间充质干细胞培养方法.docx

1、间充质干细胞培养方法间充质干细胞培养方法 1. 间充质干细胞MSC基本形态 2. 干细胞应用与干细胞调控。 3. 间充质干细胞MSC生长过程 4. 间充质干细胞MSC培养的合适气体环境 5. 细胞培养板的选择 6. 如何选用细胞培养基 7. 如何维持培养液 p H 8. 血清与干细胞的培养 9. 胎牛血清（F B S ）是否需要灭活 10. 细胞的细菌、真菌污染及排除 11. 细胞培养污染的预防 12. 使用胰蛋白酶时加入 E DTA的目的是什么 13. 胶原酶的种类和选型 14. 胶原酶 V S胰酶 15. 干细胞的种类和表面标记 16. 间质干细胞培养原理概述 17. 间质干细胞成脂和成骨

2、诱导分化 18. 干细胞老化的表现和处理 19. 细胞传代消化过程指导 20. 冷冻保护剂作用和选择 21. 细胞冻存指导 22. 干细胞冷冻和复苏 23. 移植细胞的基因修饰 1间充质干细胞MSC基本形态 体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。 间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出23 厘米个长短不同的突起。可看到细胞成螺旋状生长。 2干细胞应用与干细胞调控 干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干细胞

3、的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。 2.1内源性调控 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化，包括调节细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的核因子等。另外，干细胞在终末分化之前所进行的分裂次数也受到细胞内调控因子的制约。 （1）胞内蛋白对干细胞分裂的调控 干细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不对称是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常重要。如在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素A。收缩体与纺锤体的结合决定了干

4、细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必 需的成分保留在子代干细胞中。（2）转录因子的调控 在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化的调节非常重要。比如在胚胎干细胞的发生中，转录因子Oct4 是必需的。Oct4 是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达的转录因子，它诱导表达的靶基因产物是FGF-4 等生长因子，能够通过生长因子的旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层的进一步分化。Oct4 缺失突变的胚胎只能发育到囊胚期，其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子（LIF）对培养的小鼠ES 细胞的自我更新有促进作用，而对人的成体干细胞无作用，说明不同种属间的转录调控是不完全一致的。又如 Tcf/Lef 转录

5、因子家族对上皮干细胞的分化非常重要。Tcf/Lef 是Wnt 信号通路的中间介质，当与-Catenin 形成转录复合物后，促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊。 2.2外源性调控 除内源性调控外，干细胞的分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素的影响。 （1）分泌因子 间质细胞能够分泌许多因子，维持干细胞的增殖，分化和存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们是TGF家族和Wnt 信号通路。比如TGF 家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞的分化。最近研究发现，胶质细胞衍生的神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多种神经元的存活和分化，还对精原细胞的再生和分化有决定作

6、用。GDNF 缺失的小鼠表现为干细胞数量的减少，而 GDNF的过度表达导致未分化的精原细胞的累积。Wnts 的作用机制是通过阻止-Catenin 分解从而激活Tcf/Lef 介导的转录，促进干细胞的分化。比如在线虫卵裂球的分裂中，邻近细胞诱导的Wnt 信号通路能够控制纺锤体的起始点和内胚层的分化。 （2）膜蛋白介导的细胞间的相互作用 有些信号是通过细胞-细胞的直接接触起作用的。-Catenin 就是一种介导细胞粘附连接的结构成分。除此之外，穿膜蛋白Notch及其配体Delta 或Jagged 也对干细胞分化有重要影响。在果蝇的感觉器官前体细胞，脊椎动物的胚胎及成年组织包括视网膜神经上皮、骨骼肌

7、和血液系统中，Notch 信号都起着非常重要的作用。当Notch 与其配体结合时，干细胞进行非分化性增殖；当Notch 活性被抑制时，干细胞进入分化程序，发育为功能细胞。 （3）整合素（Integrin）与细胞外基质 整合素家族是介导干细胞与细胞外基质粘附的最主要的分子。整合素与其配体的相互作用为干细胞的非分化增殖提供了适当的微环境。比如当1整合素丧失功能时，上皮干细胞逃脱了微环境的制约，分化成角质细胞。此外细胞外基质通过调节1整合素的表达和激活，从而影响干细胞的分布和分化方向。 2.3干细胞的可塑性 越来越多的证据表明，当成体干细胞被移植入受体中，它们表现出很强的可塑性。通常情况下，供体的干

8、细胞在受体中分化为与其组织来源一致的细胞。而在某些情况下干细胞的分化并不遵循这种规律。1999 年 Goodell 等人分离出小鼠的肌肉干细胞，体外培养5 天后，与少量的骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射的小鼠中，结果发现肌肉干细胞会分化为各种血细胞系。这种现象被称为干细胞的横向分化（trans-differentiation ）。关于横向分化的调控机制目前还不清楚。大多数观点认为干细胞的分化与微环境密切相关。可能的机制是，干细胞进入新的微环境后，对分化信号的反应受到周围正在进行分化的细胞的影响，从而对新的微环境中的调节信号做出反应。 3间充质干细胞MSC生长过程 潜伏期指数增生期停滞期 （

9、1）潜伏期(latent phase) 细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时,细胞质回培养基, 细胞贴壁速度与细胞种类悬浮期结束。,称贴壁,然后细胞贴附于载体表面胞体呈圆球形，, 缩成分,载体的理化性质等密切相关。一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30分钟即可贴壁。细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。原代培养细胞潜伏期长，约24-96 小时或更长, 连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅需6-24 小时。 （2）指数增生期(logarithmic growth phase) 这是细胞增殖最旺盛的阶

10、段，分裂相细胞增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志。通常以细胞分裂相指数（Mitotic index, MI ）表示，即细胞群中每1000 个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于 0.1%-0.5% ，原代细胞分裂指数较低，而连续细胞和肿瘤细胞分裂相指数可高达35。指数增生期的细胞活力最好时期，是进行各种实验最佳时期，也是冻存细胞的最好时机。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续 35 天后，随着细胞数量不断增多、生长空间减少，最后细胞相互接触汇合成片。正常细胞相互接触后能抑制细胞运动，这种现象称接触抑制现象(contact inhibition)。而恶

11、性肿瘤细胞无接触抑制现象，能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（piled up）。细胞接触汇合成片后，虽然发生接触抑制，但只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂，因此细胞数仍然在增多。但是，当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养枯竭和代谢产物的影响，导致细胞分裂停止，这种现象称密度抑制现象（Density Inhibition）。 （3）停滞期(Stagnate phase) 细胞数量达到饱和密度后，如不及时进行传代，细胞就会停止增殖，进入停止期。此时细胞数持平，故也称平台期（Plateau phase）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动。如

12、不进行分离传代，细胞会因培养液中营养耗尽、代谢产物积聚、pH 下降等因素中毒，出现形态改变，贴壁细胞会脱落，严重的会发生死亡，因此，应及时传代。 4间充质干细胞MSC培养的合适气体环境 干细胞相关的培养液都必须在 5 CO2 的气体环境中培养使用。否则会对细胞产生影响。气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳既是细胞代谢产物也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH 值。大多数细胞的适宜p

13、H 为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。一般情况下，细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。 5细胞培养板的选择 细胞培养板依底部形状的不同可分为平底和圆底（U 型和V 型）；培养孔的孔数有6、12、24、48、96、384、1536 孔等；根据材质的不同有Terasaki 板和普通细胞培养板。具体选择时根据培养细胞的类型、所需培养体积及不同的实验目的而定。 （1）平底和圆底（U 型和V 型）培养板的区别和选择 不同形状的培养板有不同用途。培养细胞，通常是选用平底的，这样便于镜下观测、有明确的底面积、细胞培养液面高度相对一致。因此做MTT 等实验时，无论是贴

14、壁和悬浮细胞，一般选用平底板。测吸光值一定要使用平底的培养板。要特別注意材质，标示“Tissue Culture (TC) Treated”是养细胞用的。 U 型或V 型板，一般在某些特殊要求時才使用。如在免疫学方面，当做两种不同淋巴细胞混合培养時，需要二者相互接触刺激，这时一般会选用U 型板，因为细胞会由于重力的作用而聚集在很小的范围内內。圆底培养板还会用于同位素掺入的实验，需要用细胞收集仪收集细胞的培养，如“混合淋型板替代U 型板常用做细胞杀伤、免疫学血凝集实验。细胞杀伤这种实验也可用V等。”巴细胞培养（加入细胞后，低速离心)。 （2）Terasaki 板和普通细胞培养板的区别 Teras

15、aki plate主要是用于晶体学研究，产品设计便于对晶体的观察与结构分析。有两种 sitting 和 handing drop 两种方法，两种方法应用产品的外形结构也不同。材料上选择crystal class polymer ，特殊的材料有利观察晶体结构。细胞培养板主要是PS 材料，材料是treated sufface，便于细胞贴壁生长与伸展。当然还有浮游细胞的生长材料，同时还有low binding surface （3）细胞培养板与酶标板的区别 酶标板一般要比细胞培养板贵，细胞板主要做细胞培养，也可以用来测蛋白浓度；酶标板包括包被板和反应板，一般不用做细胞培养，它主要做免疫酶联反应后的蛋

16、白检测，需要更高的要求和特定的酶标工作液。 （4 ）常用不同培养板的孔底面积及推荐加液量 不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般在23mm 范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量（参考下表）。若加液量过多会影响气体（氧气）交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。 常用的培养器皿 培养器皿 底面积（cm2） 加培养液量（mL） 可获细胞量 96 孔培养板 0.32 0.1 105 24 孔培养板 2 1.0 5105 12 孔培养板 4.5 2.0 106 6 孔培养板 9.6 2.5 2.5106 4 孔培养板 28 5.0 7106 3

17、.5cm 培养皿 8 3.0 2.0106 6cm 培养皿 21 5.0 5.2106 9cm 培养皿 49 10.0 12.2106 10cm 培养皿 55 10.0 13.7106 25cm 塑料培养瓶 25 5.0 5.2106 75cm 塑料培养瓶 75 1530 2107 25cm 玻璃培养瓶 19 4.0 3106 100cm 玻璃培养瓶 37.5 10.0 6106 250cm 玻璃培养瓶 78 15.0 2107 2500cm 旋转培养瓶 700 100250 2.5108 注：各种单层生长的细胞在培养皿中长满的细胞数，主要取决于器皿底表面积和细胞体积的大小。上表以293 细胞

18、为例给出的可获细胞量仅作参考。 6如何选用细胞培养基 培养基是维持体外细胞生存和生长的基本溶液，是组织细胞培养时最重要的条件。细胞培养基大致有： （1）合成培养基 主要成分为：氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、辅助物质（核酸降解物、氧化还原剂等）。常用的有： 种成分，添加53 外，含有BSS 等设计，除Morgan 年由1950 细胞培养基及其改良品种。199适量的血清后，可广泛用于多种细胞培养、病毒学、疫苗生产等。 199 （HB）细胞培养基，主要应用于Vero 细胞、地鼠肾细胞转瓶培养生产狂犬、乙脑等疫苗，具有高缓冲性能，能够有效提高病毒滴度。 BME细胞培养基。基础Eagle 培养基（

19、Basal Medium Eagle），1955 年由Eagle 设计，BSS12 种氨基酸谷氨酰胺8种维生素。简单、便于添加，适于各种传代细胞系和特殊研究用，在此基础上改良的细胞培养基品种有MEM、DMEM、IMDM 等。 MEM细胞培养基。低限量Eagle 培养基（Minimal Essential Medium），1959 年修改配方，删去赖氨酸、生物素，增加氨基酸浓度，适合多种细胞单层生长，是一种最基本、适用范围最广的培养基，是一种被广泛应用的培养基。需要注意的是，MEM 细胞培养基有含 Earles 平衡盐的类型，也有含 Hanks平衡盐的类型；有高压灭菌型的，也有过滤除菌型的；还有

20、含非必需氨基酸的类型。生产和科研时，应根据实际情况注意选择合适的MEM 细胞培养基。另外，因MEM 培养基营养成分所限，针对生产之特定细胞培养与表达时，并不一定是使用效果最佳或者最经济的培养基。 DMEM细胞培养基及其改良品种。 DMEM 由Dulbecco 改良的Eagle 培养基，各成份量加倍，分低糖（1000mg/L）、高糖（4500mg/L ）。细胞生长快。附着稍差的肿瘤细胞、克隆培养用高糖效果较好，常用于杂交瘤的骨髓瘤细胞和DNA 转染的转化细胞培养。例如CHO 细胞表达生产乙肝疫苗、CHO 细胞表达EPO。 IMDM 细胞培养基。 IMDM 是由Iscoves 改良的Eagle 培

21、养基，增加了几种氨基酸和胱氨酸量。可用于杂交瘤细胞培养，以及无血清培养的基础培养基。 RPMI-1640 细胞培养基。 Moore 等人于1967 年在Roswell Park Memorial Institute 研制，针对淋巴细胞培养设计，BSS21种氨基酸维生素11 种等，广泛适于许多种正常细胞和肿瘤细胞，也用做悬浮细胞培养。 Fischers细胞培养基。用于白血病微粒细胞培养。 HamF10、F12 细胞培养基。 1963 年、1969 年由Ham 设计，含微量元素，可在血清含量低时用，适用于克隆化培养。F10适用于仓鼠、人二倍体细胞，F12 适用于CHO 细胞。 DMEM/F12细胞

22、培养基。 DMEM 和F12 细胞培养基按照 1:1 比例混合效果最佳，营养成分丰富，且可以使用较少血清，或作为无血清培养基的基础培养基。 （2）低血清细胞培养基 主要应用于VERO 细胞、BHK21 细胞等细胞在转瓶、微载体反应器中的培养。 （3）无血清培养基 是设计用来在无血清条件下促使特殊类型的细胞生长或进行专门应用的培养基。需要添加生长因子和或细胞因子，含有个别蛋白或大量蛋白组分。 （4）替代天然培养基 培养基中不包含有蛋白、水解产物或未知结构的组分，所有的成分均有已知的化学结构。面对如此多的细胞培养基，对细胞培养基的选用，建议： 可以查阅相关文献，或在购买细胞株时咨询选用最适合细胞株

23、的培养基，或购买相配套的细胞培养基产品。 许多培养基都适合多种细胞株的培养，可以采用现有的培养基进行试验。 根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选 1640；进行细胞杂交、基因转移实验，可选择IMDM。 结合细胞特性及培养基的培养效能，用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲 线、克隆形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基。 注：目前也有不少商业化的msc培养基，如百恩维的间充质干细胞无血清培养基，间充质干细胞培养基（低血清） 7如何维持培养液 p H 配好的培养液变碱（变紫红）是正常的现象。暴露在空气中的培养液，因为大气中二氧化碳的浓度很低，培养液中的

24、HCO3 -被渐渐耗掉，培养液的pH值也逐渐升高，变成了紫红色。如果培养基pH值偏碱的程度不大，可将装培养液的瓶口拧松，放置于二氧化碳培养箱中一段时间，让培养箱中的CO2进入培养液，pH值就可以纠正。如果pH值偏离的程度很大，可以通过添加少量无菌的H Cl 或者NaOH调节pH，便可以使用。将配制好的培养基小剂量分装，可以避免反复开盖引起其中的二氧化碳逸出而造成pH升高。同时因NaHCO3遇热不稳定，会分解释放出CO2 ，而使培养基的pH升高，偏碱。因此在配置使用培养的过程中应注意： （1）动作迅速，不可使培养液长时间处于较高室温下； （2）配置过程中，混匀时切不可加热。混匀后应立即放入4C

25、冰箱，待过滤时再取出； （3）使用完毕应尽快将瓶口封好，放于4C 冰箱保存。 通过在培养液中同时添加Hepes 也可以有效的稳定pH 值。Hepes （羟乙基哌嗪乙硫磺酸）是一种非离子两性缓冲液,它在pH 7.27.4范围内具有较好的缓冲能力。其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的pH 值。在这种培养条件下，细胞培养瓶的盖子应拧紧，以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中。该缓冲液使用的终浓度为1050mmol/L，一般培养液内含20mmol/L Hepes 便可达到缓冲能力。Hepes 的使用方法有以下两种： （1）Hepes 可按所需的浓度直接加入到配制的培养液中，再过滤除菌。

26、每1000ml 培养液中加入2.38 克HEPES，溶解后用1N NaOH 调pH 至7.2，过滤除菌后使用。此时HEPES 的使用浓度为10 mmol/L。 （2）配成 100x 贮存液（1 mol/L），使用前取 99mL 培养液加入 lmL 贮存液，最终应用浓度仍为 10 mmol/L。1 mol/L （100x）Hepes 贮存液配制方法：取23.8g Hepes 溶于90ml 双蒸水中，用1N NaOH 调pH 至7.58.0，然后用水定容至100mL，过滤除菌，分装小瓶（2mL/瓶），4或-20保存。 8血清与干细胞的培养 干细胞在体内存在的量很少，处在一个个环境相对稳定的“nic

27、he”中，所以一旦完成分离进入体外环境，最重要的就是保证细胞的活力不受影响，那么就必须提供一个相对稳定的培养环境。这些环境就是靠培养基和培养箱来提供了。培养液中最重要的莫过-血清，特别是对干细胞来说。所以为了最优的干细胞培养效果，推荐选用对应的干细胞专用血清。牛血清是最常用的，但是根据血清的来源不同又可以分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新牛血清取自出生24 小时之内的新生牛；小牛血清取自出生1030 天的小牛。显然，胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少，所以也成为了干细胞培养的首选。 培养中如何正确的使用血清？避

28、免不好的影响呢？ 血清的浓度：对大部分的干细胞，最佳的血清浓度是10%。过高的血清浓度会导致细胞出现分化的现象，如果是需要高浓度的血清，培养的时间也不能超过两周，否则会导致细胞分化能力下降。过低的血清会导致细胞的增殖速度下降。血清的溶解：必须在 4进行，最好过夜溶解。这样可以减少沉淀的产生，避免营养物质的流式。同时也要避免血清的过滤，如果需要过滤可以和培养基一起过滤。细胞培养液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等，其中牛血清是最常用的血清，分为胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是从母牛破腹取出的胎牛中分离出的血清，价格昂贵。新生小牛血清是从新生小牛血清的质量与胎牛血清如厂家能做到这一点，刚出生

29、的尚未哺乳的小牛中分离出来的血清，的质量相差不大。如小牛出生后已哺乳，从这种小牛中取出的血清中可能含有较多的生物活性物质，其质量明显不如前两种。 血清的质量，种类及使用的浓度都有可能影响细胞的生长，而不同批次的血清支持细胞生长的能力也不同，尤其是对克隆细胞的生长，某些批次血清可能含有毒性或抑制细胞生长的物质。注意以下几点： （1）需要长期保存的血清必须储存于-20或-80低温冰箱中。4冰箱中保存时间切勿超过1 个月。由于血清结冰时体积会增加约10，因此，血清在冻入低温冰箱前，必须预留一定体积空间，否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。 （2）瓶装血清解冻需采用逐步解冻法：-20 或 -80 低温冰箱中的

30、血清放入4冰箱中溶解1 天。然后移入室温，待全部溶解后再分装。在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀（小心勿造成气泡），使温度与成分均一，减少沉淀的发生。切勿直接将血清从-20 进入37解冻，这样因温度改变太大，容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。影响使用效果！ （3）热灭活是指56, 30 分钟加热已完全解冻的血清。加热过程中須規則搖晃均勻。此热处理的目的是使血清中的补体成分（complement ）灭活。除非必须，一般不建议作此热处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，而且还会影响血清的质量。补体参与反应有：细胞毒作用, 平滑肌细胞收缩, 肥大细胞和血小板释放组胺, 增强吞噬作用, 促进淋巴细胞和巨噬

31、细胞发生化学趋化和活化。 （4 ）切勿将血清在 37放置太久，否则血清会变得浑浊，同时血清中的有效成分会破坏而影响血清质量。 （5）血清中的沉淀物 絮状物：主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理。显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长。 9胎牛血清（F B S ）是否需要灭活 灭活的目的是去除血清中的补体成分，避免补体对细胞产生细胞毒害作用。胎牛血清（FBS）对许多细胞系均有促生长作用，主要适用于细胞株的保藏及特殊用途的细胞株的体外培养。胎牛血清是取自剖腹产的胎牛。因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞生长有害的成分最少，质量是最高的。所以不必要灭活。 10细胞的细菌、真菌污染及排除 真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在梅雨季节进行细胞培养更易污染。污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不混浊，倒置显微镜下可见于细胞之间纵横交错穿行的丝状、管状、及树枝状菌丝，并