预制检测板MTT法检测癌患者外周血淋巴细胞化疗药物灵敏性的研究.docx

1、预制检测板MTT法检测癌患者外周血淋巴细胞化疗药物灵敏性的研究预制检测板MTT法检测癌患者外周血淋巴细胞化疗药物灵敏性的研究 李胜水，于翠珍，崔克勤，张凤梅 【摘要】 目的：基于众多文献报导MTT法化疗药敏测定中癌细胞抑制率与外周血淋巴细胞抑制率呈正相关，探讨预制检测板MTT法在检测癌患者外周血淋巴细胞药物灵敏性中的价值，以推动检测标准化与指导临床化疗用药。方式：应用泰伦公司生产的MTT法肿瘤细胞药敏预制检测板，对75例癌患者外周血淋巴细胞进行20种药物的药敏检测，操作方式按预制检测板利用说明书。结果：39例肺癌患者外周血淋巴细胞对化疗药物灵敏性，由高到低前5名依次为：卡氮芥(BCNU)，紫杉

2、醇(PTX)，阿霉素(ADM)，长春瑞滨(NVB)和表阿霉素(eADM)；25例乳腺癌患者外周血淋巴细胞对化疗药物灵敏性，前5名依次为：BCNU，PTX，NVB，ADM和米托蒽醌(MIT)；11例胃癌患者外周血淋巴细胞对化疗药物灵敏性，前5名依次为：PTX，ADM，BCNU，eADM和阿糖胞苷(Ara-C)。结论：该MTT法预制检测板适用于癌患者药物灵敏性实验，对临床癌患者个体化化疗有重要指导意义。 【关键词】 抗肿瘤；MTT法试剂盒；化疗药物灵敏实验；淋巴细胞Study on MTT Prefabricated Plate for Chemosensitivity in Peripheral

3、 Blood Lymphocyte with Cancer PatientsAbstract：Objective Based on lots of reports of MTT chemosensitivity assay demonstrating that the inhibited rates between cancer cells and peripheral blood lymphocytes showed positive correlation，to explore the value of the MTT prefabricated plate in peripheral b

4、lood lymphocytes for three kinds of cancer patientsMethods Using Talent MTT prefabricated plate，75 peripheral blood lymphocyte samples from three kinds of cancer patients were analyzed by chemosensitivity assay with 20 anticancer drugsResults To 39 lung cancer patients，5 anticancer drugs had higher

5、sensitivity and were BCNU，PTX，ADM，NVB and eADM;to 25 breast cancer patients，the 5 anticancer drugs were BCNU，PTX，NVB，ADM and MIT;to 11 gastric cancer patients，they were PTX，ADM，BCNU，eADM and Ara-CConelusion The MTT prefabricated plate is applicable for the chemosensitivity assessment of peripheral b

6、lood lymphocytes with the cancer patients and is of important reference value to choose chemotherapeutic drugs in clinicKey words：Antitumor；MTT kit；Chemosensitivity test;Lymphocyte 癌症严峻要挟着人类健康。化学药物医治是医治癌症的有效方式之一。国内外大量医学实践证明，用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法对癌细胞进行药物灵敏性测定，可在化疗前判定癌患者个体对药物的灵敏性和耐药性，是避免盲目用药、提高化疗成效，最大限度减少毒副作

7、用的有效方式。最近几年来，有众多文献报导MTT法化疗药敏测定中癌细胞抑制率与外周血淋巴细胞抑制率呈正相关1-9，从而为无法取得肿瘤组织标本的患者开展药敏测定，指导其个体化疗提供了靠得住依据。可是，上述测定均为各研究小组自行制作药敏检测板，检测板的预处置和药物用量各不相同，亦无标准化的操作方式，难以在临床普遍应用。咱们采纳泰伦生物科技(石家庄)生产、具有国家发明专利的MTT法肿瘤细胞药敏预制检测板11，对一批癌患者外周血淋巴细胞开展了化疗药物灵敏性测定研究，取得了专门好的结果，现特报告如下。1 材料与方式11 材料111 标本来源 取自沧州中西医结合医院，2004年11月至2005年3月共75例

8、经病理检查确诊的癌患者(其中肺癌39例，乳腺癌25例，胃癌11例)的新鲜外周血。患者中男性40例，女性35例，年龄29岁78岁，平均年龄575岁。112 试剂 “肿瘤化疗药物灵敏检测”MTT法试剂，泰伦生物科技(石家庄)产品，批号：041025。要紧包括：每人份含预包被20种化疗药物的微孔检测板(A、B)各一块；DMEM完全培育液1瓶；MTT试剂1支；二甲基亚砜(DMSO)1瓶。20种药物名称：卡氮芥(BCNU)，紫杉醇(PTX)，阿霉素(ADM)，长春瑞滨(NVB)，表阿霉素(eADM)，米托蒽醌(MIT)，阿糖胞苷(Ara-C)，顺铂(CDDP)，环磷酰胺(CTX)，5-氟尿嘧啶(5-FU

9、)，长春新碱(VCR)，足叶乙甙(VP-16)，甲氨喋呤(MTX)，卡铂(CBDCA)，平阳霉素(PYM)，氮烯咪胺(DTIC)，羟基喜树碱(OPT)，异环磷酰胺(ICTX)，草酸铂(L-OHP)，双氟胞苷(GEM)等。113 要紧仪器 CO2细胞培育箱(MCO-15A)，日本Sanyo公司产品；倒置显微镜(XDS-1B)，重庆光学仪器厂产品；酶联检测仪(DNM-9602)，北京普朗公司产品。12 方式121 淋巴细胞悬液的制备 无菌取肝素抗凝外周血5 ml，沿管壁缓慢加入到含6 ml淋巴细胞分离液的离心管中，两液之间形成界面；2 000 rmin离心20 min，搜集分离液界面上富含淋巴细胞

10、的液体加于另一离心管中，1 000 rmin离心7 min，弃上清；淋巴细胞用GKN液洗涤二次后加入DMEM完全培育液，配制成细胞数5105ml的单细胞悬液。122 MTT法药敏实验 提早将A、B预制检测板从冰箱中掏出，平稳至室温。按预制检测板利用说明书操作：将淋巴细胞悬液均匀地加入检测板微孔中(每孔200 l)，每种药物设2个复孔，另设空白对照与调零孔；检测板置37 ，5CO2的培育箱内培育48 h后，每孔加入MTT试剂20 l，轻轻混匀，继续培育6 h12 h(其间应多次用倒置显微镜观看细胞还原情形，以决定终止反映，上述进程必需严格无菌操作。然后掏出检测板，1 000 rmin离心15 m

11、in。弃去上清，每孔加入DMSO 100 l，充分震荡至微孔内的紫色结晶全数溶解，用酶联检测仪在570 nm上读取各孔光密度(OD)值，按以下公式计算相对抑制率(IR)：相对抑制率(IR)=1-给药孔平均OD值 对照孔平均OD值100%123 检测结果的判定与分析 依照计算出的IR值按以下标准判定每种药物的灵敏性：IR>50：高度灵敏；30IR50：灵敏；IR<30：不灵敏；采纳均数标准差(s)进行结果分析。2 结果三种癌患者外周血淋巴细胞对化疗药物的灵敏性存在明显的个体不同。化疗药物BCNU，PTX，ADM，NVB，eADM对肺癌患者外周血淋巴细胞抑制作用较强；BCNU，PTX，

12、NVB，ADM，MIT对乳腺癌患者外周血淋巴细胞抑制作用较强；PTX，ADM，BCNU，eADM，Ara-C那么对胃癌患者外周血淋巴细胞抑制作用较强：而BCNU，PTX，ADM三种药物对上述三种癌患者外周血淋巴细胞都具有较强的抑制作用。与之相反，药物ICTX，VP-16，MTX，CTX，DTIC对肺癌患者外周血淋巴细胞抑制作用较弱：DTIC，OPT，CBDCA，ICTX，CTX对乳腺癌患者外周血淋巴细胞抑制作用较弱；DTIC，ICTX，VP-16，OPT，CTX那么对胃癌患者外周血淋巴细胞抑制作用较弱；而DTIC，ICTX，CTX对上述三种癌患者外周血淋巴细胞都仅有较弱的抑制作用。39例肺癌患

13、者外周血淋巴细胞的药敏检测结果详见表1；三种一起灵敏药物对三种癌患者外周血淋巴细胞的抑制率详见表2。表1 20种化疗药物对39例肺癌患者外周血淋巴细胞的药敏检测结果(略)表2 三种灵敏药物对三种癌患者外周血淋巴细胞的抑制率(略)3 讨论癌具有异质性，临床上迫切需要挑选灵敏药物进行个体化化疗。国内外大量癌医学研究证明，用MTT法直接检测癌细胞药物灵敏性，与体内符合率高，的确是选择最适药物，减少用药盲目性，提高化疗成效的重要手腕。最近几年来，针对众多术后患者或病灶标本过小等缘故无法用癌细胞进行实验的现实，一些小组开展了用患者外周血淋巴细胞替代癌细胞做药敏实验的研究，涉及肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、肾

14、癌、结肠癌、膀胱癌、睾丸癌、神经胶质瘤和骨血瘤。实验结果说明，对同一种药物，癌细胞抑制率与外周血淋巴细胞抑制率呈正相关，并具有明显的统计学意义19。泰伦生物科技(石家庄)的科研人员通过近三年的研究，研制出“一种肿瘤细胞药敏检测方式及其检测板”并已取得国家发明专利，目前预制检测板已小批量生产。上述功效为本文工作的开展提供了依据和标准化检测工具。目前，在乳腺癌外周血淋巴细胞与癌细胞药物抑制率是不是正相关方面存在必然不合，马玉彦，杨琨等以为两种细胞抑制率存在明显的正相关关系，相关系数别离为0908 20690 1和0906 80691 12，4；吕青等那么以为除VCR外，其他药物对两种细胞的抑制率无

15、相关性10。咱们的检测结果显示，BCNU，PTX，NVB，ADM，MIT对25例乳腺癌患者外周血淋巴细胞抑制作用较强；另外，咱们还对另8例乳腺癌患者的组织癌细胞做了药敏实验，所得结果为BCNU，PTX，5-FU，ADM，MIT的抑制作用较强，有四种药物与淋巴细胞的相同(具体数据略)，在必然程度上反映出二者具有正相关性。咱们尔后还将作进一步研究探讨。据文献12，MTT法药敏实验与临床短时间疗效总一致性达85。因此，MTT法药敏检测的结果，在指导临床化疗用药方面的确具有重要作用和较大的参考价值。可是，鉴于体外实验结果与化疗药物在体内的作用有必然的不同，具体临床应历时，需将实验结果与患者临床资料相结

16、合，综合制定合理的化疗方案1。【参考文献】 1 皇甫超申，王玉兰.外周血淋巴细胞与癌细胞化疗药物灵敏性实验在肝癌患者中的应用J临床荟萃,2004,19(2)：79 802 马玉彦，李殿俊，刘巍，等肿瘤患者外周血淋巴细胞替代癌细胞体外检测抗癌药敏的相关性研究J有效肿瘤学杂志，1999，13(1)：19 213 袁晓兰，王艳萍，姜曙，等.外周血淋巴细胞和肿瘤细胞体外化疗药敏相关性研究J.华西医科大学学报,2000,31(3)：338 3404 杨琨，傅庆国，张松鹤.利用肿瘤患者外周血淋巴细胞检测抗癌药敏的实验研究J中国医科大学学报,2002,增刊：685 王静，王秋波胃癌患者外周血单个核细胞替代癌

17、细胞的体外化疗药敏实验J青岛大学医学院学报,2001，37(4)：303 3056 王艳萍，陈晓禾，周清华，等肺癌患者外周血淋巴细胞与癌细胞体外化疗药敏实验研究J中国肺癌杂志,2004,7(6)：480 4827 王艳萍，袁晓兰，陈晓禾，等肿瘤患者外周血淋巴细胞与肿瘤细胞体外化疗药敏研究J肿瘤防治杂志,2004,11(5)：515 5178 吕雅蕾，刘巍，艾军，等胃癌肿瘤细胞与外周血淋巴细胞体外药敏实验的相关性研究J河北医科大学学报,2004，25(3)：152 1539 屠重棋，袁晓兰,王艳萍，等.外周血淋巴细胞和骨血瘤细胞体外化疗药敏相关性研究J中国肿瘤临床杂志,2003,30(3)：194 196.10 吕青，袁晓兰，陈国经，等.乳腺癌患者外周血淋巴细胞与肿瘤细胞体外化疗药敏相关性研究J同济医科大学学报,2001，30(4)：358 35911 崔克敏中华人民共和国国家知识产权局发明专利公报，2003，19(29)：84.12 张胜本，张连阳.肿瘤化学医治灵敏性与抗药性M.成都：四川科学技术出版社，1995.