单克隆抗体的制备方法.docx

1、单克隆抗体的制备方法 一、单克隆抗体的概念和原理免疫反应是人类对疾病具有抵抗力的重要因素。当动物体受抗原刺激后可产生抗体。抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇，各种抗原分子具有很多抗原决定簇，因此，免疫动物所产生的抗体实为多种抗体的混合物。用这种传统方法制备抗体效率低、产量有限，且动物抗体注入人体可产生严重的过敏反应。此外，要把这些不同的抗体分开也极困难。近年，单克隆抗体技术的出现，是免疫学领域的重大突破。 （1）单克隆抗体的基本概念 抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激

2、时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。 （2）单克隆抗体技术的基本原理 要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴 1 细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既

3、具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。其制备原理示意如下： 二、基本方法 2 1. 抗原提纯与动物免疫 7对抗原的要求是纯度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。如为细胞抗原，可取110个细胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。 选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在812周，雌雄不限。为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫34只小鼠。 免疫过程和方法与多

4、克隆抗血清制备基本相同，因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得高效价抗体为最终目的。免疫间隔一般23周。一般被免疫动物的血清抗体效价越高，融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大，而且单克隆抗体的质量（如抗体的浓度和亲和力）也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。末次免疫后34天，分离脾细胞融合。 2. 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。如待融合的是脾细胞，各种骨髓瘤细胞株均可应用，但应用最多的是SP2/0细胞株。该细胞株生长及融合效率均佳，此外，该细胞株本身不分泌任何5。融合细胞应选择15h10/ml免疫球蛋白重链或轻链。细胞的最高生长

5、刻度为910，倍增时间通常为 3 处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞（活性应大于95）。骨髓瘤细胞株在融合前应先用含8-氮鸟5，次日一般即为对10/ml嘌呤的培养基作适应培养，在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2 数生长期细胞。在体外培养条件下，细胞的生长依赖适当的细胞密度，因而，在培养融合细胞或细胞克隆化培养时，还需加入其他饲养细胞（feeder cell）。常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞，制备方法为用冷冻果糖液注入小鼠腹腔，轻揉腹部数次，吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞，其中在巨噬细胞和其他细胞。亦有用小鼠的脾细胞、大鼠或豚鼠的腹腔细胞作为饲养细胞的。 在制备饲养细胞时，切忌针头

6、刺破动物的消化器官，否则所获细胞会有严重污染。饲养细胞调至15 /ml10，提前一天或当天置板孔中培养。 细胞融合3. 细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。其后用培养液稀释PEG，消除PEG的作用。将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。融合过程中有几个问题应特别注意。细胞比例：骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1:2到1:10不等，常用1:4的比例。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。反应时间：在两种细胞的混合细胞悬液中，第1min滴加4.5ml 4 培养液；间隔2min滴加5ml培养液，尔后加培养液50ml。培养液的成分：对融合细胞，良好的培

7、养液尤其重要，其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低，应随时核查培养基情况。 4. 有限稀释法筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株，所以只有融合的细胞才能待续存活一周以上。融合细胞呈克隆生长，经有限稀释后（一般稀释至0.8个细胞/孔），按Poisson法计算，应有36的孔为1个细胞/孔。细胞培养至覆盖020孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，尔后进行抗原特异的ELISA测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。 单克隆抗体的制备和冻存5. 筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细

8、胞随培养时间延长，发生污染、染色体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注 5 射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集510ml的腹水，有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。5鼠，可根据腹10/此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。接种细胞的数量应适

9、当，一般为5 水生长情况适当增减。选出的阳性细胞株应及早冻存。冻存的温度越低越好，冻存于液氮的细胞株活性仅有轻微的降低，而冻存在70冰箱则活性改变较快。细胞不同于菌种，冻存过程中需格外小心。二甲基亚砜（DMSO）是普遍应用的冻存保护剂。冻存细胞复苏后的活性多在5095之间。如果低于50，则说明冻存复苏过程有问题。 6. 单克隆抗体的纯化单克隆抗体的纯化方法同多克隆抗体的纯化，腹水特异性抗体的浓度较抗血清中的多克隆抗体高，纯化效果好。按所要求的纯度不同采用相应的纯化方法。一般采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等步骤达到纯化目的，也有采用较简单的酸沉淀方法。目前最有效的单克隆抗体纯化方法为亲和纯化法

10、，多用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗体与载体（最常用Sepharose）交联，制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱，回收率可达90以上。蛋白可与IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3结合，同时还结合少量的IgM。洗脱液中的 6 抗体浓度可用紫外光吸收法粗测，小鼠IgG单克隆抗体溶液在A280nm时，1.44（吸光单位）相当于1mg/ml。经低pH洗脱后在收集管内预置中和液或速加中和液对保持纯化抗体的活性至关重要。 三、操作流程 （一）脾细胞 1材料 (1) 免疫过的血清抗体滴度高的BALB/c小鼠。 (2) 1640培养液 (3) 2.5FCS1640营养液 2操作方法 (1) 拉颈或用CO2处

11、死小白鼠。 (2) 将小鼠放于70酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。 (3) 把脾放入5ml含有2.5FCS的1640液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。 7 (4) 用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。 (5) 直立小试管3min，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。以2.5FCS1640充满离心管，并以400g离心7min10min（与此同时应开始制备骨髓瘤细胞）。 的新鲜培养液再悬浮。(7) 把沉淀用约10ml 重复、步骤。(9) 计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80为合格。 （二）骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞能产生并分泌大

12、量的免疫球蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。 选择骨髓瘤细胞的条件： 该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致； 骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生球蛋白或不分泌到细胞外；6 个细胞最好骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度 ,10/ml； 8 生长速度快，繁殖时间短。 目前常用的BALB/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：S194/5XXOBU1；SP20Ag14（简称SP20）；P2X？ Ag8653（简称653）；FO 以653最为常用，它是由矿物油4甲基15烷（Pristane，降植烷）诱

13、发出来的一种浆细胞瘤（Minerol Oil plasmacytoma，MOPC）并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。 骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入，保存于-195液氮罐中，试验时复苏、增殖、传代即可。 由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，很容易脱落，因此不需要胰酶处理。为了防止出现返祖现象，在融合前，77）的骨髓20h15h10对数生长期（即培养6115可将培养基内加入g/ml 8氮鸟嘌呤。取约10 1640液再悬浮并计数。，沉淀以瘤细胞，在室温离心（400g）10min2.5FCS （三）饲养细胞在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生

14、长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feeder cell）。在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都 9 可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。也可以是其他种类的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。 1材料 （1）小鼠（BALB/c或C57小白鼠）若干只。 （2）11.6蔗糖

15、溶液（经10磅30min高压灭菌）。 2操作方法 （1）拉颈处死小鼠。 （2）70酒精浸泡消毒10min。 （3）用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔。 （4）用注射器将4ml 11.6蔗糖溶液注入腹腔，用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。 10 （5）1 000rmin离心10min。 （6）取上清，以HAT选择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞，使每毫升含40万个活细胞。 （7）以1ml吸管将细胞种入微量培养皿，每孔0.05ml，含2万个细胞，放入CO2培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。 （四）融合细胞 融合剂1. 细胞融合的方法有物理法，如电融合、激光融合，化学融合法和生物融合法，如仙台病毒，此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。 聚乙二醇（PEG），在分子量为200700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1 000时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4 000者，常用浓度为50，pH8.0pH8.2（用10NaHCO调整），3分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。