一株产胶原蛋白酶芽孢杆菌的分离及鉴定.docx

1、一株产胶原蛋白酶芽孢杆菌的分离及鉴定一株产胶原蛋白酶芽孢杆菌的分离及鉴定生物科学2003级 李军指导老师 吴 琦 副教授摘 要：从皮革厂、畜肉市场、屠宰场等处采样，分离得到49株明胶水解活性的细菌。经活性平板初筛、牛皮消化实验和活性测定，筛选得到一株胶原蛋白酶活性为35.97U/mL的菌株。经形态学观察、生理生化特性和16SrDNA序列分析，鉴定该菌株为短小芽孢杆菌。关键词：胶原蛋白酶，短小芽孢杆菌，分离，鉴定 Isolation and Identification of a Bacillus pumilus with Collagenase Activity LI Jun Biologic

2、al Science, Grade 2003 Directed by WU Qi (Associate Prof. )Abstract：Forty-nine bacterial strains with glutin hydrolyzation activity were isolated from leather house, market and slaughterhouse. By screening media, fresh calfskin decomposition and activity detection, one strain was screened with colla

3、genase activity about 35.97U/mL. Furthermore, seen from morphology, physiology biochemistry characteristic and 16S rDNA sequencing, it was identified as a Bacillus pumilus.Key words：Collagenase，Bacillus pumilus，Isolation，Identification胶原蛋白或称胶原是由动物细胞合成的一种生物性高分子。广泛存在于动物骨、脚、软骨和皮肤及其它结缔组织中，约占哺乳动物总蛋白的1/3。

4、多数类型的胶原蛋白分子都由3条肽链组成，3链相互缠绕，形成了胶原蛋白分子特有的杆状结构1。胶原蛋白是一类重要的资源，在许多方面都有重要的作用。在饲料工业中：胶原蛋白作为一种高效的动物性蛋白营养添加剂2 。在生物医学材料方面的应用：制作心脏瓣膜；血管修复的替换血管装置；作为烧伤伤口的敷料（使血液凝固，具有止血功能）；制造人造皮肤3。在食品方面：胶原蛋白材料制备薄膜材料；制造肠衣等可食用包装材料；作为肉制品添加剂、保健食品等3 。另外，胶原蛋白具有优良的吸湿、保湿性能以及抗皮肤衰老功效,一些知名品牌公司已推出了纯胶原蛋白和一系列添加了纯胶原蛋白的护肤品4 。胶原蛋白得到了广泛的应用，大量的需求突出

5、了提取胶原蛋白迫切性，用胶原蛋白酶进行生产就是其中重要的一种方法。胶原蛋白酶是指作用于胶原或其变性明胶而不作用其它蛋白质的酶类 ，它来源广泛，多种微生物以及动物的许多组织细胞都可以产生胶原酶。胶原酶在环境保护上可用于皮革边角废弃物变废为宝，高值转化；在医学研究中可用于治疗腰椎间盘突出症、瘢痕疙瘩、杜普伊特伦症等，具有极大的应用价值。来自溶组织梭菌（Clostridium histolyticum)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)等的胶原蛋白酶已有广泛的研究。目前，已从许多动物组织和微生物中获得胶原蛋白酶5。本研究从屠宰场筛选到一株胶原蛋白酶产生菌，并鉴定为短小芽孢杆菌，现

6、报道如下。1 材料方法1.1 实验材料1.1.1 样品来源分别从雅安市杨皮匠皮革厂、肉市场、农村宰猪厂等处采集土样、水样。1.1.2 试剂型胶原蛋白（SIGMA公司）；柱式细菌DNAout提取试剂盒（绵阳高新区天泽基因工程有限公司）；牛皮：川农兽医院周皓师兄提供的初生小牛的牛皮；水合茚三酮；抗坏血酸；乙酸；乙酸钠；Tris试剂；无水乙醇；三氯乙酸；HgCl2；盐酸；乙二醇甲醚；牛肉膏；蛋白胨；明胶；K2HPO43H2 O； NaH2PO42H2 O ；NaCl；KH2PO4；MgSO47H2O；葡萄糖等。试剂均为分析纯试剂。1.1.3 器材 实验过程中所使用的仪器有：PCR仪；电泳仪；TGL-

7、16G离心机，MS2旋涡混和器，Haier冰箱，DNP-9272型电热恒温培养箱，HZQ-F全温振荡培养箱，洁净工作台，BS210S电子天平，CX210FS1生物显微镜，YX 280A手提式不锈钢蒸汽消毒器，DK-98-1型电热恒温水浴锅，微量加样器，DHG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱，WXZ-UV-2102紫外可见分光光度计，酸度计，以及离心管，EP管，培养皿，接种环（针）等。1.1.4 培养基5种子培养基(1000mL ):牛肉膏 5g, NaCl 5g,蛋白胨 10g, pH 7.27.4富集培养基(1000mL) :明胶 1g, NaCl 5g,蛋白胨 5g, pH 7.27.5初

8、筛培养基(1000mL ):明胶 20g, NaCl 0.1 g,蛋白胨 5g, KH2PO4 0.5g,MgSO47H2O 0.2g， pH 7.27.5 复筛培养基(1000mL ):葡萄糖 20g， 酵母粉 1.5g胰蛋白胨 10g, NaH2PO42H2 O 0.5gCaC12 0.05g, K2HPO43H2 O 2.5g pH 7.07.2固体培养基：在上述液体培养基中加入1.6%琼脂，即成相应固体培养基。1.2 方法51.2.1 胶原蛋白酶产生菌的筛选1.2.1.1配制酸性汞试剂：HgCl2 15g，浓盐酸20g，加蒸馏水定容至100mL。1.2.1.2富集培养 取样品2g或2m

9、l，用生理盐水18 mL浸泡摇匀后放置10min，在沸水浴中处理5 min，冷却后按0.5%的量（即100 u L）取悬浮液接种装有富集培养基的三角瓶中，180r/m, 37摇瓶培养2d。1.2.1.3胶原蛋白酶产生菌的初筛将富集培养液梯度稀释：取8支试管各装9mL蒸馏水，依次编号，灭菌，无菌操作下取1mL富集培养液加入1号管中充分混匀，再从1号管中取1mL混合液加入2号管中混匀，再从2号管中取1mL混合液加入3号管中混匀，直到8号管也充分混合后，取10-6，10-7，10-8三个梯度浓度的稀释液各50uL进行涂布初筛平板，涂布均匀后放入37温箱中培养约24h。观察菌落生长情况，选取具有隐约透

10、明圈的菌落，转接平板，编号记录。将初筛菌在37温箱中培养24 h，在平板菌落周围滴加酸性汞试剂，如菌落周围出现透明圈者为阳性，即是要初步分离得到的菌，大约在滴加试剂后10秒就会出现透明圈。挑选明胶水解圈与菌落直径比值较大的菌株保存。1.2.1.4胶原酶活性定性测定 胶原蛋白酶能分解明胶，从而使菌落周围产生一个被分解了的圆圈，酸性汞试剂能与明胶反应产生白色物质，而不会与明胶分解后的产物产生白色物质，故在能分解明胶的菌落周围滴加酸性汞试剂后会产生一个透明水解圈，水解圈与菌落的直径比越大，可基本说明该菌产生的酶活力或酶数量越大，以此初步判断出目的菌。1.2.1.5牛皮消化实验挑选明胶水解圈与菌落直径

11、比值较大的菌株，分别接种于种子培养基中，37培养2d。剪取各约0.5g重的新鲜小牛皮，灭菌后装入试管，每管加入种子培养基上清液各2 mL（4000r/m离心10min），并标上对应的号，另取一管加入2 mL无菌种子培养基作为对照，盖上棉塞，室温放置2d，期间可每12h摇动一次，以便牛皮与酶液充分接触。两天后取出牛皮进行对照观察。1.2.2 酶液的制备（复筛） 在平板上勾取一环消化牛皮效果最好的COL-J菌株，接种于20mL/150mL的种子培养基中，在37，180转条件下摇瓶培养12h，再按0.5%的接种量接种到20mL/150mL的复筛培养基中，摇瓶培养48h。4000rpm, 10min离

12、心后，取上清液测定胶原蛋白酶活力。1.3 胶原蛋白酶活性检测1.3.1 溶液制备(1)还原茚三酮的制备:称取5g水合茚三酮，用125mL蒸馏水溶解，得黄色溶液.将5g抗坏血酸用250mL蒸馏水溶解。在电磁搅拌下将抗坏血酸溶液滴加到水合茚三酮溶液中，滴加过程中不断有沉淀出现，滴加完后室温下继续搅拌15min，放入冰箱中冷却5min，过滤，沉淀用蒸馏水洗涤3次，收集沉淀，真空干燥。（尽量在避光条件下迅速完成）。(2) 茚三酮显色液:称取85mg茚三酮和15mg还原茚三酮，溶解于10mL乙二醇甲醚，避光低温保存。(3) 2mol/L pH5.4乙酸缓冲液:86mL 2mol/L乙酸钠加入14mL2m

13、ol/L乙酸，混匀。(4)底物溶液:取20mg酸溶性III型胶原溶于20mL 0.01 mol/L乙酸溶液中，避光低温保存。(5) 0.lmol/L pH7.5Tris-HC1缓冲液(含50mmo1/L CaC12)(6) 60%乙醇溶液：60mL无水乙醇中加入蒸馏水定容至100mL。(7)30%三氯乙酸6：取15mL氯乙酸，加入蒸馏水定容至50mL1.3.2 胶原蛋白酶活力测定 1.3.2.1标准曲线的制定：先配成0.3mol / mL的甘氨酸备用，取6支试管按表1编上号加样。 表1 甘氨酸标准曲线试管号012345甘氨酸（mL）00.250.50.7511.25蒸馏水（mL）1.51.25

14、1.00.750.50.25浓度（mol / mL）00.050.10.150.20.25将0.5mL含上述浓度的甘氨酸溶液与0.5mL, 2mol/L乙酸缓冲液充分混匀，加入0.5mL茚三酮显色溶液，充分混合后，盖住试管口，在100水浴中加热15min，用自来水冷却。放置510min后，加入1.5mL 60%乙醇稀释。充分混匀后，570nm处比色。1.3.2.2酶活的测定：以酸溶性III型胶原为底物，先将配好的胶原稀释20倍；将上述准备好的酶液稀释400倍。反应体系为：稀释胶原150uL，0.1 mol/ L pH 7.5 TrisHCI(含50mmol/L CaC12) 100uL，酶液5

15、0uL, 37反应30min，等体积（300uL）30%三氯乙酸终止反应，以先加终止液的相同反应物为对照，加入0.6 mL, 2mol/L乙酸缓冲液充分混匀，再加入0.6mL茚三酮显色溶液，充分混合后，盖住试管口，在100水浴中加热15min，用自来水冷却。放置510min后，加入1.8mL 60%乙醇稀释。充分混匀后，570nm处比色。茚三酮显色法测定反应所释放的水溶性氨基酸、短肽，以甘氨酸显色制定标准曲线。酶活力单位定义为:在37, pH7.5条件下，1mL酶液每分钟水解胶原产生相当于1mol甘氨酸的酶量为1个酶活力单位(U)。1.4 细菌鉴定将菌株COL-J进行形态学、生理生化试验和分子

16、遗传学鉴定。1.4.1 菌体形态观察：将COL-J菌接种到初筛平板上37培养24h，观察菌落形态；接种于种子培养基中37，180r/m摇瓶培养12h，做革兰氏染色观察7。1.4.2生理生化试验：以一株标准短小芽孢杆菌为对照，对COL-J菌的部分生理生化特征进行实验观察。根据分离菌的菌落和菌体形态，芽孢的有无和着生情况，以及生理生化反应，按东秀珠常见细菌系统鉴定手册进行初步分类8 。1.4.3 16S rDNA的PCR扩增生物细胞DNA分子的一级结构中既具有保守的片段，又具有变化的碱基序列,保守的片段反映了生物物种间的亲缘关系，而高变片段则能表明物种间的差异这些核苷酸序列则是不同分类级别生物(如

17、科、属、种)鉴定的分子基础，以16SrDNA为聚合酶链式反应(PCR)扩增的靶分子进行细菌快速分类鉴定，与其它细菌鉴定方法比较，具有高效、准确、简便、特异性强的优点9。1.4.3.1细菌总DNA的提取将菌种接种于20mL/150mL种子培养基，37 180r/m培养12 h，按如下柱式DNA out抽提试剂盒使用手册提取菌株COL-J的总DNA：(1)取1mL菌液离心1 min后，重悬于0.6mL溶菌液中，吹打均匀，37保温30 min。(2)13000g离心10 min后弃上清夜。(3)加入300uL溶液A到细菌沉淀中，吹打均匀。(4)加入150uL溶液B到离心管中，颠倒数次混匀后溶液中将有

18、白色丝状悬浮物产生。(5)65水浴放置3-5min。(6)加入200uL氯仿，震荡混匀30秒，溶液呈乳白色。(7)13000g室温离心2min，上清透明，中间层有白膜，小心转移上清到新的离心管中，避免触及中间的白膜。(8)加入1.5倍体积（约0.6mL）的通用上柱夜到上清中，颠倒混匀全部转移到离心吸附柱中，室温放置4min。(9)13000g室温离心1min，DNA吸附在离心吸附柱的膜上，倒弃收集管中的穿透液。(10)将0.5mL通用洗柱液加入离心柱中，13000g室温离心1min，弃穿透液。(11)重复第10步操作一次。(12)空甩半分钟，将离心吸附柱转移到新的离心管中。(13)加50-10

19、0uL自备TE（pH8.0），室温放置3-5min。(14)13000g室温离心1min即得DNA溶液。1.4.3.2 16S rDNA 的PCR扩增和序列测定 上游引物序列：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3下游引物序列：5-TACGG（C/T）TACCTTGTTACGACTT-3PCR反应体系（25uL）为：10buffer2.5uL, 25umol 的MgCl2 0.5uL，2.5mmol dNTP0.5uL，上游引物1uL,下游引物1uL, DNA0.5uL，5U/uL的Taq酶0.5uL，超纯水17.5uL。PCR扩增程序为：95预变性5min；9545sec，5630

20、sec，721.5min，循环30次；72延伸10min。PCR产物送上海英骏 (invitrogen)生物技术有限公司进行序列测定。1.4.3.3 序列比对将16S rDNA测序结果在GenBank的核酸数据中进行同源性比对。2 结果 2.1 胶原蛋白酶产生菌的筛选及牛皮消化试验从雅安市皮革厂、肉市场、农村宰猪厂等处采集土样、水样共5份，经生理盐水浸泡，明胶富集培养后，梯度稀释涂布于初筛平板上。共分离到49株产明胶酶菌株。挑选水解圈直径与菌落直径比值较大的菌来进行种子液培养，将发酵液对重约0.5g的新鲜小牛皮作室温消化。从中筛选到5株对牛皮消化效果好的菌株， 其中加入COL-J菌上清液的牛皮

21、被很充分的消化了，是效果最好的一管，仅剩很薄的与毛连接的皮肤，而加无菌种子培养的对照组，牛皮则无明显变化，说明COL-J上清液中确有能消化牛皮的酶，而小牛皮中含有大量的胶原蛋白，可以判定COL-J产生了胶原蛋白酶，而且效果很好。图1 牛皮消化实验对照结果（图中最左为COL-J菌消化了的牛皮，右为对照实验）2.2 甘氨酸浓度标准曲线 本研究是以茚三酮显色法测定酶反应释放氨基酸或短肽的量为标准测定胶原蛋白酶活性的，因此先进行了茚三酮显色法测定已知甘氨酸浓度，以此作出标准曲线。将甘氨酸标准液依次稀释为0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25mol /mL，并在显色后在570nm处测光密度

22、吸收值，结果见下表2和图2。表2 甘氨酸标准液的光吸收值试管号：0 12345浓度（mol /ml）： 00.050.10.150.20.25测得A值： 00.1320.2590.3860.5020.625图2 甘氨酸浓度标准曲线2.3 酶活测定结果 用茚三酮显色法在570nm处测定的酶液的光密度吸收值为实验组：A1=1.054，对照组A2=0.712，A:0.342，根据酶活力单位的定义，计算后得到酶的活力是：35.97 U/mL。计算公式是： U=(A-0.0058)/2.4926/30N20（U为胶原蛋白酶活力（U/mL）；A为样品净吸光值；N为酶液的稀释倍数。公式中的20是将50 uL

23、酶液换算成1mL，而不是的20倍稀释倍数。）2.4 菌种的鉴定 2.4.1 菌落形态挑取该菌接于初筛平板上37培养24h，菌落显圆形，边缘不整齐，表面干燥有褶皱，无粘性，不透明，灰白色，滴加酸性汞试剂能产生透明水解圈，菌落直径约0.70cm，透明水解圈直径约2.60cm，见图3。 图3 菌落及水解图（左为平板菌落图，右为平板菌落水解圈图）2.4.2 显微镜观察 图4 COL-J菌显微镜下观察图（箭头所指为芽孢）革兰氏染色表明，该菌为革兰氏阳性菌，菌的大小为2um3um1um，短杆状，两端钝圆，无鞭毛和荚膜，长短不很一致，成单或是成短链排列，芽孢椭圆位于菌体两端，结果见图4。2.4.3 生化鉴定

24、菌株COL-J的 VP试验阳性；能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇；能水解明胶；不能利用丙酸盐； 吲哚、苯丙氨酸脱氨酶试验阴性；不需要KCl和NaCl；能耐受7%NaCl；最适温度3040；生长温度范围为1050（见表3）。表3 短小芽孢杆菌鉴定结果鉴定指标短小芽孢杆菌标准菌株鉴定结果COL-J鉴定结果鉴定指标短小芽孢杆菌标准菌株鉴定结果COL-J鉴定结果接触酶硝酸盐还原厌氧生长形成：吲哚V-P测定需要Nacl和KclV-P培养物终pH：7生长pH：6.8营养肉汤产酸：D葡萄糖5.7营养肉汤L阿拉伯糖生长NaCl：2D木糖5 D甘露醇7葡萄糖产气生长温度：5水解：酪朊ND10明胶30淀粉40

25、利用：柠檬酸盐ND50d丙酸盐55酪氨酸水解ND65苯丙氨酸脱氨酶有溶菌酶时生长dND卵黄卵磷脂酶NDH2+CO2或CO自养生长ND注：d：1189菌株为阳性；ND：未测定；NG：不生长。根据上述形态学及生理生化特性比较，参考常见细菌系统鉴定手册，将菌株COL-J初步鉴定为短小芽孢杆菌。2.4.4 16s rDNA的扩增3.4.4.1 PCR扩增 以菌株COL-J的总DNA为模板，进行PCR扩增，得到约1.5Kb的特异性扩增产物，得到PCR电泳图如图5。图5 16SrDNA的PCR产物电泳图2.4.4.2 测序结果PCR产物测序结果表明，测序片断长1513bp，具有典型的16SrDNA的特征。

26、将该序列登录到GenBank，登录号为EF197942。采用Blasting，将该序列与GenBank的核酸数据中进行同源性比对。结果表明，该序列与短小芽孢杆菌16SrDNA同源性为96%-100%。agagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggacagaagggagcttgctcccggatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggagctaataccggatagttccttgaaccgcatggttcaaggatga

27、aagacggtttcggctgtcacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgcaagagtaactgcttgcaccttgacggtacctaaccagaaagc

28、cacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggt

29、agtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaaccctagagatagggctttcccttcggggacagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgc

30、aacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggctgcgagaccgcaaggtttagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgcaacacccgaagtcggtgaggtaacctttatggagccagccgccgaaggtggggcagatgattggggtgaagtcgtaacaaggtagccgta根据上述形态学、生理生化特性和16SrDNA的比对结果，将菌株COL-J鉴定为短小芽孢杆菌。3 讨