中国药品检验标准操作规程微生物限度检查法.docx

1、中国药品检验标准操作规程微生物限度检查法微生物限度检查法一、细菌、霉菌和酵母菌计数 简述细菌、霉菌和酵母菌计数是检测非规定灭菌制剂及原、辅料受微生物污染程度的方法。也是用于评价生产企业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者的卫生状况的重要手段和依据细菌、霉菌和酵母菌计数均采用平板菌落计数法，这是活菌计数的方法之一，也是目前国际上许多国家常用的一种方法。以在琼脂平板上的细菌、霉菌和酵母菌形成一个独立可见的菌落为计数依据。该法测定结果只反映在该规定条件下所生长的细菌（为一群嗜中温、需氧和兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数。不包括对营养、氧气、温度、pH和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌

2、和酵母菌。一个细菌、霉菌和酵母菌的菌落均可由一个或多个菌细胞生长繁殖而成。因此供试品中所测得的菌落数，实际为菌落形成单位数（colony forming unity，cfu），不应理解为细菌、霉菌、酵母菌的个数。2 设备、仪器2.1 设备2.1.1 洁净实验室微生物限度检查应有单独的洁净实验室，每个洁净实验室应有独立的净化空气系统。2.1.1.1 结构和要求 洁净实验室应采光良好、避免潮湿、远离厕所及污染区。操作间与缓冲间之间应有样品传递舱，出入操作间和缓冲间的门不应直对。洁净实验室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。操作间内不应安装下水道。

3、洁净实验室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300LX。2.1.1.2 温度、湿度 洁净实验室内的温度应控制在1826，相对湿度最好在4060。2.1.1.3 操作间 操作间应安装空气除菌过滤层流装置。洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，不低于10Pa，操作间与缓冲间也应保持相对正压，不低于5Pa。操作台上备有药物天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉球，大、小橡皮乳头等。2.1.1.4 缓冲间 缓冲间内应有洗手盆和无菌衣、帽、口罩、鞋套等。2.1.1.5 洁净级别及检查方法 通常采用尘粒数

4、及浮游菌数或沉降菌数测定法（参照医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌、和沉降菌的测试方法的现行国家标准）进行洁净度验证。不同洁净级别的微粒、浮游菌和沉降菌标准见下表1。表l 不同洁净级别的微粒、浮游菌和沉降菌标准洁净级别尘埃数m3浮游菌（个）m3沉降菌（个）（90mm0.5h）微粒直径0.5m微粒直径5m100级3，50005110000级350，00020001003100000级3，500，00020，00050010沉降菌数测定（法）洁净实验室操作台消毒擦拭处理后，先启动层流净化装置30min，将备妥的营养琼脂平板3个（经3035预培养48h，证明无菌落生长）。以无菌方式（或经传递箱）移

5、人操作间，置净化台左、中、右各1个，开盖，暴露30min后将盖盖上。在3035培养箱内倒置培养48h，取出检查。3个平板生长的平均菌落数不超过1个。有条件的单位，同时应检查洁净操作间和净化工作台上的浮游菌和微粒数。操作问和净化工作台要定期检测其洁净度，分别应达到10000级和100级。如菌落数或微粒数超标，应清洗过滤系统中的过滤设施，必要时予以更换。2.1.1.6 在每次操作前、后用0.1苯扎溴铵溶液或其他适宜消毒液擦拭操作台及可能污染的死角，然后启动层流净化装置。2.1.2 阳性菌实验室涉及实验室监控菌株的分离鉴定、样品阳性菌株的分离分析、方法验证试验中的阳性菌操作等实验活动，应在专门的阳性

6、菌实验室进行。除另有规定外，阳性菌实验室应符合国家级生物安全标准，阳性菌实验室应配备生物安全柜。阳性菌操作不得在供试品检验用洁净实验室内进行。2.1.3 洁净实验室、阳性菌实验室与洗刷、灭菌、消毒、培养及结果观察的工作间等设施应相对集中，布局合理，避免污染，便于管理。2.2 仪器2.2.1 恒温培养箱（3035）、生化培养箱（2328）、微波炉、匀浆仪（30008000 rmin）或康氏振荡器、恒温水浴、电热干燥箱（100300）、电冰箱、离心机、离心管、微孔滤膜及薄膜过滤器、蒸汽灭菌器（使用时要进行灭菌效果检查并应定期请有关部门检定）。菌落计数器、显微镜（401500）、电子天平或药物天平（

7、感量0.1g），pH计。2.2.2 玻璃器皿 锥形瓶（250300ml、500ml内装玻璃珠若干）、培养皿（9cm）、量筒（100ml，500m1）、试管（18mm180mm）及塞、吸管（1m1分度0.0l，10m1分度0.1）、注射器（20ml或30m1）、涂布棒、注射针头、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）、不锈钢桶（带盖）。玻璃器皿用前应洗涤干净，吸管、量筒不挂水滴，无残留抗菌物质。吸管口上端距0.5cm处塞入约2cm的适宜疏松棉花，置吸管筒内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞，若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞，以免振荡时供试液污染瓶塞，再用牛皮纸包扎。玻璃器

8、皿，均于160干热灭菌2h或高压蒸汽121灭菌30min，烘干备用。2.2.3 用具 大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用7075乙醇溶液浸泡）。无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。接种环（白铱金或镍铬合金，环径45mm、长度610cm）、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌钢锥、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖（12cm）、实验记录纸等。3 试液、稀释剂和试剂3.1试液3.1.1 0.1苯扎溴铵溶液或其他适宜消毒液（供洗手、擦拭操作台面用）。3.1.2 5

9、石碳酸溶液（配好后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用）亦可选用其他适宜消毒液。3.1.3 75乙醇溶液。3.1.4 碘酊或碘伏溶液。3.2 稀释剂和试剂稀释剂配制后，采用高压蒸汽灭菌法灭菌。3.2.1 0.9无菌氯化钠溶液（附件二3.1）。3.2.2 pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液（附件二3.5）。3.2.3 无菌聚山梨酯80氯化钠蛋白胨缓冲液（附件二3.4）。3.2.4 pH6.8无菌磷酸盐缓冲液、pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（附件二3.3）。3.2.5 无菌聚山梨酯80氯化钠溶液（附件二3.2）。3.2.6 无菌0.1氯化三苯四氮唑溶液（TTC）（附件二2.15）。3.2.7 pH7.2无

10、菌磷酸盐缓冲液（附件二3.3）。4 培养基4.1 营养琼脂培养基（附件二5.2）。4.2 玫瑰红钠琼脂培养基（附件二5.4）。4.3 酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基（附件二5.5）。培养基制备注意事项：4.3.1 采用干燥培养基，按说明配制，应对灭菌后的培养基pH进行校验。若为自配培养基，原料应挑选，琼脂凝固力应测定，以确定配制时琼脂用量。试剂规格应为化学纯以上。4.3.2 配制的培养基不应有沉淀。如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，灭菌后使用。4.3.3 培养基的分装量不得超过容器的23，以免灭菌时溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。4.3.4 培养基配制后应在2h内灭菌，

11、避免细菌繁殖。4.3.5 灭菌后的培养基应保存在225，防止被污染，可在3周内用毕；保存于密闭容器中，可在1年内使用。制备好的培养基放置时间不宜过长，以免水分散失及染菌。4.3.6 宜采用用水浴或微波炉加热熔化琼脂培养基，勿用电炉直接熔化琼脂培养基，以免营养成份过度受热而破坏。已熔化的培养基应8h内一次用完，剩余培养基不宜再用。4.4 培养基适用性实验的要求及操作见本操作规程第三部分。5 供试品抽样、保存及检验量5.1 抽样5.1.1 一般采用随机抽样方法，其抽样量应为检验用量（2个以上最小包装单位）的35倍量（以备复试或留样观察）。5.1.2 抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的

12、样品。机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。5.1.3 凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格品，无需再抽样检验。5.2 保存5.2.1 供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件不妥致死，损伤或繁殖。5.2.2 供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品进行检查。5.3 检验量5.3.1 所有剂型的检验量均需取自2个以上包装单位（中药蜜丸需取自4丸、膜剂取4片以上）。5.3.2 固体及半固体（黏稠性供试品）制剂检验量为10g。5.3.3 液体制剂检验量为10ml。5.

13、3.4 膜剂除另有规定外，检验量为100cm2。5.3.5 特殊贵重或微量包装的药品，检验量可酌减。除另有规定外，口服固体制剂不低于3g，液体制剂采用原液者不得少于6ml，采用供试液者不得少于3ml，外用药品不得少于5g。要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml（其中10g或10ml用于阳性对照试验）。6 试验准备6.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、吸管（1ml、10m1）、量筒、稀释剂等移至洁净实验室内。每次试验所用物品必须事先做好计划，准备足够用量，避免操作中出入洁净实验室。编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。6.2 开启洁净实验室空气过滤装置，并使其工作

14、不低于30min。6.3 操作人员用肥皂或适宜消毒液洗手，进入缓冲间，换工作鞋。再用0.1苯扎溴铵溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。6.4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。7 供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。所用乳化剂，分散剂、中和剂或灭活剂及其用量应证明是有效的，并对微生物无毒性。供试液的制备若需用水浴加温时，温度不应超过45，时间不得超过30min。除另有规定外，常用的供试品制备方法如下：7.1 液体供试品 取供试品10ml，

15、加pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。7.2 固体、半固体或黏稠液供试品 取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。7.3 非水溶性供试品7.3.1 软膏、乳膏剂 取供试品5g（或5m1），加至含溶化的（温度不超过45）司盘80 5g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g的无菌混合物（溶化，温度不超过45）的烧杯中，即先将烧杯中无菌助溶

16、剂混合物溶化，待温度不超过45时，加入供试品，用无菌玻棒搅拌成团后，分次慢慢加入45的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1:20供试液。7.3.2 油剂 取供试品10ml，加入无菌聚山梨酯80 58ml，摇匀，再加入稀释剂至100ml，作为1:10供试液。7.3.3 栓剂 称取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加适量稀释剂，置45水浴保温10min，使溶，加入无菌聚山梨酯80 58ml，振摇使之乳化，再加稀释剂（稀释剂和聚山梨酯80总量为100m1），摇匀，作为1:10供试液。7.3.4 膏剂 取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯（制法见附

17、录 H“无菌检查法”)和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液100m1，振摇510min，萃取，待油水明显分层，取其水层作为1:10供试液。7.4 非水溶性膜剂供试品 一般取样为100cm2，置灭菌锥形瓶中，加入适量的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，于451水浴中保温，浸泡，振摇，以供试品浸液作为l:10供试液。中药膜剂取100cm2，剪碎，加适量的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液（通常1 cm2加1ml或2m1），浸泡，振摇，以供试品浸液作为1:10供试液。75 肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品10

18、g，肠溶制剂加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液至100ml，结肠溶制剂加pH7.6无菌磷酸盐缓冲液至100ml，均置45水浴中，振摇，使溶解，作为1:10供试液。7.6 气雾剂、喷雾剂供试品 取规定量供试品，置冰箱冰冻室（20以下）内约1h。取出，迅速消毒供试品容器的开启部位周围，用无菌钢锥在容器上钻一小孔，在室温轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的稀释剂（若含非水溶性成份，加适量的无菌聚山梨酯80）中，混匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1:10的供试液。7.7 茶剂供试品 取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂100ml，振摇23min，以灭菌

19、纱布过滤（如为袋泡茶，可直接取2袋，以称样结果按1:10加稀释剂，浸泡30min）。以上供试品如吸水膨胀，或黏度过高，可增加稀释剂的量，制成1:201:100供试液。7.8 贴膏剂供试品 取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。然后将其置于适宜体积并含有灭活剂（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀释剂中，用力振荡至少30min，或放置于均质仪均质l0min，或以其他方法制备成供试液。7.9 具抑菌活性的供试品当供试品具有抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查。常用的方法如下：7.9.1 稀

20、释法 取规定量的供试液，加至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少至不具抑菌作用。用平板法测定菌数时，1ml供试液可等量分注多个平皿；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。培养基稀释法适用于抑菌作用不强的制剂。7.9.2 离心沉淀法 此方法用于去除供试液中的沉淀物，对于抑菌活性较强的供试品，如供试液中有不溶颗粒、沉淀，取供试液，先以500 rmin，离心3min，取上清液进行试验，此方法用于细菌计数和控制菌（细菌）检查。7.9.3 薄膜过滤法 见细菌、霉菌和酵母菌计数。7.9.4 中和法 凡含汞、砷或防腐剂的供试品，可用相应的试剂钝化、中和其抑菌活性，制成供试液。8 供试液的释稀（10

21、倍递增稀释法）8.1 取23支灭菌试管，分别加入9ml pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液灭菌稀释剂（此时操作一般为：左手执试管并将塞打开，倾斜，右手执10ml吸管吸量。切勿在酒精灯火焰的正上方操作，以免火焰将供试液中的菌细胞杀灭）。加稀释剂后，试管塞应立即塞上。8.2 另取1支1ml灭菌吸管吸1:10均匀供试液1ml，加入装有9ml pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液灭菌稀释剂的试管中，混匀，即得1:100供试液。以此类推，根据供试品污染程度，可稀释至1:103、1:104等适宜稀释级。每递增l稀释级，必须另换一支吸管。稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm，反复吸吹约10次。吸液时，应先吸

22、至高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管，贴于试管内壁调整液量至刻度，吸管移至第2级稀释管的内壁近液面处（勿接触液面）缓慢地放出全部供试液（吸管内应无黏附或残留液体），然后将吸管放入消毒液缸内。9 计数方法验证由于某些供试品具有抗菌活性，在建立测定方法或原测定法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。9.1 验证用菌株大肠埃希菌Escherichia coli CMCC(B) 44102，金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus CCMCC(B) 26003，枯草芽孢杆菌Bacillus s

23、ubtilis CMCC(B) 63501，白色念珠菌Candida albicans CMCC(F) 98001，黑曲霉菌Aspergillus niger CMCC(F) 98003。菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，培养1824h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，培养2448h。上述培养物用0.9无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养57天，加入35ml含0.05（mlm1）聚山梨酯80的0.9无菌氯化钠溶液

24、，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05（mlml）聚山梨酯80的0.9无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50l00cfu的孢子悬液。菌悬液制备后，若在室温下放置应在2h内使用，若保存在28的菌悬液可以在24小时内使用。黑曲霉菌的孢子悬液保存在28，可在验证过的贮存期内替代对应量的新鲜孢子悬液使用。9.2 验证方法 验证试验分4组，至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算供试品组和对照组试验的菌回收率。9.2.1 供试品组 取最低稀释级的供试液，按每1ml供试液加入50l00cfu试验菌，按菌落计数方法测定其菌数。平皿法计数时，取试验菌液、供试液各1ml分别注入平皿

25、中，立即倾注琼脂培养基；薄膜过滤法计数时，取供试液2ml过滤，冲洗液冲洗，并在最后一次的冲洗液中加入试验菌。9.2.2 活菌组 取上述试验菌液，测定其加入的试验菌菌数。9.2.3 供试品对照组 取最低稀释级的供试液1ml，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。9.2.4 稀释剂对照组 为考察供试液制备过程中对微生物影响的程度，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml含50l00cfu，按供试品组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。9.3 结果判定对照组的菌回收率均应不低于70。若供试品组的菌回收率均不低于70，则可按该供试液制备方法和菌落计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵

26、母菌数；若任一次试验中供试品组的菌回收率低于70，应建立新的方法，消除供试品的抑菌活性，并重新验证。9.4 验证试验可与供试品的细菌，霉菌及酵母菌计数同时进行。9.5 注意事项9.5.1 所用标准菌种的传代次数不得超过5代。以冷冻干燥的原始菌种开启后转种培养，其培养物为第一代。9.5.2 黑曲霉菌的菌液制备 将黑曲霉菌接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，于2025培养57天，使大量的孢子产生。加入35ml含0.05（mlm1）聚山梨酯80的0.9无菌氯化钠溶液，用无菌玻棒或接种环轻轻将孢子洗脱。然后可用一支l0ml无菌球形毛细吸管，其管口用无菌棉花或纱布包扎且能过滤菌丝的装置，吸出孢子悬液至无菌试

27、管内，将孢子悬液稀释至每毫升含50l00cfu。9.5.3 做试验菌的回收率试验时，加入菌量50l00cfu为宜。加菌量过多，如薄膜法，菌落拥挤，则不好计数；加菌量过少，则误差较大。9.5.4 进行验证试验时，若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败，应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法验证试验。此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行，但最高稀释级供试液选择应根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则，如供试品应符合的微生物限度标准是1克细菌数不得过1000cfu，那么最高稀释级是1:103。若采用允许的最高稀释级供试液进行验证试验还存在一株或多株

28、试验菌的回收率达不到要求，那么应选择回收情况最接近要求的方法进行供试品的检测。如某种产品对某试验菌有较强的抑菌性能，采用薄膜过滤法的回收率为40，而采用培养基稀释法的回收率为30，那么应选择薄膜过滤法进行该供试品的检测。在此情况下，生产单位或研制单位应根据原辅料的微生物质量、生产工艺及产品特性进行产品的风险评估，以保证检验方法的可靠性，从而保证产品质量。10 检查法10.1 平皿法10.1.1 在上述进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取该稀释级供试液各1ml至每个直径90mm的灭菌平皿中，或从高稀释级至低稀释级吸液时可用1支吸管吸供试液各1ml至每个灭菌平皿中。每一稀释级每种培养基至

29、少注23个平皿（一般为左手执平皿，将盖半开，右手执吸管），注皿时，将1ml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流到吸管尖端部。10.1.2 阴性对照 待各级稀释液注皿完毕后，用1支1ml吸管吸取试验用稀释剂（pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液）各1ml，分别注入4个平皿中。其中2个作细菌数阴性对照；另2个作霉菌、酵母菌数阴性对照，如另用YPD琼脂测定酵母菌数时，则再增加2个平皿作酵母菌数阴性对照。10.1.3 倾注培养基将预先配制好的细菌计数用的营养琼脂培养基；霉菌、酵母菌计数用的玫瑰红钠琼脂培养基；含蜂蜜、王浆液体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基（霉菌）和YPD琼脂培养基（酵母菌）熔化，冷至约

30、45时，倾注上述各个平皿约15ml，以顺时针或反时针方向快速旋转平皿，使供试液或稀释液与培养基混匀，盖上陶瓦盖，或半盖盖，除去冷凝水后，再移去陶瓦盖后，盖上平皿盖置操作平台上待凝。在旋转平皿时切勿将培养基溅到皿边及皿盖上。10.1.4 培养细菌计数平板倒置于3035培养箱中培养3天。霉菌、酵母菌计数平板倒置于2328培养箱中培养5天，必要时延长至7天。逐日观察菌落生长情况，点计菌落数。10.1.5 菌落计数10.1.5.1 一般将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。勿漏计细小的琼脂层内和平皿边缘生长的菌落。注意细菌菌落、霉菌菌落和酵母菌菌落之间，以及

31、菌落与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡、油滴等的区别。必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察，或挑取可疑物涂片镜检。10.1.5.2 供试品如为微生物制剂，应将有效微生物菌落排除，不可点计在细菌、霉菌和酵母菌数内。排除的方法需按该制剂微生物品种而定，并须观察菌落特征及染色形态。10.1.5.3 供试品稀释液常含有不溶性原料、辅料，培养基注皿后亦可能产生沉淀物，经过培养后有时形成数量很多的有形物，且难与菌落相区别。为了有利于菌落计数，可在操作时将适宜稀释级的供试液多增加注皿（12个平皿）。注皿后不经培养而放置于冰箱（勿结冻）中。在计数菌落时作为对照。或用含TTC营养琼脂注皿，经培养后该培养基生长的菌落为红色，衬于白色背景上易于点计细菌菌落和区分其他有形物。有些软膏等非水溶性供试品，经营养琼脂注皿后呈乳白色，培养后生长的菌落不易辨认和点计，为防止这种情况，也可用含TTC营养琼脂注皿。TTC的用量应以不抑制微生物生长为宜，通常使用的浓度为0.001。10.1.5.4 若平板上有2个或2个以上菌落重叠，肉眼可辨别时仍以2个或2个以上菌落计数；若平板生长有链状或片状、云雾状菌落，菌落间无明显界线，一条链、片作为一个菌落计，但若链、片上出