抗血清制备及抗体效价测定.docx

1、抗血清制备及抗体效价测定 摘要.4 NDV 抗血清制备及抗体效价测定摘要：抗血清，新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。在病毒分类学中的位置属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒属（Paramyxovirus）中的一个种。该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。以新城疫病毒灭活疫苗（Ulster 2C 株）灭活油剂苗多种途径免疫兔和小白鼠，制备新城疫病毒抗血清。也叫免疫血清，是指含有免疫蛋白的血清。抗体效价指抗体的物理状态及其在体内滞留时间，以其与抗原反应的多少

2、来表示其免疫效果。此次实验主要是进行家兔与小鼠的新城疫病毒抗血清的制备过程，并通过酶免疫吸附试验、兔疫印迹实验对其进行抗体效价检测。关键字：NDV 抗血清 抗体效价 免疫【实验过程】本次实验一共分为四个大步骤：Part. NDV 抗血清制备一、实验原理将具有免疫原性的物质注入健康动物体内后，抗原可刺激机体相应 B 细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。待动物血清中存在大量抗体时，采集动物血液，分离析出血清，便得到所需的抗血清（免疫血清或抗体）。由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫血清中实际上是含有多种抗体的混合物，

3、所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体（Polyclonal antibody，PcAb）。多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为了获得特异性强，效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。对于免疫原性较弱的可溶性抗原(如蛋白质类抗原)要加入佐剂，以增强免疫性。本实验介绍新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）抗血清的制备过程。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。在病毒分类学中的位置属于副黏病毒科（Paramyxovirid

4、ae）、副黏病毒属（Paramyxovirus）中的一个种。该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。以新城疫病毒灭活疫苗（Ulster 2C 株）灭活油剂苗多种途径免疫兔和小白鼠，制备新城疫病毒抗血清。二、实验仪器、材料和试剂1. 仪器5mL 无菌冻存管，2.5mL 和 1mL 注射器，塑料静脉插管，碘酒，75酒精棉球，剪刀，止血钳，250mL 无菌三角瓶，50mL 无菌尖底离心管，家兔固定槽，家兔解剖台，棉线，5mL吸头和移液器，温箱，离心机。2. 材料家兔：1-2kg 清洁级雄性或未孕雌免；小鼠：SPF 级 6-8 周龄昆明鼠。3. 试剂鸡新城疫病毒

5、 Ulster 2C 株灭活疫苗（南京梅里亚动物保健公司），0.01M PBS（ pH7.2）（8 g NaCl，0.2 g KCl，2.9 g Na2HPO4.12H2O，0.2 g KH2PO4，以 NaOH 调节 pH 至 7.2，加双蒸水至 1000 mL），麻醉剂：普鲁卡因溶液，硫柳汞。三、方法和步骤（一）NDV 兔抗血清制备1. 家兔捉拿方法动物的捉拿和固定是进行动物实验的基本操作之一，正确的抓取固定动物是为了不损害动物健康，不影响观察指标，并防止被动物咬伤，保证实验顺利进行。家兔习性温顺，除脚爪锐利应避免被其抓伤外，较易捕捉。拿时切忌以手提抓兔耳、拖拉四肢或提拿腰背部。正确的方法

6、是用右手抓住其颈背部皮毛，轻提动物，再以左手托住其臀部，使兔的体重主要落在左手掌心（如图 1）。图 1. 家兔的捉拿方法2. 家兔固定方法家兔的固定，依不同的实验需要，常用兔固定箱或兔手术台固定。兔固定箱通常由木头、铁皮或者树脂材料制成，便于拆卸清洗消毒，一般用于固定兔子狐狸貉子等。使用时时可将家兔置于兔固定箱内，在不需要帮手的情况下单人即可对兔子等动物打耳号，灌药、耳缘静脉注射、取血、或观察耳部血管的变化等，常用于生理、药理和免疫等作动物整体实验时限制实验物的活动。（如图2）图 2. 家兔固定箱固定方法在需要观察血压、呼吸和进行颈、胸、腹部手术时，应将家兔以仰卧位固定于兔手术台上。固定方法是

7、：先以四条 1cm 宽的布带作成活的圈套，分别套在家兔的四肢腕或踝关节上方，抽紧布带的长头，将兔仰卧位放在兔手术台上，再将头部用兔头固定器固定，然后将两前肢放平直，把两前肢的系带从背部交叉穿过，使对侧的布带压住本侧的前肢，将四肢分别系在兔手术台的木柱上。（如图3）图 3. 家兔手术台固定方法3. 初次免疫在家兔足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等部位，选择 610 处免疫接种点，采用皮下、皮内或肌肉注射，每点注射上述鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗 0.10.2mL。如果使用没有加佐剂的灭活新城疫病毒 Ulster 2C 株，也可以采用耳缘静脉注射的方法进行免疫。（如图4）

8、图 4. 家兔耳缘静脉注射方法4. 二次免疫第一次免疫后间隔2周再以鸡新城疫病毒Ulster 2C株灭活疫苗采用与初次免疫相同的方法在家兔足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等部位，选择 610 处免疫接种点，采用皮下、皮内或肌肉注射加强免疫。5. 终末免疫第二次免疫后间隔 2 周再按上述二次免疫方法进行第三次免疫。6. 试血终末免疫免疫 7 天后经兔耳缘静脉采血 2mL，分离血清，用琼脂双向扩散实验测定抗体效价达 1:16 以上（稀释抗体）以上时，即可放血，如效价不高，则加强免疫 l 次后，再行检测。7. 颈动脉放血 将免疫家兔仰面固定于家兔手术台上，头部放低，暴露颈部。沿气管钝性分离

9、皮下组织，暴露气管前的胸锁乳突肌；分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，在肌束下面靠近气管两侧，可见淡红色搏动的颈动脉。（如图5）图 5. 兔颈部血管神经分布图将双侧动脉仔细分离，于每侧动脉分别套入两根棉线，一根在远心端，一根在近心端，（图 6）。图 6. 兔颈部动脉血管先将一侧动脉远心端丝线结扎紧，然后在近心端用止血钳夹住（止血钳头部用细塑料管包裹，避免损伤动脉）。用小的尖头眼科剪在两侧丝线中间的动脉壁上剪开一个小口，以便插入塑料静脉插管（或大号钢针头），再用近心端棉线固定静脉插管，避免其从动脉内滑出；轻轻松开止血钳，血液很快沿导管流入三角瓶，直至血流缓慢点滴而出时，以同法在对侧动脉内插

10、管放血，并将动物固定架后端抬高，增加放血量，一般一只家兔可放血80-100mL。 8. 血清分离将血液置室温中凝固约 1hr，然后置 4过夜，使血块收缩；用 5mL 无菌移液管吸取上层血清，转移至 50 mL 无菌尖底离心管中。然后将血块自容器壁分离，将血清全部倾入另一 50 mL 无菌尖底离心管，在 4下 2,500g 离心 10 分钟，取上清液即血清部分与前述血清混合，将混合血清 41,500g 离心 10 分钟，弃沉淀收集血清。9. 抗血清保存 （1）4保存：将抗血清除菌后，加入 0.0l硫柳汞或 0.1叠氮钠，液体状态保存于普通冰箱，可以存放 3 个月到半年，效价高时，一年之内不会影响

11、使用。 （2）低温保存：将抗血清除菌后，加入等量甘油，放在-20或-40，一般保存 5 年抗体效价不会有明显下降。抗体切忌反复冻融，反复冻融会使抗体效价显著降低。 （二）NDV 鼠抗血清制备1. 小白鼠的捉拿和固定小白鼠较大白鼠温和，虽也要提防被其咬伤手指，但毋需戴手套捕捉。可先用右手抓住鼠尾提起，置于鼠笼或实验台上，用左手的拇指和食指抓住小鼠两耳后颈背部皮肤，将鼠体置于左手心中，拉直后肢，以无名指及小指按住鼠尾部即可。有经验者可直接用左手小指钩起鼠尾，迅速以拇指利食指、中指捏住其耳后项背部皮肤亦可。如操作时间较长，也可固定于小白鼠固定板上。（如图7）图 7. 小白鼠的捉拿和固定2. 初次免疫

12、分别在昆明鼠背部采用肌内、皮下或皮内注射鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗0.2mL，或者腹腔注射鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗 0.2mL。（1）腹腔注射法：小鼠固定后，使腹部朝上，颈部拉直，右手持注射器（56 号针头），从耻骨联合上一侧向头端以 30 度角刺入腹腔（应避开膀胱）。可先刺入皮下 23mm，再刺入腹腔，以防药液外漏。针头刺入部位不宜太高太深，以免刺破内脏。注射量一般为 0.10.25mL/10g 鼠重。图 8. 小鼠腹腔注射法（2）皮下注射法：一般两人合作。一人左手抓住小鼠头部皮肤，右手拉住鼠尾；另一人左手提高背部皮肤，右手持住注射器（针头号同上），将针

13、头刺入提起的皮下。若一人操作，左手小指和手掌夹住鼠尾，拇指和食指提起背部皮肤，右手持注射器给药。一般用量为0.050.25mL/10g 鼠重。图 9. 小鼠皮下注射法（3）肌肉注射法：两人合作时，一人抓鼠方法同上，另一人左手拉直一侧后肢，右手持注射器，注射部位多选后腿上部外侧（针头号同上）。如一人操作，抓鼠方法类似腹腔注射，只是药液注射在肌肉内，每腿的注射量不宜超过 0.1mL。（4）尾静脉注射法：将小鼠置于待置的固定筒内，使鼠尾外露，并用酒精或二甲苯棉球涂擦，或插入 4050温水中浸泡片刻，使尾部血管扩张。左手拉尾，选择扩张最明显的血管；右手持注射器（45 号针头），将针头刺入血管，缓慢给药

14、。如推注有阻力而且局部变白，说明针头不在血管内，应重新插入。穿刺时宜从近为尖部 1/3 处静脉开始，以便重复向上移位注射。一般用药量为 0.10.2ml/10g，不宜超过 0.5ml/10g。图 10. 鼠尾皮下注射法3. 二次免疫第一次免疫后间隔 2 周分别在昆明鼠背部采用肌内、皮下或皮内注射鸡新城疫病毒Ulster 2C 株灭活疫苗 0.2mL，或者腹腔注射鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗 0.2mL。4. 终末免疫第二次免疫后间隔 2 周分别在昆明鼠背部采用肌内、皮下或皮内注射鸡新城疫病毒Ulster 2C 株灭活疫苗 0.2mL，或者腹腔注射鸡新城疫病毒 Ulster 2C

15、 株灭活疫苗 0.2mL。5. 试血末次注射 7 天后鼠眼球采血 0.2mL，分离血清，用琼脂双向扩散实验测定抗体效价达1:16 以上（稀释抗体），即可放血，如效价不高，继续加大剂量，加强 l-2 次后，常可使效价增高。鼠眼球采血可采用以下两种方法：（1）眼眶后静脉丛采血：用 710cm 长的玻璃取血管，其一端内径为 11.5 mm，另一端逐渐扩大，细端长约 1cm 即可，将其尖端折断，使其锋利。将取血管浸入 1%肝素或其它抗凝剂溶液处理，干燥后使用。采血时，右手提免疫后昆明鼠鼠尾，鼠头朝下将鼠旋转离心甩动 1min，左手拇指和食指抓住鼠两耳之间的皮肤使鼠固定，并用中指配合，轻轻压迫颈部两侧，

16、阻碍静脉回流，使眼球充分外突，提示眼眶后静脉丛充血。取用肝素过的医用毛细采血管，右手拇指、食指和中指握住毛细管，将其尖端插入内眼角与眼球之间，轻轻向眼底方向刺入约 23mm，手指旋转捻动毛细管以刺破静脉丛，鼠血顺毛细管流入 1.5mL 无菌离心管中，收集鼠血。采血结束后，拔出取血管，放松左手，出血即停止。用本法短期内可重复采血。小鼠一次可采血 0.20.3 ml，大鼠一次可采 0.50.1ml（图 11）。图 11. 鼠眼眶后静脉丛采血法 （2）眶动脉和眶静脉取血法：右手提免疫后昆明鼠鼠尾，鼠头朝下将鼠旋转离心甩动1min，用镊子拔去一侧鼠眼球，用左手固定动物，压迫眼球，尽量使眼球突出，右手用

17、无钩弯镊子或弯止血钳迅速摘除眼球，立即将鼠倒置，头朝下，眼眶内很快流出血液，将鼠血滴入 1.5mL 无菌离心管中，收集鼠血。注意不要让小鼠流血过多，以免死亡。一般只适用于一次采血。大部动物采血后可以存活，可采另一侧眼球取血。此法既能采取较大量的血液，又可避免断头取血法中因组织液的混入导致溶血的现象，现常取代断头取血法。先使动物眼球突出充血后，以弯头眼科镊迅速钳取眼球，并将鼠倒置，头向下，眼眶内很快流出血液，让血液滴入盛器，直至不流为止。此法由于取血过程中动物未死，心脏不断在跳动，因此取血量比断头法多，一般可取鼠体重 45的血液量，是一种较好的取血方法。（3）剪尾采血：需血量少时可用此方法。将动

18、物固定，显露尾部，将尾尘剪去约 5mm，从尾根部向尾端部按摩，血即从断端流出。若用二甲苯棉球涂擦尾部或事先将鼠尾浸在 45水中数分钟，使尾部血管充盈，可采到较多的血，但注意二甲苯可致溶血。也可用锋利刀片割破尾动脉或尾静脉，让血液自行流出，采血后，消毒，止血。如将动物麻醉取血量可更多些。三根尾势脉可交替切割，并自尾尖向尾根方向切割，小鼠每次采血约 0.1ml。6放血小鼠也可以采取眶动脉和眶静脉取血法放血，此外还可用如下方法： （1）断头取血：当需要较大量的血液，而又不需继续保存动物生命时采用此法。左手捉持动物，使其头略向下倾，右手持剪刀猛力剪掉鼠头，让血液滴入盛器。小鼠可采血 0.81.0ml，

19、大鼠可采用 58ml。（2）心脏取血：动物仰卧固定在固定板上，剪去心前区部位的被毛，用碘酒酒精消毒皮肤。在左侧第 34 肋间，用左手食指摸到心搏处，右手取连有 45 号针头的注射器，选择心搏最强处穿刺，当针刺入心脏时，血液由于心脏跳动的力量自动进人注射器。此法要求实验者掌握以下要点：要迅速而直接插入心脏，否则，心脏将从针尖处滑脱；如第一次没刺准，将针头抽出重刺，不要在心脏周围乱探，以免损伤心、肺；要缓慢而稳定的抽吸，否则，太多的真空反而使心脏塌陷。若不需保留动物生命时，也可麻*醉后切开动物胸部，将注射器直接刺人心脏抽吸血液。7血清分离血清分离方法与（一）8 相同。8抗血清保存抗血清保存方法与（

20、一）9 相同。Part . 琼脂双扩散实验检测抗体效价一、基本原理抗原、抗体在凝胶中扩散，并进行沉淀反应，称为免疫扩散实验（immuno diffusion）。将抗原与其相应抗体加入含有一定电解质的琼脂凝胶平板中邻近孔内，抗原和抗体从小孔向四周自由扩散，当扩散到两者浓度比例合适的部位时，出现白色的免疫复合物沉淀线，即双向琼脂扩散试验。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间浓度比例，而且与其分子大小及扩散速度相关。如果反应材料中有两种以上的抗原抗体系统，则两孔间出现多条沉淀线。此方法最早由 Ouchterlony 提出，因此又称为 Ouchterlony 技术。本次实验将以 WF8

21、3 株酚水抗原检测兔抗 APP 抗血清效价，其中酚水抗原以 APP 的荚膜和脂多糖抗原为主，本方法也是 APP 血清学分型的常用方法。二、实验仪器、材料和试剂1. 仪器11cm 平皿，200L 微量可调移液器和吸头，打孔器，针头，1.5mL eppendorf 管，50 mL离心管，离心管架，温箱，微波炉，离心机。2. 材料鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗（南京梅里亚动物保健公司），上述用鸡新城疫病毒Ulster 2C 株灭活疫苗免疫家兔、昆明系小白鼠制备的抗血清，未免疫家兔、昆明系小白鼠血清。3. 试剂0.01M PBS（ pH7.2）（8 g NaCl，0.2 g KCl，2.

22、9 g Na2HPO4.12H2O，0.2 g KH2PO4，以NaOH 调节 pH 至 7.2，加双蒸水至 1000 mL），琼脂糖，鸡新城疫病毒抗血清，氯仿。三、方法和步骤1. 灭活鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株抗原提取取鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗（南京梅里亚动物保健公司）1mL，加氯仿 500L，漩涡振荡器上充分混合均匀，高速台式离心机 12000rpm 离心 15min，收集上清备用。2. 1%琼脂糖配制称取琼脂糖粉 0.3 克，放入三角瓶，加入无菌生理盐水 30mL，微波炉中小功率加热，使琼脂完全溶化。3. 倒平板取无菌 9cm 玻璃培养皿 1 个，平放于实验

23、台（台面要水平），将融化的 1%琼脂溶液趁热倒培养皿中（约加 25mL），使琼脂厚度达 4mm，在室温下放置使琼脂冷却凝固。4. 打孔先取一张一张纸，画上将要打孔的图样，通常双向琼脂扩散实验打孔有双孔、线性排列3 孔、三角形排列 3 孔、正三角形排列 4 孔、十字形排列 5 孔、梅花形排列 7 孔琼脂糖等模式（图）。将图样放在琼脂糖平板下方，将打孔器在正对图样为空的正上方垂直于琼脂糖平板上轻轻按下再用注射器针头挑取孔中琼脂糖，即形成加样微孔。注意在用注射器针头挑取孔中琼脂糖时不要碰伤了孔周围的琼脂。待微孔全部打好后，将平板经过酒精灯外火焰加热封底（温度不宜过高，防止琼脂融化过多，孔塌陷）。为了

24、测定 NDV 免疫血清的效价，本实验采用梅花状排列的小孔，孔径为 8mm，空间距为 5-8mm。打好孔后用记号笔在琼脂平板的底面将孔编号。图 12.琼脂双扩散实验打孔图样5. 稀释抗血清取 1.5mL 无菌尖底 12支离心管排列于离心管架上并做好标记，在每管各加生理盐水100L，吸取 100L 免疫血清加入第 1 管，并充分混匀后吸出 100L 加入第 2 管，经充分混匀后吸出 100L 加入第 3 管中，如此依次 2稀释至第 10 管，混匀后吸出 100L 弃去。此时 110 管血清稀释度为 1:21:64。图 13 稀释抗血清6. 加样在每组呈梅花状排列的小孔的中央孔加入一滴灭活鸡新城疫病

25、毒 Ulster 2C 株抗原（30L），周围各孔依次加入未免疫动物血清、不同稀释度抗血清各 30L。加样时注意不要使液体溢出孔外。图 13.琼脂双扩散实验加样图7. 孵育盖上平板盖放入湿盒，置 37温箱孵育 2448h。8. 结果观察将平板从湿盒中取出，在散射光的背景下（平板后方约 15cm 处用手或深色物挡住）观察，或在凝胶成像系统上用白光光源观察，看抗原孔与不同稀释度的抗血清孔之间是否有白色沉淀线，有沉淀线为阳性，否则为阴性。图 14. 琼脂双扩散沉淀线Part . 酶联免疫吸附试验测定 NDV 抗血清效价一、基本原理酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorben

26、t assay, 简称 ELISA）是酶免疫技术的一种，是将抗原抗体反应的特异性与酶催化反应的高效性相结合而建立的一种技术，其基本原理是：将酶分子与抗体（或抗原）结合，当酶标记抗体（或抗原）与固相载体上的相应抗原（或抗体）结合时，即可在底物溶液的参与下，产生肉眼可见的颜色反应，颜色的深浅与抗原或抗体的量呈比例关系，用酶标仪测定其吸光值进行定量分析。ELISA 技术具有特异、敏感、结果判断客观、简便和安全等优点，在生物学及相关学科中应用广泛。本次实验以 APP 分泌到细胞外的天然毒素 ApxIIA 为检测抗原，包被酶标板，通过间接ELISA 方法检测抗血清中针对毒素的抗体。二、实验仪器、材料和试

27、剂1. 仪器96 孔聚苯乙烯酶标板，200L 和 10L 微量移液器和吸头，10mL 无菌小烧杯，温箱，酶标仪，洗板机。2. 材料鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗（南京梅里亚动物保健公司），上述用鸡新城疫病毒Ulster 2C 株灭活疫苗免疫家兔、昆明系小白鼠制备的抗血清，未免疫家兔、昆明系小白鼠血清。3. 试剂包被液：0.01M 碳酸盐缓冲液（1.59 g NaCO3，2.93 g NaHCO3，加去离子水至 1000 mL），洗涤液：0.01M PBST（pH7.2，含 0.05 Tween-20 的 PBS），封闭液：含 1牛血清白蛋白（BSA）的 PBST，酶标二抗：辣根过

28、氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔IgG，使用时用PBST以1:5000稀释，显色液：四甲基联苯胺（3,3,5, 5-Tetramethylbenzidine,TMB）显色液，终止液：2M H2SO4 或 1 SDS。三、方法和步骤1. 鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活抗原提取 取鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗（南京梅里亚动物保健公司）1mL，加氯仿 500L，漩涡振荡器上充分混合均匀，高速台式离心机 12000rpm 离心 15min，收集上清备用。2、抗原包被 取上述离心上清 100L 加入用 900L 包被液（碳酸盐缓冲液）

29、稀释，在 96 孔酶标板各孔中加入稀释的灭活鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株抗原 100L，在湿盒中于 37温箱孵育 2h，或 4包被过夜。3. 封闭取出 96 孔酶标板，甩干各孔中包被液，将 96 孔酶标板倒扣在吸水纸上叩干，每孔加入封闭液（含 1%BSA 的 PBST）100L，37孵育 1h。4. 洗板取出 96 孔酶标板，甩去封闭液，每孔添加 PBST 200L，浸泡 1min，甩干后再重复洗涤操作 2 次，将 96 孔酶标板倒扣在吸水纸上叩干或拍干。5. 稀释抗血清取 1.5mL 无菌尖底离心管 9 支排列于离心管架上并做好标记，在第 1 管中加入洗涤液297L，其余各管各洗涤液

30、 150L，吸取 3L 免疫血清加入第 1 管，并充分混匀后吸出 150L加入第 2 管，经充分混匀后吸出 150L 加入第 3 管中，如此依次 2稀释至第 9 管，此时 19 管血清稀释度为 1:1001:25600。 图 15稀释抗血清6. 加抗血清在 12 孔酶标板条第 1-9 孔依次加入 1:1001:25600 各稀释度抗血清各 100L，第 10、11 孔每孔加入 100L 1:100 稀释的未免疫动物血清作为阴性对照，第 12 加 PBST 作为空白对照，将酶标板平放在 37培养箱温浴 1hr。图16 加抗血清7. 洗板操作同步骤 4，需重复 4 次。8. 加酶标二抗在酶标板各孔

31、加入 1:5000 稀释的 HRP 标记羊抗兔 IgG 100L，将酶标板平放在 37孵育 1hr。9. 洗板操作同步骤 5，需重复至少 5 次。10. 显色在酶标板各孔加入 TMB 显色液 100L，将酶标板置室温避光静置 10min。11. 终止在酶标板各孔加入 50L 2M H2SO4，终止反应。12. 读数在 405nm 波长下以 12 孔为空白孔调零，测定光密度值。13. 结果判定P/N检测孔 OD 值/阴性孔 OD 值，P/N2.1 为阳性，P/N1.5 为阴性，介于其间为可疑。效价判定：以出现阳性孔的最高稀释度作为待检血清效价。Part . 免疫印迹实验鉴定抗体的特异性一、基本原理免疫