植物组织培养的培养基主要成份.docx

1、植物组织培养的培养基主要成份植物组织培养培养基的主要成分 1.无机营养物无机营养物主要由大量元素和微量元素两部分组成大量元素主要包括氮、磷、钾、钙、镁和硫六种氮源通常有硝态氮或铵态氮但在培养基中用硝态氮的较多也有将硝态氮和铵态氮混合使用的。磷和硫则常用磷酸盐和硫酸盐来提供。钾是培养基中主要的阳离子在近代的培养基中其数量有逐渐提高的趋势。而钙、钠、镁的需要则较少。培养基所需的钠和氯化物由钙盐、磷酸盐或微量营养物提供。微量元素包括碘、锰、锌、钼、铜、钴和铁 这些元素有的对生命活动的某个过程十分有用有的对蛋白质或酶的生物活性十分重要有的是参与某些生物过程的调节。培养基中的铁离子大多以螯合铁的形式存在

2、即FeSO4与Na2EDTA螯合剂的混合。 2.碳源培养的植物组织或细胞它们的光合作用较弱。因此需要在培养基中附加一些碳水化合物以供需要。培养基中的碳水化合物通常是蔗糖或D-葡萄糖用量通常为2-4高者可达5亦可用市售的白糖所代替但一般应增加用量而且最好用比较固定的厂家生产的产品以保证实验的稳定性。 3.有机营养成分包括人工合成或天然的有机附加物包括维生素氨基酸及其它有机物质等。最常用的有酪朊水解物水解乳蛋白、水解酪蛋白CH、酵母提取物、玉米胚乳、麦芽浸出物、西红柿汁、椰子汁CM及各种氨基酸如甘氨酸氨基乙酸等。维生素在培养基中加入维生素常有利于外植体的发育。培养基中的维生素属于B族维生素其中效果

3、最佳的有硫氨素维生素B1、盐酸吡哆醇维生素B6和维生素H生物素、泛酸钙等、肌醇环己六醇、烟酸。在部分培养基中还添加维生素BX氨酰苯甲酸、维生素C抗坏血酸、维生素E生育酚、维生素B12氰钴胺酸、维生素BC叶酸、维生素B2核黄素和氯化胆碱等维生素。这些可能对某些植物或植物的某些代谢过程有重要作用如肌醇主要以磷酸肌醇和磷脂酰肌醇的形式参与由Ca介导的信号转导。 4.生长调节物质常称为激素 常用的生长调节物质大致包括以下三类 1植物生长素类。主要作用是诱导愈伤组织的产生促进细胞脱分化促进细胞的伸长促进生根。如吲哚乙酸IAA、萘乙酸NAA、IBA吲哚丁酸、NOA萘氧乙酸P-CPA对氯苯氧乙酸、24-D2

4、4-二氯苯氧乙酸245-T245-三氯苯氧乙酸和ABT生根粉等。生长素的使用浓度通常为0.110mg/L。 2细胞分裂素。如玉米素Zt6-4-羟基-3-甲基-反式-2-丁烯氨基嘌呤、6-苄基嘌呤6-BA或BAP和激动素Kt6-呋喃氨基嘌呤、2IP异戊烯氨基嘌呤和TDZthidiazuron噻二唑苯基脲等。作用主要是第一促进细胞分裂和扩大与生长素促进细胞伸长的作用不同可使茎增粗而抑制茎伸长第二诱导芽的分化促进侧芽萌发生长第三抑制衰老减少叶绿素的分解。延缓离体组织或器官的衰老过程有保鲜的效果。但是细胞分裂素对根的生长一般起抑制作用。在组培中细胞分裂素的使用浓度通常为0.110mgL。细胞分裂素常常

5、与生长素相互配合用以调节细胞分裂细胞伸长细胞分化和器官形成。 3赤霉素。组织培养中使用的赤霉素只有一种即赤霉酸GA3。虽然已经用于顶端分生组织的培养和维管分化的研究但在培养基中很少添加因为它的作用往往是负面的。乙烯等。 5.琼脂或其他支持物 除液体悬浮培养外就目前情况而言琼脂是一种极为理想的支持物。一般浓度0.4-1质量越差的琼脂用量越大。琼脂作为培养基的支持物使培养基呈固体状态以利于各种外植体的培养。 6.其他添加剂含天然提取物、抗生素等 活性炭 渗透调节剂 抗生素 抗氧化剂等。 活性炭加入培养基中的目的主要是利用其吸附能力减少一些有害物质的影响例如防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。这在兰

6、花组织培养中效果更明显。另外活性炭使培养基变黑有利于某些植物生根。但活性炭对物质吸附无选择性既吸附有害物质也吸附有利物质因此使用时应慎重考虑不能过量一般用量为15。活性炭对形态发生和器官形成有良好的效应。在失去胚状体发生能力的胡萝卜悬浮培养细胞中加入1一4活性炭可使胚状体的发生能力得以恢复。 7.水 水是植物原生质体的组成成分也是一切代谢过程的介质和溶媒。配制培养基母液时要用蒸馏水以保持母液及培养基成分的精确性防止储藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水以防成分的变化引起不良效果。 8.pH 培养基的pH因培养材料不同而异大多数植物都要求在pH5.65.8的条件下进

7、行组织培养。常用0.1mol/L的Na0H和0.1mol/L的HCl来调节培养基的PH。但需注意两点第一经高温高压灭菌后培养基的PH会下降0.20.8故调整后的PH应高于目标pH0.5个单位第二pH的大小会影响琼脂的凝固能力一般当pH大于6.0时培养基将会变硬低于5.0时琼脂就不能很好地凝固。 培养基种类根据培养基态相不同分为固体培养基与液体培养基。固体培养基是指加凝固剂多为琼脂的培养基其优点是外植体只是部分接触培养基因此会使培养基中的效应物质产生一定的浓度梯度从而有利于外植体的分化、生长。液体培养基是指不加凝固剂的培养基。外植体在液体培养基中能够与效应物质更好地接触因此生长速度比在固体培养基

8、中更快。根据培养物的培养过程培养基分为初代培养基与继代培养基。初代培养基是指用来第一次接种外植体的培养基。继代培养基是指用来接种继初代培养之后的培养物的培养基。根据其作用不同培养基分为诱导培养基、增殖培养基和生根培养基。根据其营养水平不同培养基分为基本培养基和完全培养基。基本培养基就是通常称呼的培养基主要有MS、White、B5、N6、改良MS、Heller、Nitsh、Miller、SH等。完全培养基就是在基本培养基的基础上根据试验的不同需要附加一些物质如植物生长调节物质和其他复杂有机附加物等。 组织培养培养基配制选择合适的培养基是植物组织培养成功的基础。选择合适的培养基主要从以下两个方面考

9、虑一是基本培养基二是各种激素的浓度及相对比例。MS培养基适合于大多数双子叶植物B5和N6培养基适合与许多单子叶植物特别是N6培养基对禾本科植物小麦、水稻等很有效White培养基适合于根的培养。 根据配方要求用量筒或移液管从每种母液中分别取出所需的用量放入同一烧杯中并用粗天平称取蔗糖、琼脂放在一边备用。 将中称好的琼脂加蒸馏水300400毫升加热并不断搅拌直至煮沸溶解呈透明状再停止加热。 将中所取的各种物质包括蔗糖加入煮好的琼脂中再加水至1000毫升搅拌均匀配成培养基。 用1N的氢氧化钠或盐酸滴入中的培养基里每次只滴几滴滴后搅拌均匀并用pH试纸测其pH值直到将培养基的pH值调到5.8。 将配好的

10、培养基用漏斗分装到三角瓶或试管中并用棉塞塞紧瓶口瓶壁写上号码。瓶中培养基的量约为容量的1/4或1/5。 培养基的成分比较复杂为避免配制时忙乱而将一些成分漏掉可以准备一份配制培养基的成分单将培养基的全部成分和用量填写清楚。配制时按表列内容顺序按项按量称取就不会出现差错。 组织培养培养基的灭菌与保存 培养基配制完毕后应立即灭菌。培养基通常应在高压蒸汽灭菌锅内在汽相120条件下灭菌20分钟。如果没有高压蒸汽灭菌锅也可采用间歇灭菌法进行灭菌即将培养基煮沸10分钟24小时后再煮沸20分钟如此连续灭菌三次即可达到完全灭菌的目的。 经过灭菌的培养基应置于10下保存特别是含有生长调节物质的培养基在45低温下保

11、存要更好些。含吲哚乙酸或赤霉素的培养基要在配制后的一周内使用完其它培养基最多也不应超过一个月。在多数情况下应在消毒后两周内用完。 组织培养中几种常用培养基的配方 化合物 MS 1962 White 1943 N6 1974 B5 1968 Heller 1953 Nitsh 1972 Miller 1967 SH 1972 NH4NO3 1650 1000 KNO3 1900 80 2830 2527.5 1000 2500 NH42SO4 463 134 NaNO3 600 KCl 65 750 65 CaCl2.2H2O 440 166 150 75 166 200 CaNO32.4H2O

12、 300 347 MgSO4.7H2O 370 720 185 246.5 250 185 35 400 Na2SO4 200 KH2 PO4 170 400 68 300 K2H PO4 300 FeSO4.7H2O 27.8 27.8 27.85 15 Na2.EDTA 37.3 37.3 37.75 20 Na-Fe-EDTA 28 FeCl3.6H2O FeSO4 3 2.5 MnSO4.4H2O 22.3 7 4.4 10 0.01 25 4.4 ZnSO4.7H2O 8.6 3 1.5 2 1 10 1.5 Zn螯合物 0.03 10 NiCl2.6H2O 1.0 CoCl2.6H

13、2O 0.025 CuSO4.5H2O 0.025 AlCl3 MoO3 Na2MoO4.2H2O 0.25 TiO2 1.0 KI 0.83 0.75 0.8 0.75 0.01 10 1.6 5.0 H3BO3 6.2 1.5 1.6 3 1 NaH2 PO4. H2O 16.5 150 125 烟酸 0.5 0.5 0.5 1 5.0 盐酸吡哆素VB6 0.5 0.1 0.5 1 1.0 5.0 盐酸硫胺素VB1 0.1 0.1 1 10 0.5 肌醇 100 100 100 100 甘氨酸 2 3 2 培养基配方 B5培养基Gamborg 等1968 1无机物 NaH2PO4H2O 1

14、50 mg/LKNO3 3000 mg/LNH42SO4 134mgLMgSO47H2O 500 mg/LNa2一EDTA 37.3 mg/LFeSO47H2O 27.8 mg/LMnSO4H2O 10 mg/LZnSO47H2O 2mg/LH3BO3 3mg/L Na2MoO2H2O 0.25 m g/LCuSO45H2O 0.025 mg/LCoCl26H20 0.025 mg/LKI 10 mg/L。2有机物 维生素B1 10mg/L维生素B6 1 mg/L甘氨酸 2.0 mg/L叶酸 0.5 mg/L肌醇 100.0mgL蔗糖 50 gLpH 5.5。B5培养基是1968年由Gambo

15、rg等设计的。它的主要特点是含有较低的铵盐较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。铵盐可能对不少培养物的生长有抑制作用但它适合于有些植物如双子叶植物特别是木本植物的生长。 HB培养基 Holley Baker1963 1无机盐以1/2浓度的Knop液为基础 CaNO32.4H2O 1000mg/LKNO3 125 mg/LMgSO47H2O 125mg/LKH2PO4 125 mg/LBerthelots液 0.5ml/L。Berthelots液成分组成:MnSO44H2O 20g/LKI 0.5g/LNiCl26H20 0.05 g/LCoCl26H20 0.05g/LZnSO47H20 0.10 g/L

16、CuSO45H2O 0.05g/LBeSO44H2O 0.10 g/LH3BO3 0.05g/L浓硫酸 1ml。2有机物 维生素B1理学 1 mg/L腺嘌呤 8 mg/LNAA 2 mg/L蔗糖 40gL 。 H培养基 1无机盐 KNO3 950 mg/LNH4N03 720mgLMgSO47H2O 185 mg/LCaCl22H2O 166 mg/LKH2PO4 68 mg/LNa2一EDTA 37.3 mg/LFeSO47H2O 27.8 mg/LMnSO44H2O 25 mg/LZnSO47H2O 10mg/LH3BO3 10mg/L Na2MoO2H2O 0.25 m g/LCuSO4

17、5H2O 0.025 mg/L2有机物 维生素B1 0.5mg/L维生素B6 0.5 mg/L甘氨酸 2.0 mg/L叶酸 0.5 mg/L肌醇 100.0mgL烟酸 0.5 mg/L生物素 0.05 mg/L蔗糖 20 gLpH 5.5。 Kassanis 培养基1957 1无机盐 CaNO32.4H2O 500mg/LKNO3 125 mg/LMgSO47H2O 125mg/LKH2PO4 125 mg/LBerthelots液 10滴。2有机物 酪蛋白 1 mg/L半胱氨酸 10 mg/L腺嘌呤 5 mg/L烟酸 1 mg/L维生素B6 1 mg/L泛酸钙 10 mg/L肌醇 0.1 m

18、g/L维生素H生物素 0.01 mg/L蔗糖 20 gL。 KC培养基 Knudson C1964 1无机盐 KH2PO4 250 mg/LCaNO32.4H2O 1000mg/LNH42SO4 500mg/LMgSO47H2O 250 mg/LFeSO47H2O 25 mg/LMnSO44H2O 7.5 mg/L2有机物 蔗糖 20gL pH 5.05.2 。 LS培养基RM-64Linsmair SKoog19641无机盐 NH4N03 l 650mgLKNO3 1900 mg/LCaCl22H2O 440 mg/LMgSO47H2O 370 mg/LKH2PO4 170 mg/LNa2-

19、EDTA 37.3 mg/LFeSO47H2O 27.8 mg/LH3BO3 6.2 mg/L MnSO44H2O 22.3 mg/LZnSO47H2O 8.6 mg/LKI 0.83 mg/LNa2MoO2H2O 0.25 mg/LCuSO45H2O 0.025 mg/LCoCl26H2O 0.025 mg/L。2有机物 维生素Bl 0.4 mg/L肌醇 10.0mgL蔗糖 30gLpH 5.6。 FeSO47H2O 5.57gNa2-EDTA 7.45g 先溶于1升蒸馏水里然后按每升培养基含5mg的比例加入培养基中。 Miller 培养基1963 1无机物 NH4N03 l 000mgLK

20、NO3 1000 mg/LCaN0324H2O 347mg/L KH2PO4 300 mg/LKCl 65 mg/LMgSO47H2O 35 mg/LNa一Fe一EDTA 32 mg/LMnSO44H2O 4.4 mg/LZnSO47H2O 1.5mg/LH3BO3 1.6 mg/L KI 0.8 mg/LCaCl22H2O 150 mg/L。2有机物 维生素Bl 0.1 mg/L维生素B6 0.1mg/L叶酸 0.5 mg/L甘氨酸 2.0 mg/L蔗糖 30gLpH 6.0。M11er培养基与MS培养基比较无机元素用量减少l312微量元素种类减少无肌醇。 MS培养基RM62Murashig

21、e Skoog 1962 1无机盐类同LS培养基 。2有机物。它的特点是无机盐的浓度高具有高含量的氮、钾尤其硝酸盐的用量很大同时还含有一定数量的铵盐这使得它营养丰富不需要添加更多的有机附加物就能满足植物组织对矿质营养的要求有加速愈伤组织和培养物生长的作用当培养物久不转移时仍可维持其生存。故这是目前应用最广泛的一种培养基。 MTmurashge and Tucker培养基 1大量元素 NH4N03 l650mgLKNO3 1900 mg/LCaCl22H2O 440 mg/LMgSO47H2O 370 mg/LKH2PO4 170 mg/LNa2一EDTA 37.3 mg/LFeSO47H2O

22、27.8 mg/LH3BO3 6.2 mg/L MnSO44H2O 22.3 mg/LKI 0.83 mg/LNa2MoO2H2O 0.25 m g/LCuSO45H2O 0.025 mg/LCoCl26H20 0.025 mg/L。2有机物 维生素Bl 0.4 mg/L维生素B6 10.0mg/L烟酸 5 mg/L甘氨酸 2.0 mg/L肌醇 100.0mgL蔗糖 50gL。 N6 培养基北京植物所黑龙江农业科学院1974 1无机物 KNO3 2800 mg/LNH42SO4 463mgLKH2PO4 400 mg/LMgSO47H2O 185 mg/LCaCl22H2O 165 mg/LN

23、a2-EDTA 37.3 mg/LFeSO47H2O 27.8 mg/LMnSO4H2O 4.4 mg/LZnSO47H2O 1.5mg/LH3BO3 1.6mg/L KI 0.8mg/L。2有机物 维生素B1 1mg/L维生素B6 0.5 mg/L叶酸 1 mg/L蔗糖 20 gLpH 5.8。1974年由我国的朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是KNO3和NH42SO4含量高不含铝。目前在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花粉和花药培养和组织培养。 Nielsen1960培养基 1无机盐 KNO3 200 mgLCaN0324H2O 800mgL MgSO47H2O 2

24、00mg/LKH2PO4 200 mg/LZnSO47H2O 0.2mg/LNiCl26H2O 0.3 mg/LMnCl2H2O 1.8 mg/LCuSO45H2O 0.08mg/LH2MoO4H2O 0.02 mg/LH3BO3 2.8mg/L2有机物 维生素B1 1mg/L烟酸 5 mg/L维生素B6 1 mg/L蔗糖 30 gL。 Nitsch Nitsch 1969培养基 1无机盐 KNO3 950 mgLNH4N03 720mgLKH2PO4 68 mg/LCaCl22H2O 166 mg/LMgSO47H2O 185mg/LFeSO47H2O 27.8 mg/LNa2-EDTA 3

25、7.3 mg/LMnSO44H2O 25mg/LH3BO3 10 mg/LZnSO47H2O 10mg/LCuSO45H2O 0.025mg/LNa2MoO42H2O 0.25 mg/L2有机物 维生素H生物素 0.05 mg/L肌醇 100 mg/L维生素B1 0.5mg/L烟酸 5 mg/L维生素B6 0.5 mg/L甘氨酸 2.0 mg/L叶酸 5 mg/L蔗糖 20 gL。 SH培养基Schenk和Hidebrondt SH培养基是1972年由Schenk和Hidebrondt设计的。它的主要特点与B5相似不用NH42SO4改用NH4PO4是矿质盐浓度较高的培养基。在不少单子叶和双子叶

26、植物上使用效果很好。 White培养基 White19631无机盐类 CaNO324H2O 287mg/LKNO3 80mg/LKCl 65 mg/LNaH2PO4H2O 19.1 mg/LMgSO47H2O 738 mg/LNa2SO410H2O 453 mg/LMnSO44H2O 6.6 mg/LH3BO3 1.5 mg/LZnSO47H2O 2.7 mg/LKI 0.75 mg/L2有机物 甘氨酸 3.0 mg/L烟酸 0.5 mg/L维生素B6 0.1 mg/L维生素B1 0.1 mg/L柠檬酸 2.0 mg/L蔗糖 20g/LpH 5.7。又称WH培养基是1943年White设计的1

27、963年做了改良。其特点是无机盐浓度较低。它的使用也很广泛无论是生根培养还是胚胎培养或一般组织培养都有很好的效果。 White培养基改良White1963 1无机盐 KNO3 80 mg/LCaN0324H2O 300mgLMgSO47H2O 720 mg/LNa2SO4 200 mg/LKCl 65 mg/L Na H2PO45H2O 16.5 mg/LFeSO43 2.5 mg/LMnSO44H2O 7 mg/LZnSO47H2O 3mg/LH3BO3 1.5mg/L CuSO45H2O 0.001 mg/LMoO3 3 mg/L。2有机物 维生素B1 0.1mg/L维生素B6 0.1 m

28、g/L甘氨酸 3.0 mg/L肌醇 100.0mgL烟酸 0.3 mg/L蔗糖 20 gLpH 5.0。 花肥培养基Kano1963Kyoto so1ution 花肥 3g/LKH2PO4 250 mg/LCaNO32.4H2O 1000mg/LMgSO47H2O 250 mg/LNH42SO4 2mg/L蔗糖 20gL pH 5.0。 木本植物用培养基WPMWoody Plant medium 1无机盐 NH4N03 400mgLCaNO32.4H2O 556mg/LK2SO4 990 mg/LCaCl22H2O 96 mg/L KH2PO4 170 mg/LNa2MoO42H2O 0.25

29、 mg/LMgSO47H2O 370 mg/LMnSO4H2O 22.4mg/LZnSO47H2O 8.6mg/LCuSO45H2O 0.25mg/LFeSO47H2O 27.8 mg/LNa2-EDTA 37.3 mg/L。2有机物 肌醇 100 mg/L维生素B1 1.0mg/L烟酸 0.5 mg/L维生素B6 0.5 mg/L甘氨酸 2.0 mg/L蔗糖 20 gL琼脂 6gLpH 5.2。 MS培养基的配制 1、MS大量元素母液的配制 一般将大量元素分别配制成10倍的母液使用时再分别稀释10倍。依次分别称取NH4NO3 16.5gKNO3 19.0g KH2PO4 1.70gMgSO4

30、7H2O 3.7gCaCl22H2O 4.4g共配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中存放于冰箱中。 2、MS微量元素母液的配制 一般将微量元素配制成100倍母液。依次称取KI 0.083gNa2MoO42H2O 0.025gH3BO3 0.62gCuSO45H2O 0.0025gMnSO4H2O 1.69gCoCl26H2O 0.0025gZnSO47H2O 0.86g。配成1L母液倒入1L试剂瓶中存放于冰箱中。 CuSO45H2O和CoCl26H2O 由于称取量很小如果天平精确度没有达到万分之一可先配成调整液。分别称取CuSO45H2O 0.05gCoCl26H2O 0.05g各自配成100ml

31、的调整液然后取5ml就还有0.0025g的量。 3、MS有机质母液的配制 一般配制成100倍MS有机母液。依次称取 肌醇 10g盐酸硫胺素VB1 0.01g烟酸 0.05g甘氨酸 0.2g盐酸吡哆醇VB6 0.05g配成1L母液倒入1L试剂瓶中存放于冰箱中。 4、MS铁盐母液的配制 一般配制成100倍MS铁盐母液。依次称取EDTA二钠 3.73g 和FeSO47H2O 2.78g配成1L母液倒入1L试剂瓶中存放于冰箱中。所以MS母液有5种大量元素母液加上MS微量元素母液、MS有机母液和MS铁盐母液共8种母液。 5、几种生长调节物质的配制 各种生长素和细胞分裂素要单独配制不能混合在一起生长素类一

32、般要先用少量95的酒精或1当量的NaOH溶解细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解然后再加蒸馏水定容。一般取100mg配成100ml母液。母液的保存一般将以上配制好的各种母液保存在4左右冰箱内。 注意事项 1称量要精确2 配制母液时要注意药品溶解的先后顺序以免发生化学反应使的产生沉淀。 MS培养基母液的配制 类别 化合物 培养基浓度mg/L 母液扩大倍数 1升母液中药品称取量mg 每升培养基取母液的量ml 大 量 元 素 CaCl2.2H2O 440 10倍 4400 100 KNO3 1900 19000 MgSO4.7H2O 370 3700 NH4.NO3 1650 16500 KH2 PO4 170 1700 微 量 元 素 MnSO4.4H2O 22.3 1000倍 22300 1 ZnSO4.7H2O 8.6 8600 H3BO3 6.2 6200 KI 0.83 830 Na2MoO4.2H2O 0.25 250 CuSO4.5H2O 0.025 25 CoCl2.6H2O 0.025 25 铁 盐 Na2.EDTA 37.3 200倍 7460 5 FeSO4.7H2O 27.8 5560 有 机 物 甘氨酸 2 200倍 400 5 盐酸硫胺素 0.4 80 盐酸吡哆素 0.5 100 烟酸 0.5 100 肌醇 100 20