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1、Flt3基因突变与急性髓系白血病发生和预后的关系Flt3基因突变与急性髓系白血病发生和预后的关系【关键词】 Flt3基因；基因突变；急性髓系白血病 Fms样酪氨酸激酶3 ( Fms-like tyrosine kinase 3，Flt3)是型受体型酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)家族成员之一，在正常造血及免疫系统发育中起着重要作用。Flt3基因突变与急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)的发生、预后密切相关。以Flt3作为靶分子已成为AML治疗的一种新策略。1 Flt3基因结构与功能1.1 结构 人类Flt3基因又称

2、作胎儿肝脏激酶-2 (Fetal liver kinase-2，FLK-2)1和人类干细胞激酶-1 (human stem cell kinase-1，STK1)2，位于染色体13q12，全长约100 kb，含有24个外显子，编码993个氨基酸的蛋白质。Flt3蛋白有分子量为143KD的糖基化高甘露醇形和分子量为158KD的复合糖形两种形式，前者存在于胞内，经过糖基化过程后形成后者，并定位于膜上。后者是Flt3在细胞表面的主要存在形式。 Flt3与其它型RTK如kit 、fms、PDGF 受体有相似的结构，包含由胞外区、跨膜区和胞内区3部分组成。胞外区是胞外配体结合区，由5个免疫球蛋白样结构域

3、组成；跨膜区有不连续的激酶作用的位点；胞内区为酪氨酸激酶催化区，由1个胞内近膜结构域( juxtamembrane domain， JM)、2个被插入结构域分开的激酶结构域(tyrosine kinase domain，TKD)和1个C末端结构域构成3。近年来的研究表明JM结构域对维持激酶催化中心空间结构稳定性起主要作用，对激酶活性有负调控作用4。图1 Flt3信号转导途径1.2 功能 Flt3在胸腺、肝、脾、淋巴结、胎盘、大、小脑、生殖腺等多种组织中表达。在正常人骨髓中Flt3的表达仅限于CD34干/祖细胞，在红细胞系及成熟T、B淋巴细胞、NK细胞中无表达5。Flt3配体为FL(Flt3 l

4、igand)。无FL存在时，近膜结构域对Flt3二聚体形成和活化起着抑制作用。当FL与Flt3受体结合，后者发生二聚体化，激酶结构域的活化环(activation loop，A-loop)构象发生改变，酪氨酸残基自身磷酸化。激活的Flt3通过SHC与GRB2结合而激活RAS，从而进一步激活下游的效应因子如RAF、MAPK/ERK激酶。这些下游效应因子激活核因子CREB、ELK、STATs，使造血干细胞发生增殖和活化。此外，激活的Flt3也可以激活PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase)和RAS途径，导致增殖加快，细胞凋亡抑制6，见图1。这两种信号途径通过RAS的联

5、系提示了Flt3与白血病发生有关。2 Flt3基因突变 Flt3基因突变是造成Flt3基因异常活化的主要原因。其突变形式主要表现为两种：近膜结构域内部串联重复(internal tandem duplications， ITDs)突变和TKD或/和JM的点突变(point mutation，PMs)。两种突变均可造成Flt3酪氨酸激酶的结构性活化，见图2。图2 Flt3基因突变常见类型Flt3/ITDs是Flt3基因AML中最常见的突变类型，常出现在外显子11，也可累及内含子11和外显子127。也有报道Flt3/ITD位于外显子14和15，而非外显子11和12810。Flt3/ITDs的插入长

6、度具有多态性，其长度在3400bp之间不等，但串联复制的碱基数多是3的倍数，极少产生框移突变，因而不影响开放阅读框架(open reading frame，ORF)的正常翻译过程11,12。Flt3/ITDs使得Flt3基因持续活化的原因可能的是：(1)Flt3/ITDs造成了近膜结构域的结构改变，从而破坏了近膜结构域的自我抑制功能13。(2)Flt3/ITD突变可以使细胞外的C末端的构象发生变化，有利于Flt3二聚体的形成，导致配体非依赖性磷酸化。Flt3因磷酸化而酪氨酶激酶活性增强，导致酪氨酸残基自发激活发生磷酸化作用，激活下游信号通路，如RAS信号转导途径和转录激活因子5 信号转导途径，

7、促进细胞增殖并与AML的进展存在密切相关14，见图3。第3期王杰.Flt3基因突变与急性髓系白血病发生和预后的关系图3 Flt3基因突变信号转导示意图在一些无Flt3/ITDs的AML患者中也存在配体非依赖性的Flt3基因组成性激活，说明除Flt3/ITDs之外，可能还存在有其他类型突变导致Flt3基因激活。近年来国内外的研究表明约6.4%7.7%的患者出现TKD或/和JM结构域的点突变，同样可以导致Flt3基因配体非依赖性激活15,16。 TKD点突变，常发生于激酶结构域活化环内，通常为氨基酸残基的突变，插入和缺失，最常见的是D835是第一个核苷酸G被T替代，即D835Y17。此外还有D83

8、5V18、D835H19、D835E20、D835N21等。最近，在AML中又发现了两种新的活化环点突变，一种是第836位I的缺失，另一种是第836位I被M替换同时被R插入22。这两种新的点突变与D835一样，突变也位于第2个酪氨酸激酶的活化环内，都能导致无配体情况下受体自身磷酸化，通过激活STAT5信号转导途径而抑制白血病细胞的凋亡23。 JM点突变发生频率不高，目前尚无大量的临床研究统计学数据。已见报道的突变类型有V579A、V592A、F594L和F590GY591D等24,25。研究表明JM点突变可以降低JM区对激酶活性负调节作用，从而使Flt3持续活化并激活下游信号途径，如STAT5

9、26。研究也发现JM点突变与Flt3/ITDs相比，对细胞的增殖作用较小，且受体自身的活化程度也较弱，推测可能是JM点突变对近膜结构域的破坏较小，未造成自我抑制功能的完全丧失27,28。3 Flt3基因突变与AML 急性白血病是儿童最常见的恶性肿瘤，发病率为3/10万，其中AML约占20%30%。近几年来，随着环境致癌因素的增加，AML的发病率及死亡率均呈上升趋势。目前AML的发生机制仍未完全阐明，但随着研究的不断深入，Flt3基因突变在AML发生、预后中的作用日益受到重视。3.1 Flt3基因突变与AML发生 Flt3与其配体FL结合后能通过信号传导途径对造血发育起重要的调控作用，能调节多能

10、造血干细胞、早期前体细胞及不成熟淋巴细胞的生长。1996年，Nakao等首先报道AML患者Flt3基因编码的近膜区(JM)存在Flt3/ITDs29。此后的国内外报道显示Flt3基因在70%90%的AML患者细胞中出现异常表达，其中20%25%的AML患者Flt3基因发生了Flt3 /ITDs，并见于AML 各亚型，其中以M3和M5多见，且突变率各异30。我们的研究发现在儿童白血病患者中Flt3阳性率80.33%，其中Flt3/ITDs突变率为17.21%；各亚型突变率分别为M0 42.86%、M1 22.22%、M2 12.90%、M4 44.44%和M5 15.38%。说明儿童AML在外显

11、子11处发生Flt3/ITDs的频率极高，是儿童AML发生的主要原因31。 目前，Flt3异常表达和基因突变导致AML发生的分子机制尚不完全清楚。目前大量的临床研究证实Flt3/ITDs常集于JM区中从密码子589599富含酪氨酸残基的一段区域，从首尾相按顺序插入若干个复制的核苷酸。研究显示在AML细胞株研究中，Flt3/ITDs可抑制c/EBPa ( repression of CCAAT/ estradiol-binding protein )和Pu.1的表达，阻滞髓源细胞分化；应用Flt3/ITDs抑制剂处理AML细胞株后c /EBPPu.1表达增强32。进一步的研究证实Flt3/ITD

12、s可干扰激酶磷酸化信号通路，使STAT5 ( singal transducer and activator of transcrip tion 5)活化增强以及c /EBP和Pu11表达抑制33。说明Flt3/ITDs有利于Flt3二聚体的形成，引起配体非依赖性磷酸化，在AML的发病机制中起重要作用。沈 阳 医 学 院 学 报第12卷3.2 Flt3基因突变与AML预后 近年来大量临床研究表明，Flt3/ITDs与AML预后密切相关。Gale等30的结果显示Flt3/ITDs突变阳性AML患者与阴性组比较外周血WBC计数显著增高，CR 率显著降低，化疗相关死亡率高，复发危险增高，无病生存率、

13、无事件生存率及总生存率均显著降低。我们采用PCR方法联合序列检测伴有或不伴有染色体易位的AML患者Flt3基因突变情况，结果显示：46例伴有染色体易位患者Flt3基因表达阳性率67.39%，其中Flt3/ITDs阳性率分别为26.09%；伴有染色体易位Flt3/ITDs阳性患者外周血白细胞、血红蛋白、血小板、骨髓粒细胞比例虽与不伴有染色体易位Flt3/ITDs突变阳性患者基本相似，但平均生存时间明显降低，仅为(8.91.5)个月34。如Flt3/ITDs阳性行自异体基因造血干细胞移植的AML患者无病生存率明显提高35。提示Flt3/ITDs既可作为预测AML预后的一个重要指标，也可以指导临床治

14、疗。3.3 Flt3基因突变与AML微小残留病灶检测 随着急性白血病化疗方案的改善和造血干细胞移植的进展，急性白血病的完全缓解(CR)率明显提高。然而仍有许多CR患者在数年内复发，其主要原因是血液学CR后体内仍残留106109白血病细胞，称为微小残留病(minimal residual disease，MRD)。现在普遍认为MRD是血液学CR乃至持续完全缓解(CCR)期间白血病复发的根源。近年来分子生物学技术的发展，为常规骨髓形态学检查难以检测的MRD提供了新方法，然而目前尚缺乏合适的MRD的检测指标。Flt3/ITDs是与AML发生及预后相关的一种重要因子，可望成为MRD检测的重要标志物。

15、Schnittger等36分析1 003例AML患者，对34例Flt3/ITDs阳性患者进行多次检测Flt3/ITDs后认为大部分患者Flt3/ITDs为唯一可检测的标志，且与临床阶段、FISH、PCR结果有较好的相关性，4例复发患者检测Flt3/ITDs比其他方法提前23个月检测到复发，认为Flt3可作为MRD检测标志。我们用Flt3基因作为AML的分子标志，通过PCR技术跟踪了AML完全缓解后的MRD，结果表明：PCR技术检测Flt3基因的最低检出值为100 pg；Flt3基因阳性AML患者，经标准治疗后，半数左右的患者达到CR，其中绝大部分患者Flt3基因表达减弱或转为阴性；AML患者达

16、CR后Flt3基因表达持续阳性或转阴后再次出现阳性，提示将发生复发37。说明在完全缓解期追踪检测Flt3并分析其变化极为重要，Flt3转为阴性或长期持续阴性者预示能获得长期无病生存。4 结语 Flt3基因突变是AML中最常见的基因异常，与AML发生有着密切关系。Flt3/ITDs有望成为一种新的生物标志物，用于AML预后不良和MRD判定，并可能成为AML治疗的新靶点。【参考文献】 1Rosnet O， Marchetto S， deLapeyriere O， et al. Murine Flt3， a gene encoding a novel tyrosine kinase receptor

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