingwww.molplantbreed.org比如当检测材料包含双亲及杂种一代时，可在凝胶上分辨出共显性AFLP 标记片段。此时只需回收目标片段并以其为模板用相应的选择性扩增引物再扩增，测序，根据两端序列设计引物，即可将把共显性AFLP 标记转化为特异性的共显性SCAR 标记。3.3.2对显性AFLP 标记的转换由酶切位点及选择性碱基的差异而产生的显性AFLP 标记则需要以下步骤将其转化：(1选择清晰可辨的多态性条带，回收并测序(Nicodand Largiader, 2003 。(2根据