阿莫西林工艺开发报告Amoxicillin.docx

1、阿莫西林工艺开发报告Amoxicillin阿莫西林工艺开发报告1. 产品开发理由阿莫西林(Amoxicillin)是葛兰素史克研制开发的半合成青霉素，作为第二代青霉素的主要品种，能抑制细菌细胞壁的合成，使之迅速变为球形而破裂溶解。由于杀菌力强，毒性小，目前作为一线抗生素在临床上广泛应用。阿莫西林的合成方法主要有化学合成法和酶法。目前大部分国家采用的是化学合成工艺。它以6-APA和羟邓盐为基本原料，经过（羟邓盐）混合酸酐反应、（6-APA）溶解反应、缩合反应、水解反应、结晶反应得到阿莫西林。该法需要用到较多的有机化学物质(如：溶剂二氯甲烷、吡啶、二甲苯胺等)，且反应条件苛刻，如需无水条件，反应温

2、度低(有的需低至-400C)，反应步骤多，产生大量的三废需处理, 对环境造成极大的污染。阿莫西林酶法合成工艺是以6-APA与D-对羟基苯甘氨酸为基本原料，经过（D-对羟基苯甘氨酸）酯化反应、缩合反应得到阿莫西林。阿莫西林酶法合成工艺，反应流程短，步骤少，反应条件温和，减少了危险化学原料的使用，生产过程中带进成品的杂质少，产品质量优越，并且生产能实现固化酶的回收和重复利用，提高了生产中能源和原材料的使用效率，减少了三废的排放，环境污染小，有利于节能环保，适合工业化生产。荷兰帝斯曼公司最早将阿莫西林的酶法合成工艺应用到工业化生产中。我公司的阿莫西林原料药是国内首个以酶法工艺生产并获得注册批件的产品

3、。阿莫西林酶法生产工艺由我公司自主研发，工艺中所用青霉素G酰基转移酶由印度FBL公司提供。经过大量的小试实验，最终确定了目前的成熟工艺。将此工艺进行了三批中试放大试验，产品质量达到预期水平。生产车间生产的三批产品进行工艺验证，表明产品的工艺稳定，质量可控，产品的稳定性好，收率高。在进行质量研究时，我们不仅和国内化学法生产的阿莫西林进行了质量对比研究，也和DMS生产的酶法阿莫西林做了质量对比研究。此外还与葛兰素史克公司生产的阿莫西林胶囊做了质量对比研究。结果表明，我公司采用酶法生产的阿莫西林，质量优于化学法生产的阿莫西林，杂质种类和数量与DMS公司酶法合成的阿莫西林基本一致，残存蛋白及杂质谱与D

4、MS公司产品相当。2产品名称通用名称：阿莫西林三水酸英文名称：Amoxicillin Trihydrate汉语拼音：a mo xi lin中文化学名称: （2S，5R，6R）-3，3-二甲基-6-（R）-（-）-2-氨基-2-（4-羟基苯基）乙酰氨基-7-氧代-4-硫杂-1-氮杂双环3.2.0庚烷-2-甲酸三水合物 英文化学名称：（2S，5R，6R）-6-(6R)-Amino(4-hydroxyphenyl) acetyl amino- 3，3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo3.2.0heptane-2- carboxylic acid trihydrat

5、eCAS登记号：61336-70-7分子式：C16H19N3O5S,3H2O分子量：419.4结构式：3专利情况阿莫西林的酶法合成工艺最先由荷兰DSM公司应用于工业化生产，产品于2002年上市。经过对相关领域的专利和可能存在的行政保护信息的检索，未发现本公司原料药产品的生产和销售存在侵犯本国国内、欧盟和美国已授权或已公开的专利和行政保护内容的风险。4物料来源：我公司所采用的酶法阿莫西林合成生产工艺所用的起始物料为6-APA和D-对羟基苯甘氨酸，其它物料还有青霉素G酰基转移酶、丙酮、氯化亚砜、甲醇、氨水、盐酸和乙二胺四乙酸二钠等。4.1起始物料：6-APA和D-对羟基苯甘氨酸。4.1.1 6-A

6、PA生产公司：联邦制药（内蒙古）有限公司。生产能力：10000吨/年生产工艺流程图： 酰化酶 甲醛 稀硫酸、破乳剂、乙酸丁酯 盐酸、乙酸丁酯、正丁醇 氨水 活性炭 取样检验 碳酸钾 4.1.2 D-对羟基苯甘氨酸生产公司：联邦制药（内蒙古）有限公司。生产能力：10000吨/年生产工艺流程图： 絮凝剂、液碱、苯海因 生物提取剂、盐酸、液碱 饮用水、液碱、硅藻土、活性炭 活性炭、硅藻土、盐酸 保险粉、晶种、盐酸、EDTA EDTA、保险粉 饮用水 保险粉、EDTA 饮用水4.2 关键物料：4.2.1 青霉素G酰基转移酶生产公司：印度FBL公司。生产工艺：利用毕赤酵母发酵和固定化技术，形成固定化的青

7、霉素G酰基转移酶。4.2.2 丙酮生产公司：燕山石油化工有限公司生产工艺：5. 物料，中间体，成品质量标准与检验方法名称5.1 物料的质量标准与检验方法物料名称检验项目质量标准检验方法6-APA外观白色或类白色结晶性粉末。目测比旋度+265 +285旋光仪检测鉴别在含量测定项下记录的色谱图中，供试品主峰的保留时间应与6-APA对照品主峰的保留时间一致。高效液相色谱法酸碱度pH值3.5 4.5pH计检测吸光度0.015紫外法水分0.50干燥失重法苯乙酸0.40%高效液相色谱法乙酸丁酯0.40%气相色谱法正丁醇0.40%气相色谱法含量测定97.0高效液相色谱法D-对羟基苯甘氨酸外观白色结晶性粉末目

8、测鉴别在含量测定项下记录的色谱图中，供试品主峰的保留时间应与对照品主峰保留时间一致。高效液相色谱法溶解度用1mol/L氨水制成5%的溶液，应为无色或淡黄色澄清液体。溶解度测定法比旋度-156.0-161.0旋光仪检测吸光值用1mol/L HCl制成浓度5%的溶液吸光值应：0.040；用1mol/L NaOH制成浓度为5%的溶液吸光值应：0.100紫外法水分0.30%干燥失重法有关物质任意单杂0.30%高效液相色谱法含量99.0%高效液相色谱法青霉素G酰基转移酶外观本品为棕色或白色球形颗粒、无臭目测活力（28、湿品）80 u/g滴定法-内酰胺酶不得检出（开环值0.5ml）滴定法含水率60%干燥失

9、重法丙酮外观无色透明液体，有特殊的辛辣气味目测鉴别在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰保留时间应与对照品主峰的保留时间一致。气相色谱法水分3.0%（进厂新鲜货标准：0.3%）卡尔费休法含量96.0%（进厂新鲜货标准：99.0 %）气相色谱法氨水外观无色透明液体，不得有不溶物目测鉴别本品接近盐酸溶液时，即发白色的浓烟目测含量（以NH3计）24.0%滴定法盐酸外观无色或浅黄色透明液体目测鉴别试品溶液，滴加硝酸银试液后，即产生白色凝乳状沉淀；分离，取沉淀，加氨试液，沉淀即溶解，再加硝酸酸化，沉淀复生成化学法溶液颜色1号黄绿色标准比色液比色法含量31.0%滴定法甲醇外观无色透明易挥发的液体，无

10、可见杂质目测鉴别在含量测定项下记录的色谱图中，供试品主峰保留时间应与对照品主峰保留时间一致。气相色谱法水分1.5% （进厂新鲜货标准：0.15%）气相色谱法含量98.5% （进厂新鲜货标准：99.5%）气相色谱法氯化亚砜外观无色至淡黄色透明有刺激性臭味的液体。目测鉴别本品的红外光吸收图谱应与对照品的图谱一致红外色谱法色度（K2CrO4）1目视比色法沸程75-80%(V/V)99.0 %蒸馏密度(20)1.630-1.650密度计5.2 中间体的质量标准与检验方法：中间体名称检验项目质量标准检验方法D-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐溶液外观无色或淡黄色溶液目测含量350 mg/ml高效液相色谱法阿莫西

11、林粗品固体含量35%离心称重阿莫西林湿粉外观白色或类白色结晶性粉末目测水分12.0% 15.0%卡尔费休法有关物质任何已知杂质1.0%任何未知杂质*0.20%总杂质3.0%高效液相色谱法阿莫西林干燥粉外观白色或类白色结晶性粉末目测水分12.0% 14.0%卡尔费休法5.3成品的质量标准和检验方法：检验项目质量标准检验方法外 观白色或类白色结晶性粉末。目测溶解性微溶于水，极微溶于乙醇(96%)，几乎不溶于脂肪油。溶于稀酸和稀碱溶液。溶解性测定法鉴 别供试品的红外光吸收图谱应与阿莫西林三水酸对照品的图谱一致。红外光谱法溶液状态浊度标准液(0.5mol/L盐酸溶液)浊度标准液(2mol/L 稀氨水)

12、澄清度检查法pH3.5 5.5pH测定法比旋度+290 +315(以无水物计)比旋度测定法有关物质任何已知杂质1.0%任何未知杂质*0.20%总杂质3.0%高效液相色谱法水分11.5%14.5%卡尔费休法硫酸盐灰分1.0%硫酸盐灰分测定法N,N-二甲基苯胺* 20ppm欧洲药典2.4.26残留溶剂甲醇 600ppm气相色谱法丙酮 800ppm气相色谱法含量以无水物计,含阿莫西林95.0%102.0%高效液相色谱法*在6-APA、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林生产中均未使用N,N-二甲基苯胺，在产品中也未测得。6. 生产工艺与合成线路图：6.1工艺概述：阿莫西林的生产工艺包括：D-对羟基苯甘氨酸的

13、酯化反应、6-APA溶解、缩合反应、阿莫西林粗品溶解、结晶、过滤洗涤、干燥，造粒、整粒和混合为阿莫西林重粉的附加工艺。6.2 化学反应方程式6.3工艺流程图 甲醇、氯化亚砜氨水、工艺用饮用水 工艺用饮用水青霉素G酰基转移酶 、氨水盐酸、EDTA-2Na 氨水 纯化水、丙酮 物料 工序 检验项目 洁净区注：带号的为关键工序 6.3生产工艺和工艺控制阐述步骤一：酯化反应物料配比：名称投料量D-对羟基苯甘氨酸 750kg甲醇 2800L氯化亚砜 400L工艺用饮用水 1800L 注：物料投料量在10%波动范围内不视为偏差。 将D-对羟基苯甘氨酸、甲醇、氯化亚砜投入酯化罐内，温度控制在55-65，搅拌

14、反应2-4小时，当反应液中D-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐的纯度 97%时反应结束。停止反应，减压浓缩直至干燥，真空度-0.06MPa，使D-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐在酯化罐内以固体析出。加入工艺用饮用水，搅拌至溶解，转入缩合工序。步骤二：6-APA溶解物料配比：名称投料量6-APA300kg工艺用饮用水2200L注：6-APA 投料量为600kg，若分两罐投料，每罐投300kg。在不锈钢溶解罐中加入6-APA与工艺用饮用水，开启搅拌，于温度12.0-22.0下，加入3M氨水调节pH为7.00-8.00，使6-APA全部溶解澄清，转入缩合罐。 步骤三：缩合反应(关键步骤)物料配比：名称投料量青霉素

15、G酰基转移酶800kg（酶活：6-APA=0.037MU0.050MU:1Kg）D-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐溶液1000升（约含D-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐450Kg）将6-APA和 D-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐的溶解液打入装有青霉素G酰基转移酶的缩合罐中，控制反应液pH值5.80-6.50，于15.0-25.0温度条件下反应2-8h（反应终点控制： 6-APA残留5mg/ml），得到阿莫西林缩合液，转入抽滤罐。青霉素G酰基转移酶在生产过程中重复使用，需在每使用20批进行酶活的检测。当酶活40u/g或每批反应时间超过8h时更换新酶。 步骤四：过滤物料配比：名称投料量纯化水5000 L控制真空度

16、-0.06Mpa, 进行抽滤，当液位下降至抽滤罐锥体界线时，向抽滤罐中加入纯化水，将阿莫西林粗品悬浮液转入溶解工序。步骤五：粗品溶解溶解罐中的料液约6500L，于16.0-22.0温度下加盐酸溶液（盐酸：纯化水=1:1），调节pH为0.80-1.50。调毕，加入乙二胺四乙酸二钠3.0-4.0Kg，搅拌反应至阿莫西林完全溶解澄清，并转入结晶工序。步骤六：结晶（关键步骤）在溶解液中加入6M氨水，调pH值5.006.20，控制温度1.0-3.0，养晶1.0-1.5小时，形成晶体。步骤七：过滤洗涤将结晶液离心分离，用纯化水洗涤两次，离心甩干，然后用丙酮洗涤两次，离心甩干，得到阿莫西林湿粉，并将滤饼粉碎

17、后一并取样检验，控制水分在12.0-15.0%。步骤八：干燥（关键步骤）所得到的阿莫西林湿粉转移至双锥干燥机中，在真空度-0.07Mpa，温度50-65条件下干燥40.5小时，得到阿莫西林干燥粉，控制水分在12.0-14.0%，得到阿莫西林900-1020KG，收率为150-170%。步骤九：细粉包装将成品包装在双层低密度聚乙烯袋（LDPE）中，净重为25.000.05Kg。最后将袋装入纸板桶中，取样进行放行检测，用塑料扎带扎紧袋口，盖上桶盖，用铁箍固定，最终用插片插紧。以下步骤为阿莫西林重粉附加工艺步骤：步骤十：造粒将阿莫西林细粉进行造粒，控制压力105Mpa。步骤十一：整粒将造粒后的阿莫西

18、林进行粉碎，粉碎后的颗粒抽入振荡筛整粒。步骤十二：混合控制产品松密度0.45g/ml-0.70g/ml，叩实密度0.65g/ml，阿莫西林重粉批量为900-1020KG，收率150-170%。步骤十三：重粉包装将成品包装在双层低密度聚乙烯袋（LDPE）中，净重为25.000.05Kg。最后将袋装入纸板桶中，取样进行放行检测，用塑料扎带扎紧袋口，盖上桶盖，用铁箍固定，最终用插片插紧。6.4关键步骤工艺参数范围的确定：关键步骤工艺参数范围制定依据缩 合反应温度：15.0-25.0反应时间：2-8hpH：5.80-6.50如果温度过高或过低，青霉素G酰基转移酶将不能发挥其活性，并且造成副产物增加。反

19、应时间短，反应未完全，时间超过8小时，产品的杂质增加。生成的阿莫西林在此pH条件下最稳定。结 晶养晶温度：1.0-3.0养晶时间：1.0-1.5hpH：5.00-6.20析晶温度对产品收率和质量影响较大。温度过低杂质会增加，温度过高收率会降低。1.0-1.5h阿莫西林结晶已完成。酶法阿莫西林中最主要影响质量的因素之一就是D-对羟基苯甘氨酸的影响，因为D-对羟基苯甘氨酸的等电点就在4.5-5.0之间，故将阿莫西林结晶的PH值提高到5.00-6.20，可以使D-对羟基苯甘氨酸在阿莫西林的晶体中无残留，减少杂质的影响，pH越高，阿莫西林越不稳定。干燥真空度：-0.07Mpa干燥温度：50-65干燥时

20、间：40.5h温度过高会使产品杂质增加，过低会使有机溶剂挥发不完全。干燥时间过短水分超标，过长杂质增加。7. 关键工艺条件选择依据于分析： 工艺的工艺验证第一阶段结果详见附件1，附件2。8. 工艺过程杂质来源分析8.1杂质来源：有机杂质起始物料：杂质A（6-APA），杂质I（D-对羟基苯甘氨酸），苯海因。中间体：D-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐副产物：杂质B，杂质D，杂质E，杂质F，杂质G，杂质J，杂质K，杂质L，青霉素钾，苯乙酸。 降解产物：杂质C，杂质H。其他杂质：N-氨基甲酰-D-对羟基苯甘氨酸。聚合物：杂质J和K无机杂质钠离子，氯离子和钙离子等。残留溶媒生产工艺中所用到的溶剂：丙酮，甲醇，

21、氯化亚砜。生产工艺的溶剂带入：苯，异丙醇。生产工艺的物料带入：乙酸丁酯，正丁醇8.2杂质分析：有机杂质起始物料苯海因：在D-对羟基苯甘氨酸合成过程中，起始物料苯海因在海因酶和水解酶的作用下，经酸、碱、高温破坏及结晶等工序已经去除，因此阿莫西林终产品中无需考察此起始物料的残留。中间体：D-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐：在缩合的过程中过量的D-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐部分分解为D-对羟基苯甘氨酸，剩余过量部分随缩合母液排掉了，因此阿莫西林终产品中无需考察此中间体的残留。副产物：青霉素钾：青霉素钾在起始物料6-APA产品有严格的控制（具体见3.2.S.2.3.1起始物料项下6-APA全检数据），5批检测

22、结果显示均未检出，因此阿莫西林终产品中无需考察此副产物的残留。苯乙酸：苯乙酸在起始物料6-APA产品有严格的控制（具体见3.2.S.2.3.1起始物料项下6-APA全检数据），5批检测结果显示均小于0.1%，同时经过缩合反应已随缩合母液排掉，因此阿莫西林终产品中无需考察此副产物的残留。 N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸：此杂质为D-对羟基苯甘氨酸合成过程中的中间转化产物，D-对羟基苯甘氨酸是通过等电点原理结晶的，此杂质与D-对羟基苯甘氨酸的溶解性不同，因此通过结晶工序可以去除掉。无机杂质钠离子，氯离子和钙离子等。通过对成品中上述离子的检测，含量在合格范围内。残留溶媒生产工艺中所用到的溶剂氯化亚

23、砜：由D-对羟基苯甘氨酸合成D-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐的过程中用到，但其后续步骤为减压浓缩，且在下步反应中用到大量的水，氯化亚砜遇水后立即分解生成盐酸和二氧化硫，因此阿莫西林终产品中无需考察此溶剂的残留。生产工艺的溶剂带入：异丙醇：经检测丙酮中异丙醇的残留量，结果显示小于500ppm，而ICH指导原则Q3C中规定异丙醇的限度为5000ppm，生产所用溶剂丙酮中的残留量小于规定限度的十分之一，因此阿莫西林终产品中无需考察此溶剂的残留。生产工艺的物料带入：乙酸丁酯：乙酸丁酯在起始物料6-APA产品有严格的控制（具体见3.2.S.2.3.1起始物料项下6-APA全检数据），5批检测结果显示均小于0

24、.1%，因此阿莫西林终产品中无需考察此溶剂的残留。发酵及酶残留杂质阿莫西林的起始物料6-APA、D-对羟基苯甘氨酸均为发酵产品，在起始物料及阿莫西林生产过程中均用到了酶，酶属于蛋白质。发酵残留的糖和蛋白质可从以下生产工艺中去除： 真空转鼓过滤器：可以去除菌丝、残留培养基、色素和聚合物蛋白质。 抽提和脱色：可以去除残留蛋白、糖、色素、无机盐。阿莫西林生产用到的青霉素G酰基转移酶，是由酶蛋白与载体以共价键的形式牢固的结合成球形，性质稳定且安全。其平均粒度为250-500m，而缩合罐底筛网的孔径为100m，因此酶不会进入缩合液，也就不会在产品中残留。为了更好的控制产品质量，我公司委托北京科宇深蓝科技

25、有限公司对阿莫西林中残糖、残蛋白进行了研究。由研究结果可知，阿莫西林样品中均未检出葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖和蛋白质，酶是蛋白质，未检测到蛋白质，也可以判断没有酶的残留。9. 各步骤溶媒清单及所属类别反应步骤所用溶媒 类 别酯化反应甲 醇二类溶剂过滤洗涤丙酮三类溶剂10. 成品分析方法 性状外观：本品应为白色或类白色结晶性粉末。溶解性：本品微溶于水，极微溶于乙醇(96%)，几乎不溶于脂肪油，溶于稀酸和稀碱溶液。鉴别供试品红外光吸收图谱应与EP阿莫西林三水酸对照品红外光图谱保持一致。溶液状态 取本品2份各1.0g，分别加10ml浓度为 0.5mol/L的盐酸溶液溶解及10ml 浓度为2mol/L

26、稀氨水溶解。溶解后立即观察，与2号浊度标准液比较，均不得更浓。溶液S取供试品0.100g，用除二氧化碳水溶解（可用超声波或稍微加热以助溶）并稀释至50.0ml。pH取溶液S照pH法（EP2.2.3）进行测定，pH值应为3.5-5.5。比旋度取溶液S照比旋度法（EP2.2.7）进行测定，以无水物计比旋度应为+2900+3150。水分 取供试品0.100g，照卡尔费休氏法（EP2.5.12）进行测定，水分应为 11.5%-14.5% 硫酸盐灰分取供试品1.0g，照硫酸盐灰分法（EP2.4.14）进行测定，硫酸盐灰分应1.0%。有关物质溶液配制pH5.0缓冲液：用稀氢氧化钠溶液调节250ml浓度为

27、0.2mol/L磷酸二氢钾溶液pH值至5.0，并用水稀释至1000ml。流动相流动相A：乙睛-pH5.0缓冲液（1:99 V/V）。流动相B：乙睛-pH5.0缓冲液（20:80 V/V）。对照溶液对照液（a）：取阿莫西林EP对照品约30.0mg，精密称定，置50ml量瓶中，用流动相A溶解并稀释至刻度。对照液（b）：在流动相A中溶解4.0mg的头孢羟氨苄对照品并用流动相A稀释至50ml，取该溶液5.0ml，加5.0ml的对照液（a），用流动相A稀释至100ml。对照液（c）：量取2.0ml的对照液（a），用流动相A稀释到20.0ml，再取5.0ml此溶液用流动相A稀释至20.0ml。供试溶液供试

28、液（a）：取供试品约30.0mg，精密称定，置50.0ml容量瓶中，用流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀。供试液（b）：取供试品约30.0mg，精密称定，置20.0ml量瓶中，用流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，在使用之前配制。色谱条件色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱 4.6*250mm 5m流速：1.0ml/min进样量：50l检测波长：254nm洗脱方式：按下表进行梯度洗脱时间（分钟）流动相A（%）流动相B（%）0 tR928tR ( tR + 25)9208100( tR + 25) ( tR + 40)0100(tR + 40) ( tR + 55)928tR=用对照液（c）测得的阿莫西林保留时间系统适用性采用溶液：对照液（b）系统适用性要求：分离度：2.0。测定方法取对照液（b）和（c）50l注入液相色谱仪，用选好的流动相初始比例进行等度洗脱。取供试液（b）50l注入液相色谱仪，按照上表的洗脱方式进行洗脱。取流动相A注入液相色谱仪，按照上表的洗脱方式进行洗脱作为空白。记录色谱