蛋白质相互作用.ppt

1、Protein-protein Interaction 蛋白质-蛋白质相互作用,03/27/2009,Protein-Protein Interactions-A Common Theme in Cell Biology 蛋白质-蛋白质相互作用 细胞生物学领域的普遍主题,*DNA*RNA*Protein,Cell assembly and function/细胞组装与功能,Messenger,Headquarter,Executor,Stable,DNA mutation,Stable/Versatile,rRNA,tRNA,mRNA,Versatile,Protein modificatio

2、nProtein-Protein interactionProtein-Other component interaction,Protein-Protein Interactions,Single protein Protein complex Protein complex interaction Protein complex network Cell,Versatile,Dynamic,Accurate regulation,Cell assembly and function,Protein-Protein Interactions,Interaction Domain-Struct

3、ural basis for protein interaction 相互作用区域是蛋白质相互作用的结构基础,*信号蛋白，调节蛋白以及大多数其他的蛋白质都具 有包括相互作用区域在内的好几个结构域；*有些多肽仅由相互作用区域组成，从而充当蛋白质复合物的核心。,Interaction Domain-Structural basis for protein interaction 相互作用区域是蛋白质相互作用的结构基础,*SH2 domain:phosphotyrosine-containing peptides recognition domain。SH2 分布最为广泛，识别特定的含有磷酸化Tyr

4、的多肽模块。,SH3,SH2,Y kinase,SH3,SH2,SH3,pYEEI,pYVNV,Src SH2 domain:Grb2 SH2 domain:,Interaction domain and Protein interactionSignaling transduction pathway,Physiological functions of protein interactions Localization 蛋白质的亚细胞定位,*蛋白质的亚细胞定位与其 功能密切相关；*涉及：蛋白质-蛋白质相互作用；蛋白质与磷脂的相互作用；*蛋白质的组织特异性与 亚细胞定位的研究是蛋白 质功能研

5、究的起始步骤,Protein-protein interaction can be used to build complex biological systems.蛋白质-蛋白质相互作用是功能复合物形成的基础。（如线粒体内膜呼吸链）,Physiological functions of protein interactionsLocalization and Trafficking,Aberrant interactions can contribute to pathogenesis;错误的相互作用可能导致病理形象的出现。如 Alzheimers disease,beta-淀粉样结构的堆积

6、；,Physiological functions of protein interactionsLocalization and Trafficking,Inducible protein interaction&posttranslational modifications可诱导的蛋白相互作用与翻译后修饰,Dynamic behavior of cells in response to changing conditions is highly dependent on posttranslational modifications;细胞面对不断改变的环境表现出来的动态行为有赖于蛋白质的翻

7、译后修饰以及它带来的蛋白质相互作用的变化。,Techniques and computation,Elucidation of Protein-Protein Interactions,Biophysical TechniquesMass SpectrometrySurface Plasmon Resonance Atomic Force MicroscopyNMRX-ray Crystallography,High Throughput TechniquesLibrary ScreeningDegenerate Peptide LibrariesSpot BlotsCo-IPsGST-pul

8、ldownsYeast 2-HybridPhage Display,Standard TechniquesCo-IPsGST-pull downsYeast 2-HybridPhage Display,In vivo ImagingFRETBRET,Protein Interaction Networks,Techniques：Principle,Process,Advantage and DisadvantageGST-Pull down,Principle:Affinity purification Affinity between Interaction motif/polypeptid

9、e and its interaction proteins;Advantage:Direct interaction/In vitroProcess:,Interaction motif,GST,Immobilized onGlutathione beads,Affinity column Making,Affinity purificationfrom tissue or cell lysate,Techniques：免疫沉淀,质量作用定律决定IP的成功度,Techniques：免疫沉淀（非变性）,免疫沉淀的灵敏度取决于Protein A(or G)与 IgG的Kd、IgG与抗原的Kd值。

10、所以增加抗原或抗体的浓度、使用与抗体直接共价偶联的珠子进行免疫沉淀可以提高灵敏度；,Protein A Bead,IgG,Antigen,Kd,Kd,*,*,IgG,Kd,Antigen,Co-Immunoprecipitation/共免疫沉淀,Principle:Affinity purification/亲和纯化Advantage:In vivo(Physiological status)/代表生理状态下的相互作用,X,Y,X,Y,Cell,Cell Lysis andImmunoprecipitation of protein X,Z,Z,细胞裂解与蛋白质X的免疫沉淀,Technique

11、s：免疫沉淀（非变性）,生理活性的保持：a.全程低温操作；b.裂解液中加入蛋白酶抑制剂；2.免疫沉淀的灵敏度取决于Protein A(or G)与 IgG的Kd、IgG与抗原的Kd值。所以增加抗原或抗体的浓度、使用与抗体直接共价偶联的珠子进行免疫沉 淀可以提高灵敏度；,Protein A Bead,IgG,X,Kd,Kd,*,*,IgG,X,Kd,Techniques：免疫沉淀（非变性）,免疫沉淀的产物如用于SDS-PAGE及及免疫印迹进一步分析时，*需要去除盐的干扰，PBS 或其它洗涤缓冲液应可能去除；大量IgG掺入也影响电泳的效果，如脱尾和扩散。检测信号十分微弱时，这种条带的扩散可能导致根

12、本无法获得 信息；,Techniques：免疫沉淀（非变性）,免疫沉淀的产物如用于SDS-PAGE及及免疫印迹进一步分析时，大量的IgG掺入样品后导致免疫印迹时出现非特异性条带；对免疫共沉淀的结果分析影响尤其大；,IgG,目的蛋白,用目的蛋白的抗体进行 免疫沉淀，再用免疫印 迹法进行检测；,GFP,WT,YF Mut(6),-+,-+,-+,IP:GFPIB:4G10(pTyr),MTSS1-GFP,GFP,PDGF,115,93,49.8,35.8,29.2,198,-+,-+,-+,Reblot:GFP,MTSS1-GFP,GFP,WT,YF Mut(6),Techniques：免疫共沉淀

13、（非变性）,操作同非变性免疫沉淀，只是检测的是相互作用蛋白；其效率还涉及复合物中蛋白质X，Y，Z的Kd 值。,Protein A Bead,IgG,X,Y,Z,Protein A IgG Protein X*Protein Y Protein Z,Kd,Kd,Kd,Kd,Techniques：免疫共沉淀（非变性）,1.免疫复合物中蛋白质X，Y，Z的Kd 值越小，即越稳定，有利于免疫共沉淀的进行;2.免疫沉淀中提高灵敏度的方法同样适用于免疫共沉淀；,X,Y,Z,Protein A IgG Protein X*Protein Y Protein Z,Kd,Kd,Kd,Kd,Techniques：免

14、疫共沉淀（非变性）,细胞裂解液的几点考虑：1.复合物的稳定，提高灵敏度，但会降低特异性；2.针对特定的复合物，细胞裂解液中可能加入磷酸酯酶 抑制剂或者ATP及一些金属离子以维持复合物的稳定；,Techniques：免疫共沉淀,免疫共沉淀中的非特异性：,B,A,x,Y,细胞裂解,蛋白质X的抗体进行免疫沉淀,X,Y,X,Y,B,A,X,Techniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑（类型 I）,B,A,x,Y,细胞裂解,蛋白质X的抗体进行免疫沉淀,A,X,原因：抗体的非特异性,Techniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑（类型I）,1.抗体的质

15、量：抗体的特异性；2.尽可能的设置多种阴性对照；一般采用兔子免疫前的血清(pre-immune serum)同时进行免疫沉淀及后续分析;3.使用目标蛋白的多种抗体进行免疫沉淀并比较；4.采用不表达目标蛋白的细胞裂解物同时进行免疫 沉淀并比较；5.增强细胞裂解液的严谨性，降低非特异性；6.检测两种蛋白质的相互作用时，同时用两个蛋白质的抗体进行实验；,B,A,x,Y,细胞裂解,蛋白质X的抗体进行免疫沉淀,X,Y,X,Y,B,X,Techniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑（类型 II）,抗原复合物与其它蛋白质的非特异性相互作用；抗原复合物解离,X,Techniques：

16、免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑（类型 II）,*当 X-Y 的复合物不很稳定或解离常数大时，可以考虑使用细胞 可渗透的交联剂(Cross-linker),X,NH2,Y,NH2,活性基团,活性基团,A,B,A,x,Y,细胞裂解,蛋白质X的抗体进行免疫沉淀,Techniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑（类型 II）,*当 X-Y 的复合物是瞬间形成的或解离常数大时，可以考虑 使用细胞可渗透的交联剂(Cross-linker),X,NH2,Y,NH2,活性基团,活性基团,A,B,A,x,Y,细胞裂解,蛋白质X的抗体进行免疫沉淀,X,Y,Techniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑（类型 II）,研究方案:Affinity purification&MS,带Tag的目标蛋白与固相基质偶联,目标蛋白带上Tag,目标蛋白相互作用蛋白的亲和纯化,目标蛋白复合物的SDS-PAGE分离,蛋白质条带的切割和酶解,质谱与生物信息学分析,文献与其他数据库的功能分析,实验验证与功能的探索,MTSS1 过量表达促进PDGF诱导的背部变皱