ELISA所需缓冲液的配方之欧阳科创编.docx

1、ELISA所需缓冲液的配方之欧阳科创编一、做ELISA确定抗原最佳包被浓度，做方阵滴定具体怎么做呢？时间：2021.02.05创作：欧阳科选择好一份已知为阳性和阴性背景的标本，将你的抗原用1*CB PH=9.6或1*PB PH=7.4进行倍比稀释（8个条件）后加入96孔板每孔100ul。（一般包被浓度100ng抗原或抗体/孔，最优包被条件需进行试验选择）4度过夜取出后甩干，加入20%NBS封闭每孔200ul。37度2h热封，甩去后拍干即可。将你HRP或AP标记的抗原或二抗用酶标稀释液进行稀释（倍比稀释4个梯度）即可。棋盘滴定就是板酶交叉,同时带上阳性、阴性通过试验确定最佳P/N的包被搭配E的试

2、验2抗原和抗体最佳工作浓度的确定抗原抗体反应要求在最适比例条件下进行，ELISA反应试剂多，其工作浓度不同对结果影响较大，因此必须对包被抗原(抗体)和酶标抗体(抗原)进行最佳工作浓度的滴定和选择，以达到最佳的测定条件。1）方阵(棋盘)滴定法选择包被抗原的工作浓度 用包被液将抗原作一系列稀释(1:50l:800)后，按行进行包被、洗涤。按列分别加入用稀释液1:100稀释的强阳性、弱阳性、阴性参考血清及稀释液(作空白对照)，保温，洗涤。加工作浓度酶标抗体，洗涤，加底物显色，加酸终止反应后读取A值。选择强阳性参考血清A值；为08左右，阴性参考血清A值01的包被抗原稀释度为工作浓度。方阵(棋盘)法选择

3、包被抗体和酶标抗体的工作浓度 将抗体用包被液稀释为10mgL、lmgL、0.1mgL三个浓度按行包被，每一个浓度包被三行(每行3孔)，分别在每个浓度包被的第一、二、三行中分别加入强阳性抗原，弱阳性抗原和阴性对照，将酶标抗抗体用稀释液稀释为1:l 000、l:5000、l:10000三个浓度，分别加入每个浓度包被的第一、二、三列中。加底物显色，加酸终止反应，分别读取A值。以强阳性抗原液A值在0.8左右，阴性参考A值0.1的条件为最适条件。据此选择包被抗体和酶标抗体的最佳工作浓度。二、ELISA最适工作浓度的选择及标准化操作1最适工作浓度的选择11间接法测抗体酶标抗体工作浓度的选择：用IgG进行包

4、被，洗涤。将酶标IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，保温、洗涤。加酸终止反应后，读取吸光度(A)。读取A值在10时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。该酶标IsC的工作浓度应为11600。棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度：用包被液将抗原由1：50开始作比倍稀释后进行包被，洗涤。将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作1：100稀释，加样，保温、洗涤。加按工作浓度稀释的酶标IsC抗体，保温、洗涤。加底物显色。加酸终止反应后读取A值。选择强阳性参考血清的A值为08左右、阴性参考血清的A值小于01的包被抗的稀释度作为工作浓度，从中选取最适工作浓度。12夹心法测抗原在

5、夹心ELISA法中，可用棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。抗体免疫球蛋白用包被缓冲液稀释至蛋白浓度为100、10和01微克毫升，分别在ELISA板上进行包被，每一浓度包括3个纵行，洗涤。在1个横行各包被孔中加入强阳性抗原液，另1横行加入弱阳性抗原液，第3横行加入阴性对照液，保温、洗涤。将酶标抗体用稀释液稀释成3个浓度，例如1：1000、1：5000和1：25000。分别加入每个包被浓度的1个纵行中，保温、洗涤。加底物显色。加酸终止反应后，读取A值。以强阳性抗原的A值在08左右、阴性参考的A值小于01的条件作最适条件，据此选择包被抗体和酶抗体的工作浓度，从中选取包被抗体浓度和酶标抗

6、体的稀释度。为了进一步节省试剂，可以此浓度为基点，缩小间距再进一步做棋盘滴定。2测定方法的标准化21加样ELISA中除了包被外，一般需进行96孔加样。定性测定中有时不强调加样量的准确性。例如规定为加样1滴，如不具备相当的条件，要尽量使用相同口径的滴管，保持准确的加样姿势，使每滴液体的体积基本相同。在定量测定中，加样量应力求准确，最好采用量程准确的微量移液器。加样时应将液体加在孔底，不要加在孔壁上部，避免出现气泡。22保温在ELISA中，一般在加标本和结合物后，反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。各ELISA板不应叠在一起。为避免蒸发，板上应加盖，或将板平放在

7、底部垫有湿纱布的湿盒中。如用保温箱，空湿盒应预先放在其，以平衡温度。23洗涤洗涤在ELISA过程中不是反应步骤，但却是决定实验成败的关键。在标本和结合物的稀释液和洗涤液中加入聚山梨酯一类物质即避免非特异性吸附，在ELISA中最为常用。ELISA板的洗涤一般可采用以下方法：吸干孑L内反应液；将洗涤液注满板孔；放置2分钟，略作摇动；吸干孔内液，也可倾去液体后在吸水纸上拍干。洗涤的次数一般为3-4次，有时甚至需洗5-6次。如有专用洗涤机，应设定标准的洗涤步骤，并定期检查洗涤液，保证洗涤质量。24比色阴性对照颜色极浅，在定性测定中一般可采用目视比色。在目测法中，待检血清与抗原对照反应孔和待检血清与特异

8、抗原反应孔均呈无色或极浅色，判为阴性；待检血清与抗原对照反应孔无色或极浅色，而与特异抗原呈橘黄色，判为阳性。如用比色计测定结果，其准确性则决定于ELISA板底的平整与透明度和比色计的质量。三、ELISA法抗原包被的浓度如何确定？ELISA法进行抗原包被的时候，抗原包被的浓度是如何确定的。看到有些资料中方阵滴定法，稀释抗原和血清，以强阳性抗原液A值在0.8左右，阴性参考A值0.1的条件为最适条件。为什么选择这个为最适条件？弱阳性血清有什么用处？在摸索包被浓度的时候，血清中抗体的含量是固定的吗？需要提前定值吗？急需答案一般我们做的时候抗原抗体两个变量，抗原的浓度是根据你的抗原的纯度来定的，一般纯化

9、的蛋白是2ng，有时候是要抗体的滴度，抗原浓度固定，抗体或者血清就要拉稀释度，这和酶标仪的灵敏性有关.一般OD值在1.0左右酶标仪比较灵敏，测量的数据比较准确.OD值如果很深,达到2点几就不灵敏了.所以我们一般选OD值在1.0左右进行分析.OD 1.0-1.5之间最佳，当然依据酶标仪的性能而定。个人觉得棋盘ELISA一定要选择OD1.0的点是个误区。首先不同型号的灵敏度应该是不一样的；其次OD为1.0指的是某个抗原抗体浓度条件下的OD值，并不代表通过此次棋盘得到的最佳抗原抗体的浓度所做的各种后续ELISA实验的值也是1.0左右，所以说选择处于酶标仪灵敏度的最佳状况并不一定符合后续的实验。（不善

10、表达，不知自己描述清楚没有）我自己觉得要根据不同的实验类型（间接，双抗夹心或是竞争等）来选择最佳抗原抗体工作浓度。象竞争ELISA，做棋盘的目的是包被抗原和一抗的量，试想如果包被抗原太浓，意味着需要竞争抗原浓度也不能小（毕竟是竞争对手不能悬殊太大），这就注定了竞争ELISA的检测限不好（因为竞争抗原往往是要检测的东西，所需浓度越大IC50也就越大）。而一抗也不能足量，否则即能与包被抗原反应又能与检测抗原反应，就不能称为竞争ELISA了。也不能太少，否则整体OD读数太低。双抗夹心ELISA也是同样的道理，找到包被抗体和酶标抗体的平衡点，即能OD与本底之间的平衡点。四、elisa试剂盒Elisa试

11、验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。ELISA检测试剂盒是用于体外定性检测人血清或血浆中的抗人类戊型肝炎（HEV）病毒IgM抗体ELISA检测。（一）、ELISA简介elisa技术流程ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加

12、入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。然而，影响Elisa试验结果的因素很多，故加强各个环节的质量保证才能充分发挥其方法学的优点。（二）Elisa试剂盒测定技术的发展临床测定技术的发展主要在于方法学的发展，而方法学的发展依托于试剂生产技术不断进步更新和型标记物的应用。目前，分子生物学正在并

13、最终肯定会让我们对整个生命科学有一个全面而彻底的认识，其对免疫测定技术发展的影响也是直接而又有效的，它使我们对以前一些难以检测的生物活性物质的测定变得轻而易举，并且大大提高了检测的灵敏度和特异性。（三）基因工程试剂对免疫测定技术发展的影响免疫测定技术的基础在于抗原抗体之间的特异结合反应，所以任何优质的诊断试剂离不开优质的原料，如抗原抗体，酶等。以前用于免疫测定的抗原通常为各种纯化抗原，而抗体则为纯化抗原免疫动物后获得的多克隆抗体和使用杂交瘤技术得到的单克隆抗体，而抗原或抗体的标记物如酶标结合物则通过各种化学合成方法制备。近年来，随着分子生物学的发展，使用基因工程方法制备各种特殊的抗原或抗体及其

14、酶结合物等免疫测定试剂几成为现实的新一代试剂，各种新型使用的测定方法也不断出现。HBsAg试剂特点（检测模式：临床抗体夹心法）：包被抗体为山羊多抗。多抗具有高亲和性和对抗原各种表位的反应性。酶表抗体为与HBsAg有不同结合位点的鼠复合单位，可测得HBsAg变异样品，提高检测的特异性（99.98%）提高检测的灵敏度，应用ParlEhrich学说（PEI）HBsAg标准品，对ad标准品的灵敏度为0.05ng/ml对ay标准品灵敏度为0.025ng/ml（四）测试剂盒检测原理ELISA检测试剂盒应用定性夹心免疫检测技术，用合成的HEV多肽抗原包被微孔板板条，这些多肽是中国型HEV毒株核心氨基酸序列中

15、抗原性很强的肽段，分别来自于该毒株的开放阅读框2和开放阅读框3。将样品或标准品加入孔中并孵育，如果其中存在HEV IgM抗体，这些抗体就会与HEV 的多肽抗原结合，并固定在上面，洗板除去其它非特异性抗体和样品中的其它成份。然后加入羊抗人IgM-HRP（辣根过氧化物酶）酶结合物，经第二次孵育后，酶结合物就会与第一次孵育结合上的HEV IgM抗体相结合，洗板除去未结合的酶结合物，加入TMB底物溶液，在第三次孵育时会发生酶-底物反应，只有那些含有HEV IgM抗体和酶结合物所形成的复合物的孔才会发生颜色变化，加入硫酸溶液终止酶和底物间的反应，并在波长: 450nm处测量O.D.值,按照本HEV Ig

16、M抗体elisa试剂盒的测试标准, O.D.值大于或等于Cut-Off值的样品被认为是初试阳性。（五）操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为110g/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37孵育0.51小时，洗涤。

17、4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37 1030分钟。5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。方法二用于检测未知抗体的间接法1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至110g/ml，每孔加0.1ml，4过夜；2.次日洗涤3次；3.加一定稀释的待检样

18、品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37孵育1小时,洗涤；4.（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml；5.37孵育30-60分钟，洗涤；6.最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。（六）试剂器材试剂（1）包被缓冲液（PH9.60.05M碳酸盐缓冲液）:NaHCO3 1.59克NaHCO32.93克加蒸馏水至1000ml（2）洗涤缓冲液（PH7.4PBS）：0.15MKH2PO4 0.2克Na2HPO412H2O2.9克NaCl8.0克KCl0.2克Tween-200.05%0.5ml加蒸馏水至1000ml（

19、3）稀释液：牛血清白蛋白（BSA） 0.1克加洗涤缓冲液至100ml或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成510%使用。（4）终止液（2MH2SO4）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸（98%）21.7ml。（5）底物缓冲液（PH5.0磷酸枣柠檬酸）:0.2MNa2HPO4（28.4克/L）25.7ml0.1M柠檬酸（19.2克/L）24.3ml加蒸馏水50ml。（6）TMB（四甲基联苯胺）使用液:TMB（10mg/5ml无水乙醇）0.5ml底物缓冲液（PH5.5）10ml0.75%H2O232l（7）ABTS使用液:ABTS0.5mg底物缓冲液（PH5.5）1ml3%H2O22l（8）抗原

20、、抗体和酶标记抗体。（9）正常人血清和阳性对照血清。器材（1）聚苯乙烯塑料板（简称酶标板）40孔或96孔，ELISA检测仪，50l及100l加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。（2）小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。（3）4冰箱，37孵育箱。（七）注意事项1.做好对照正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。2.实验条件的选择在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:（1）固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等

21、。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。（2）包被抗体（或抗原）的选择：将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.09.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4 1824小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0和10g/ml等）进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为110g

22、/ml。（3）酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定（见酶标记抗体部份）。然后再固定其它条件或采取“方阵法”（包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。（4）酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体（如OPD等）有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。

23、（八）试剂盒的清洗试验原理试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中的浓度呈比例关系。自备材料1蒸馏水。2加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。3振荡器及磁力搅拌器等。安全性1避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。2实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。3不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

24、操作注意事项1试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。2实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。3不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。4使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。5使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。6洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。7底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。8加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应

25、板孔温育的时间一样。9按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。（九）ELISA的应用ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可

26、概括四个方面：1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。2、研究抗酶抗体的合成。3、显现微量的免疫沉淀反应。4、定量检测体液中抗原或抗体成份。五、Protocols/Recipes2012-03-29 9:05Protocols/RecipesAbC-Arrays:10x PBS Recipe for 1 literDissolve in 800 ml distilled water:o80 g NaCl Reanal, No.:2464-1-22-38, Ntrium-klorid, Ph. Eur.5; MW:58.44o2 g KCl Reanal, No.:18050-1-01-38, Kl

27、ium-klorid, a.r.; MW: 74.56o14.24 g Na2HPO4*2H2O Reanal, No.:08973-1-01-38, di-Ntrium-hidrogn-foszft 2-hidrt, a.r.; MW:177,99o2 g KH2PO4Reanal, No.:17890-01-38, Klium-dihidrogn-foszft, a.r.; MW:136.09Adjust volume to 1 liter with H2OFiltrate through an 0.22um filter and divide in 500ml aliquotesStor

28、e at room temperature1x PBS Recipe for 1 liter137mM NaCl, 2.7mM KCl, 8mM Na2HPO4, 1.46mM KH2PO4Dissolve in 800 ml distilled water:o8 g NaCl Reanal, No.:2464-1-22-38, Ntrium-klorid, Ph. Eur.5; MW:58.44o0.2 g KCl Reanal, No.:18050-1-01-38, Klium-klorid, a.r.; MW: 74.56o1.424 g Na2HPO4*2H2O Reanal, No.

29、:08973-1-01-38, di-Ntrium-hidrogn-foszft 2-hidrt, a.r.; MW:177,99o0.2 g KH2PO4Reanal, No.:17890-01-38, Klium-dihidrogn-foszft, a.r.; MW:136.09Adjust volume to 1 liter with H2OFiltrate trough an 0.22um filter or sterilize by autoclaveStore at room temperaturePBS-Tween for 1 liter0.05% Tween 20, PBSMi

30、x on magnetic stirrer:o0.5ml Tween 20 Sigma No.:P-1379, Polyoxylethylene-sorbitan monolaurate (Tween 20)o1 liter PBSPBS-Tween BSA for 300ml0.05% Tween 20, 5%BSA, 0.05% azide, PBSMix on magnetic stirrer:o300ml PBS-Tweeno15g BSA Sigma, No.:A3059-100G, Albumin, bovine serum, Fraction Vo1.5ml Sodium azi

31、de (from 10% NaN3stock solution)Filtrate through an 0.45um filterAliquot 50ml/falconStore at 4CCa2+Mg2+stock solution for 5ml0.25M Ca2+, 0.07M Mg2+Dissolve in 5 ml Milli Q water:o0.1838g CaCl2*2H2O Reanal 11024 MSZ 24161-65 Kalcium-klorid, szrtott MW: 147.02 CaCl2*2H2Oo0.0712g MgCl2*6H2O Reanal No.: 20281-1-01-38 Magnzium-klorid 6-hidrt MW: 203.30 MgCl2*6H2OCa-Mg-VBS (ver