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1、四川大学生物技术综合试验报告学生版精品文档 生物技术综合实验 甘薯-谷氨酰半胱氨酸合成酶(-GCS)基因的克隆和原核表达 学生： 学号： 同实验者： 谷胱甘肽(glutathione, GSH) GSH具有多种重要生理功能, 抗自由基和抗氧化应激作用, 保护细胞膜的完整性等。-GCS是植物细胞中GSH生物合成的限速酶, 可以调控GSH的生物合成量。GSH在生物体抵御冷害、干旱、重金属、真菌等胁迫过程中起着重要作用, 说明-GCS也与植物抗逆过程密切相关。 实验一 甘薯叶片RNA提取 一、实验目的 1. 了解真核生物RNA提取的原理； 2. 掌握Trizol提取的方法和步骤。 二、实验原理 Tr

2、izol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8羟基喹啉、异硫氰酸胍、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。-巯基乙

3、醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。用这种方法得到的总 RNA中蛋白质和DNA污染很少。 . 精品文档 三、实验材料 1. 材料 甘薯（Ipomoea batatas Lam）叶片，品种为徐薯18 2. 试剂 无RNA酶灭菌水：加入0.01%的DEPC，处理过夜后高压灭菌； Trizol试剂； 氯仿； 异丙醇、75乙醇； TBE缓冲液； 上样缓冲液（6） 3. 仪器 高压灭菌锅、微量移液器、台式离心机、超净工作台、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、1.5mL塑料离心管、枪头和EP管架 四、实验方法 1. 将叶片取出

4、放入研钵中，加入适量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100 mg植物叶片加入1 mL Trizol试剂，室温放置5 min，使样品充分裂解； 2. 每1 mL Trizol试剂加入200 L氯仿，用手剧烈振荡混匀后室温放置3-5 min使其自然分相； 3. 4 12,000 rpm 离心15 min，吸取上层水相转移到新管中；在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置15 min； 4. 4 12,000 rpm 离心10 min，弃上清，RNA沉淀于管底； 5. RNA沉淀中加入1 mL 75%的乙醇（用RNase-free水配制），温和震荡离心管，悬浮沉淀； 4 8,000 rpm离心2 mi

5、n，弃上清； 6. 室温放置10 min晾干沉淀； 7. 沉淀中加入20L RNase-free ddH2O，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70保存； 8. 用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，用EB染色并照相。 . 精品文档 五、实验结果 1. RNA提取结果 依照Trizol 试剂盒方法，提出的RNA较少，此部分未以图或数据显示。 2. RNA后电泳结果 如图1. 其中9a为本组实验结果。由图可知RNA条带非常模糊，拖尾现象严重，几乎无法分清具体条带，亮度较大。点样孔附近的红色部分为杂质，在提取过程中并未很好除去。 图1. RNA提取跑胶结果。其中1泳道为样品Marker，9a泳道为本小组RN

6、A样品。与 标准对照可见条带模糊，拖尾现象严重。 六、分析与讨论 1. RNA的提取 产量并不多，可能是因裂解样品不充分或RNA沉淀未完全溶解所致。在实验过程中，由于对操作时间的掌握不熟练、操作技巧不完善，留上清与弃上清时令RNA损失了部分，使最终RNA产量不理想。 2. RNA电泳结果 有EB存在时，电泳后28S rRNA和18S rRNA在紫外灯下应看得很清楚，. 精品文档 另出现条由tRNA，5.8S rRNA和5S rRNA组成的较模糊、迁移较快的带。如果RNA没有降解，则28S rRNA的亮度应为18S rRNA的2倍，且这两条带都无弥散现象发生。由图1. 9a可知，RNA拖尾现象严

7、重，说明RNA已大部分被降解；此外点样孔附近出现红色部分杂质，分析可能有并未除尽的蛋白质，同样影响RNA电泳结果。 在进行实验时，本小组成员未严格戴上口罩并勤换手套，这可能使外源RNAase进入样品，导致其降解严重。另外，提取出RNA后本小组未立即将样品放入-70保存，也为导致结果不理想的重要原因之一。在最初用氯仿萃取分层的过程中，由于水相吸取过多，掺杂入部分蛋白质杂质而未于后续纯化步骤除尽，RNA条带拖尾严重可能还受该蛋白质影响。 七、总结： 本次试验RNA提取非常失败，从跑胶结果可见其降解严重。虽然大实验无法避免试剂交叉污染的可能性，且电泳用胶的质量也会影响实验结果，但从图1. 2a，3a

8、，2b等条带较为清晰的小组实验结果可知，琼脂糖凝胶质量以及试剂对结果干扰不大。那么本小组成员在提取过程中的操作一定出现了很大失误。首先口罩、手套应该严格按规定佩戴，提取过程对移液枪等仪器使用需谨慎仔细，尽量避免混入杂质。其次为排除部分杂质影响可对RNA样品用紫外线分光光度计测定吸光值检验，将有助于结果分析。最后，细节决定成败，我们应汲取教训避免接下来的实验出现类似问题。 实验二 第1链cDNA的合成和模板的验证 一、实验目的 1. 掌握第1链cDNA的合成方法和步骤 二、实验原理 真核生物基因多为断裂基因，编码区不连续，需经转录后加工才能成为成熟mRNA。以真核成熟mRNA为模板合成cDNA，

9、进而获得有连续氨基酸编码的DNA序列，无需转录后加工，即可在原核细胞中表达。 . 精品文档 真核生物的mRNA都有PolyA尾巴。引物：Oligo dT（12-18个T）。莫洛尼氏鼠白血病毒逆转录酶（M-MLV ）以单链RNA为模板，在引物的引发下合成与模板互补的DNA链（cDNA）。 mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增称为RT-PCR，RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。 三、实验材料 1. 材料 徐薯18叶片RNA样品 2. 试剂 dNTP mixture（10 mM each）； O

10、ligo (dT) Primer (10 M)； Total RNA； RNase free ddH2O； M-MLV 反转录酶； 5First-strand Buffer； 0.1 M DTT； Ribonuclease Inhibitor (40 U/L) 3. 仪器 10L 和100L 的移液枪、0.5mL的EP管、PCR仪等 四、实验方法 1. 在RNase free Microtube 管中配制下列混合液： dNTP mixture（10 mM each） 1 L *Oligo (dT) Primer (10 M) 4 L . 精品文档 Total RNA 2 L RNase fre

11、e ddHO up to 12 L 22. 将混合物65 C加热5 min，迅速在冰上冷却2 min，快速离心，然后加入下列成分： 5First-strand Buffer 4 L 0.1 M DTT 2 L Ribonuclease Inhibitor (40 U/L) 1 L 3. 将混合物轻轻混匀，37温浴2 min； 4. 加入M-MLV反转录酶（200U/L）1 L，用枪头轻轻吹打混匀； 5. 37温浴50 min； 6. 70 加热15 min，使反转录酶失活，所得反转录产物可直接用于PCR反应。 附 反转录模板的看家基因的验证（-actin） 引物 size sequences

12、primers 5-TTCCCCGGTATTGCGGATAGAATG-3 IbActinF 198bp IbActinR 5-CGGACCGGACT CATCATACTCTG -3 PCR。-actin-R为引物，使用Taq酶进行为模板，以第一链cDNA-actin-F和 反应体系（25L体系）表 1 -actin PCR 50 ng) 1L(约DNA模板 2.5L (Mg2+ plus) 缓冲液PCR10 2.5LMg2+ 10 mol/L TPS -F 1 L 10 mol/L TPS -R 1L 2.5L 2.5 mmol/L dNTP L 0.2 Taq 酶 15.3 L 灭菌去离子水

13、 25 L 合计 . 精品文档 反应条件 * PCR 2min 94 95 30sec 30个循环 62 30sec 6830sec 最后，1%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增产物。 五、实验结果 1. -actin验证 如图1. 其中编号1为Marker，3为本小组RNA样品-actin验证结果。由图可知，使用RNA模板通过RT-PCR得到了长度为198bp类似条带，但因产物浓度较低，该条带不甚清晰，并有部分弥散现象发生。 图1. -actin验证电泳结果。其中编号1为Marker，编号3为本小组RNA样品经RT-PCR-actin产物。 IbActinR后扩增出的在加入引物IbActinF 、 六

14、、分析与讨论 1. RNA提取 因实验一本小组RNA提取失败，故此实验采用老师准备的RNA进行验证。 2. -actin验证结果 如图1. 第3组为本小组验证结果。其中-actin能被cDNA模板扩增出，但条带模糊并有拖尾现象出现。首先，因所得产物量较少，故电泳条带模糊，推测可能是在进行RT-PCR前，RNA有部分降解或于操作过程中损失部分所致。其. 精品文档 次，本实验在对-actin产物进行电泳后结果出现拖带，可能原因主要有：1）cDNA第一链产物的含量过高；2）DNase降解DNA产生的寡核苷酸有非特异性扩增；3）PCR反应中引物过多；4）循环次数过多；5）退火温度过低；6）Taq酶过多

15、；7）Mg2+浓度不合适。综合本次试验分析，因实验条件已预先经过尝试，故导致拖带的最可能因素应为cDNA降解产生了寡核苷酸非特异性扩增片段。由于照片清晰度欠佳，非特异性扩增片段无法清晰显示，但若与图2. 进行对比则可发现第2组-actin验证图出现了非特异性扩增片段。 可见清晰的两条带。62、验证图。其中1为Marker，编号2. 图第2组-actin 若要进行改进，则需尽量提取高质量RNA，防止其被DNA污染。另外进一步优化PCR反应条件也是必不可少的环节，提高退火温度可防止非特异性起始与延伸。 七、总结 本次实验虽只进行了模板验证，但让我们理解了RT-PCR的原理与其在真核生物基因克隆方面

16、的运用。 整个过程中本小组成员较严格按照操作规范进行，所得-actin产物验证也较成功。今后实验需更加注意细节，不断完善自己的操作技巧，积累经验。 实验三 甘薯-谷氨酰半胱氨酸合成酶(-GCS)基因克隆 一、实验目的 1. 掌握PCR的方法和步骤。 二、实验原理 聚合酶链反应(PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特. 精品文档 异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍。其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的变性：模板DNA经加热至一定

17、温度后，使模板DNA双链解离，成为单链，与引物结合，为以下的反应作准备； 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 引物的延伸：DNA模板-引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2-4分钟，2-3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 三、实验材料 1. 材料 反转录产物DNA样品

18、 2. 试剂 dNTP mixture（10 mM each）； 第一cDNA ； -actin的引物 （IbActinF和IbActinR ）； -GCS的引物 （-GCS-F 和-GCS-R ）； 10PCR缓冲液(Mg2+ plus) ； Taq酶； 3. 仪器 PCR仪、2.5L、10L 和100L 的移液枪、0.5mL的EP管、电泳仪。 四、实验方法 1. 扩增甘薯-GCS基因的引物 . 精品文档Size primers sequences :5-CGGGATCCATGGCGTTGATGTCCCAATCTG-3 -F -GCS酶切位斜体BamHI1575bpCCGCTCGATCAAT

19、AGAGCAGCTCCTCAAATAC-3:5 -R-GCXHOI酶切位斜体： 甘薯PCR扩增-GCS基因的2. 25L体系）扩增体系（表2）（2.1 甘薯-GCS基因的PCR ；为引物，使用Taq酶高保真酶进行PCRcDNA 以第一链为模板， F和R PCR 反应体系-GCS 表2 50 ng) 约1L(DNA模板2+2.5L plus) PCR缓冲液(Mg102+2.5LMg 1 L 10 mol/L -GCS -F 1L 10 mol/L -GCS -R 2.5L 2.5 mmol/L dNTP 0.5 L 酶Taq14 L 灭菌去离子水25 L 合计 反应条件2.2. PCR4min

20、94 40sec 94 35 65 30sec 个循环 2min 72 琼脂糖凝胶上电泳检测扩增产物，并进行胶回收纯化；1% -GCS甘薯3. 基因产物胶回收按照胶回收试剂盒的说明书进行：PCR后，溴乙锭（或者）将1PCR琼脂糖凝胶中电泳，1%产物在5V/cm电泳1 h. 精品文档 Goldview）染色，在紫外灯下切下2500 bp左右大小片段的凝胶； 2）称凝胶重量，按1 g/mL体系加Binding buffer，在55C水浴中孵5 min，直到凝胶完全溶解； 3）将凝胶溶液到DNA spin-column中，室温放置 2min，1,2000 rpm离心1 min，弃废液； 4）用700

21、 L washing buffer洗涤柱子，1,2000 rpm离心1 min； 5）弃废液后再1,2000 rpm离心2min，以除去残存的washing buffer； 6）把column放到另一干净的1.5 mL离心管，加50L elution buffer，室温放置2 min后，1,2000 rpm离心1 min以洗脱DNA； 4. pET-32a质粒的BamHI和 XHOI双酶切 酶切体系（10L体系）： buffer (BamHI) 1 L BamHI 0.3L XhoI 0.6L 质粒 8.1L 酶切反应：37水浴中孵化1h； 5.甘薯-GCS合成酶基因胶回收产物的BamHI和

22、XHOI双酶切 酶切体系（10L体系）： buffer (BamHI) 1 L BamHI 0.3L XhoI 0.6L PCR胶回收产物 8.1L 酶切反应：37水浴中孵化 1h。 五、实验结果 1. 甘薯-GCS基因PCR电泳图 如图1. 其中1为Marker（最大片段2kb），4a为本小组甘薯-GCS基因PCR扩增产物。由图可知该组各条带均较明亮清晰，模板经引物R、F扩增后得大小在1575bp左右的目标产物，即约1.5kb，跟Marker对比并进行了标注（图. 精品文档。另图中除标注部分以外还出现多余条带，但因后续实验采取割胶回1. 红色框） -GCS基因片段，故其余片段不会对实验结果造

23、成影响。收方式获得 左右基因1.5kb-GCS 基因电-GCS4a为本小组电泳图。其中编号1为Marker，PCR甘薯图1. -GCS基因 左右。所在条带位置，大小在1.5kb-GCS泳结果。红框已圈出 六、分析与讨论 PCR电泳结果甘薯1. -GCS基因该产物条带比较明亮，较为成功。基因PCR-GCS1. 4a由图可知，本次甘薯模板存在小部边缘整齐，但除目的条带外仍扩增出了不少多余条带，说明DNA而操作污染以及机械剪切力损伤样品，分降解。实验过程中应尽量避免DNAase经分析电泳结果出现非目的基因小片段可能是加样时间过时更应注意加样时间， 长引起的。，以使另外，本实验在电泳时还可设计阴性对照

24、（灭菌去离子水、缓冲液）. 精品文档 结果更加完善。 2. 胶回收与双酶切 由于严格按照实验步骤进行，胶回收与双酶切均完成较好。此处未以数据、图片表示。 七、总结 本次实验包括PCR -GCS基因片段（目的基因）并作电泳检测、胶回收纯化目的基因以及BamHI、XhoI双酶切质粒与目的基因三个步骤。由实验结果可知目的基因扩增较为成功，虽有多余杂质出现但条带仍然清晰、整齐。胶回收时，溶液放置2min是为使buffer与产物溶液混合均匀并稳定以减少杂质影响，最后双酶切的孵化时间与温度是关键，故于操作过程中我们应注重细节，多体会才能理解、掌握成功要领。 实验四 原核表达质粒构建 一、实验目的 1. 掌

25、握连接和转化步骤。 二、实验原理 DNA体外连接即在一定条件下，由DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻5端磷酸、3端羟基间形成磷酸二酯键的过程，DNA分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。连接反应成功与否，最后的检测要转化宿主菌、阳性克隆的筛选来确定。质粒转化不同细菌有不同的转化效率，转化效率的高低与实验的成败直接相关，通常转化效率可达105-107转化子/g DNA，获得高转化效率的关键是感受态细菌的制备。 体外通过基因工程手段所构建含目的基因的重组质粒，通过转化和筛选技术，可获得含重组子的阳性克隆。在此阳性克隆中，DNA可在生物体系内大量扩增、繁殖、保存及表达目的基因产物

26、，这是PCR体外扩增DNA所不能替代的。配合DNA重组技术所获得的阳性菌株已广泛应用于科研，医药生产和生物发酵等领域。 . 精品文档 三、实验材料 1. 材料 甘薯-GCS基因酶切片段、载体片段 2. 试剂 10T4 DNA ligase buffer； T4 DNA ligase； ddH2O； SOC培养液； buffer BamHI； DMSO； TFB溶液(100 mmol/L KCl, 45 mmol/L MnCl，10 mmol/L CaCl,10 mmol/L 22K-MES pH6.2)； -巯基乙醇； 3. 仪器： 10L 和200L 移液枪、1.5mL的EP管、离心机、培养

27、皿、电泳仪、37 培养箱、4 冷藏室 四、实验方法 1. 甘薯-GCS基因酶切产物与pET-32a酶切产物的连接 连接体系（10L体系）： 10T4 DNA ligase buffer 1L 载体片段 4L 3L PCR酶切片段 T4 DNA ligase 0.5L 1.5L ddH2O 连接条件：16连接过夜； 2. 大肠杆菌感受态细胞的制备 1）接种JM109于2 mL SOB培养基中，37振荡培养过夜； . 精品文档 2） 取0.5 mL菌液转种于50 mL SOB培养基中，37振荡培养2-2.5 h (OD550值约为0.4-0.5)后，冰浴10 min，4, 000 r/min离心5

28、 min，弃上清液； 3）加入17mL预冷的TFB溶液(100 mmol/L KCl, 45 mmol/L MnCl，10 mmol/L 2CaCl,10 mmol/L K-MES pH6.2)洗涤菌体1次，离心收集菌体； 24） 加入4 mL TFB制成悬液，冰浴10 min，加入140L二甲基亚砜(DMSO)，冰浴上轻轻转动10 min，加入140 L -巯基乙醇，于冰浴上轻轻转动10 min，再加入140 L DMSO，轻轻混匀后在冰浴上静置5 min，即得感受态细胞； 3. 连接产物的转化 1）在预冷的EP管中加入1-10 L质粒DNA，加入200 L上述感受态细胞，混匀后在冰浴上静置

29、30 min； 2）42水浴热冲击30 s，冰浴上放置10 min，加入0.8 mL SOC培养液。置于37 振荡培养1 h； 3）取0.1 mL涂布于加有抗生素的LB培养基平板上，37 培养过夜。若转化子很少，特别是连接DNA的转化，可将转化细胞离心3 min (4,000 r/min)，弃上清液，把所有的菌体涂布在含相应抗生素的平板上； 4）正放于37培养箱内约1h使接种物完全被吸收，然后将平板倒置于37培养箱中培养，1216h后，将平板移入4(冰箱冷藏室)放置数小时； TM Plasmid Mini Kit I）方法进行提取质粒的小量提取：采用试剂盒（E.Z.N.A. 4. 4.1 实验

30、前准备： 1）使用前，将RNase A全部加入Solution I中并于4度保存； 2）按下表用无水乙醇稀释DNA Wash Buffer，并于室温保存； D6942-00, 3：加入ml无水乙醇 D6942-01,D6943-01：加入80ml无水乙醇 D6842-02,D6943-02：每瓶中加入80ml无水乙醇 4.2 离心操作方案： 1）将带有质粒的E.coli 接种于5ml LB/抗生素培养液中，37C搖床培养1216 h； 2）取1.05.0ml的菌液，室温下10,000xg离心1min收集细菌； 3）倒弃培养基。加入250ul Solution I/RNaseA混和液，漩涡振荡使细胞完全悬浮； 4）往重悬混和液中加入250ul Solution II，轻轻颠倒混匀4-6 次。此操作避免剧. 精品文档 烈混匀