柱子流动相注意事项.docx

1、柱子流动相注意事项HPLC利用注意事项及HPLC柱子利用体会之谈HPLC利用注意事项1.流动相必需用HPLC级的试剂，利用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(利用或更细的膜过滤)。2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后利用。3.不能用纯乙腈作为流动相，如此会使单向阀粘住而致使泵不进液。4.利用缓冲溶液时，做完样品后应当即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。关于柱塞杆外部，做完样品后也必需用去离子水冲洗20ml以上。5.长时刻不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保留，注意不能用纯水保留柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯

2、水易长霉。6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。8.堵塞致使压力太大，按预柱混合器中的过滤器管途经滤器单向阀检查并清洗。清洗方式；以异丙醇作溶剂冲洗：放在异丙醇中间用超声波清洗；用10稀硝酸清洗。9.气泡会致使压力不稳，重现性差，因此在利用进程中要尽可能幸免产动气泡。10.若是进液管内不进液体时，要利用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。11.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，专门是碱性样品。12.改换流动相时应该先将吸滤头部份放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。改换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。高效液相

3、色谱常见故障的判定及解决诊状可能的缘故解决方法(一)保留时刻转变1.柱温转变柱恒温，必要时需配置恒温箱2.等度与梯度间未能充分平稳至少用10倍柱体积的流动相平稳柱3.缓冲液容量不够用25mmol/L的缓冲液4.柱污染天天冲洗柱5.柱内条件转变稳固进样条件,调剂流动相6.柱快达到寿命采纳爱惜柱(二)保留时刻缩短1.流速增加检查泵,从头设定流速2.样品超载降低样品量3.键合相流失流动相PH值维持在3检查柱的方向4.流动相组成转变避免流动相蒸发或沉淀5.温度增加柱恒温(三)保留时刻延长1.流速下降管路泄漏,改换泵密封圈,排除泵内气泡2.硅胶柱上活性点转变用流动相改性剂,如加三乙胺,或采纳碱至钝化3.

4、键合相流失同前(二)34.流动相组成转变同前(二)45.温度降低同前(二)5(四)显现肩峰或分*1.样品体积过大用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2.样品溶剂过强采纳较弱的样品溶剂3.柱塌陷或形成短路通道改换色谱柱,采纳较弱侵蚀性条件4.柱内烧结不锈钢失效改换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5.进样器损坏改换进样器转子(五)鬼峰1.进样阀残余峰每次用后用强溶剂清洗阀,改良阀和样品的清洗2.样品中未知物处置样品3.柱未平稳从头平稳柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱)4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱)天天新配,用抗氧化剂5.水污染(反相)通过转变平稳时刻检查水质量，用HPLC级的

5、水(六)基线噪声1.气泡(尖锐峰)流动相脱气,加柱后背压2.污染(随机噪声)清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂3.检测器灯持续噪声改换氘灯4.电干扰(偶然噪声)采纳稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)5.检测器中有气泡流动相脱气,加柱后背压(七)峰拖尾1.柱超载降低样品量,增加柱直径采纳较高容量的固定相2.峰干扰清洁样品,调整流动相3.硅羟基作用加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品4.同前(四)4同前(四)45.同前(四)35.同前(四)36.死体积或柱外体积过大连接点降至最低,对所有连接点作适合调整,尽可能采纳细内径的连接管7.柱效下降用较低侵蚀条件,改换柱,

6、采纳爱惜柱(八)峰展宽1.进样体积过大同(四)12.在进样阀中造成峰扩展进样前后排出气泡以降低扩散3.数据系统采样速度太慢设定速度应是每峰大于10点4.检测器时刻常数过大设按时刻常数为感爱好第一峰半宽的10%5.流动相粘度太高增加柱温,采纳低粘度流动相6.检测池体积过大用小体积池,卸下热互换器7.保留时刻太长等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱8.柱外体积过大将连接管径和连接管长度降至最小9.样品过载进小浓度小体积样品液相色谱柱利用体会谈色谱柱在利用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保留起来，作为尔后评判柱性能转变的参考。但要注意：柱性能可能由于所利用的样品、流动相、柱温等条件的不同而有所不同

7、；另外，在做柱性能测试时是依照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所利用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。一、样品的前处置：a、最好利用流动相溶解样品。b、利用予处置柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。c、利用祄的过滤膜过滤除去微粒杂质。二、流动相的配制：液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量互换而达到分离的目的，因此要求流动相具有以下的特点：a、流动相对样品具有必然的溶解能力，保证样品组分可不能沉淀在柱中(或长时刻保留在柱中)。b、流动相具有必然惰性，与样品不产生化学反映(特殊情形除外)。c、流动相的黏度要尽可能小，以便在利用较长的分析柱时能取得好的分离

8、成效；同时降低柱压降，延长液体泵的利用寿命(可运用提高温度的方式降低流动相的黏度)。d、流动相的物化性质要与利用的检测器相适应。如利用UV检测器，最好利用对紫外吸收较低的溶剂配制。e、流动相沸点不要太低，不然容易产动气泡，致使实验无法进行。f、在流动相配制好后，必然要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还能够避免流动相中的微量氧与样品发生作用。二、流动相流速的选择：因柱效是柱中流动相线性流速的函数，利用不同的流速可取得不同的柱效。关于一根特定的色谱柱，要追求最正确柱效，最好利用最正确流速。对内径为的色谱柱，流速一样选择1mlmin，关于内径为柱，流速min为佳。被选用最正确流速

9、时，分析时刻可能延长。可采纳改变流动相的洗涤强度的方式以缩短分析时刻(如利用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。注意：a由于甲醇廉价，关于反相柱推荐利用甲醇体系(必需利用乙腈的场合除外)。b关于正相柱推荐利用沸程为30-60的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得利用。用水最好利用超纯水(电阻率大于18兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能阻碍分析结果。c含水流动相最*在实验前配制，尤其是夏天利用缓冲溶液作为流动相不要留宿。最好加入叠氮化钠，避免细菌生长。d流动相要求利用祄滤膜过滤，除去微粒杂质。e利用HPLC级溶剂配制流动相，利用适合的流动相可延长色谱柱的利用寿命，提高

10、柱性能HPLC的经常使用术语第一部份色谱曲线一、romatogram）：色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时刻或流动相流出体积的曲线图，或通色谱图（ch过适当的方式观看到的纸色谱或薄层色谱斑点、谱带的散布图。二、（色谱）峰（chromatographicpeak）：色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线。此主题相关图片如下：此主题相关图片如下：3、峰底（peakbase）：峰的起点与终点之间的连接的直线（图1中的CD）。4、峰高（h，peakheight）：色谱峰最大值点到峰底的距离（图1中的BE）。五、峰宽（W，peakwidth）：在峰双侧拐点（图1中的F，G

11、）处所作切线与峰底相交两点的距离（图1中的KL）。六、半顶峰宽（Wh/2，peakwithdathalfheight）：通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰双侧相交两点之间的距离（图1中的HJ）。7、峰面积（A，peakarea）：峰与峰底之间的面积（图1中的CHEJDC）。八、拖尾峰（tailingpeak）：后沿较前沿平缓的不对称的峰。九、前伸峰（leadingpeak）：前沿较后沿平缓的不对称的峰。（又叫伸舌峰、前延峰）10、假峰（ghostpeak）：除组分正常产生的色谱峰外，由于仪器条件的转变等缘故此在谱图上显现的色谱峰，即并非由试样所产生的峰。这种色谱峰并非代表具体某一组分

12、，容易给定性、定量带来误差。（又叫鬼峰）1一、畸峰（distrortedpeak）：形状不对称的色谱峰，前伸峰、拖尾峰都属于这种。1二、反峰（negativepeak）：也称倒峰、负峰，即出峰的方向与通常的方向相反的色谱峰。柱的利用和保护注意事项(推荐)色谱柱的正确利用和保护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短利用寿命乃至损坏。在色谱操作进程中，需要注意以下问题，以保护色谱柱。幸免压力和温度的急剧转变及任何机械震动。温度的突然转变或使色谱柱从高处掉下都会阻碍柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调剂流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）。2.应慢慢改变

13、溶剂的组成，专门是反相色谱中，不该直接从有机溶剂改变成全数是水，反之亦然一样说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱能够反冲时，才能够反冲除去留在柱头的杂质。不然反冲会迅速降低柱效。选择利用适宜的流动相（尤其是pH），以幸免固定相被破坏。有时能够在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶饱和，幸免分析柱中的硅胶基质被溶解。常经常使用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂慢慢过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要5075ml。下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：

14、硅胶柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必需严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使硅胶表面从头活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。若是下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么能够省略最后用水冲洗这一步。一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质，在甲醇（乙腈）冲洗时重复注射100200祃四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。另外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（%）梯度洗脱能除去蛋白质污染。阳离子互换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子互换柱可用稀碱缓冲液冲洗，除去互

15、换性能强的盐，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有机物）、甲醇、水依次冲洗。保留色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，避免溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置留宿或更长时刻。色谱柱利用进程中，若是压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应改换滤片或将其掏出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；若是柱效降低或色谱峰变形，那么可能柱头显现塌陷，死体积增大。在后两种情形发生时，警惕拧开柱接头，用干净小钢将柱头填料掏出12mm高度（注意把被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相（与柱内相同）填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。如此处置后柱效能

16、取得改善，可是很难恢复到新柱的水平。柱子失效一般是柱端部份，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱（530mm），可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的。通常色谱柱寿命在正确利历时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，只能在pH29范围内利用。柱子利用一段时刻后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，专门是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。新的色谱柱在利用一段时刻后柱顶填料可能塌陷，使柱效下降，这时也可补加填料使柱效恢复。每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平稳。当采纳盐缓冲溶液作流动相时，利用完后应用无盐流动相冲洗。

17、含卤族元素（氟、氯、溴）的化合物可能会侵蚀不锈钢管道，不宜长期与之接触。装在HPLC仪上柱子如不常常利用，应每隔45天开机冲洗15分钟。高效液相色谱仪常规分析操作步骤及规程高效液相色谱仪操作步骤：1)过滤流动相，依照需要选择不同的滤膜。2)对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。3)打开HPLC工作站（包括运算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。4)进入HPLC操纵界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。5)有一段时刻没用，或换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start

18、，冲洗时速度不要超过10ml/min。6)调剂流量，第一次利用新的流动相，能够先试一下压力，流速越大，压力越大，一样不要超过2000。点击injure，选用适合的流速，点击on，走基线，观看基线的情形。7)设计走样方式。点击file，选取selectusersandmethods，能够选取现有的各类走样方式。假设需成立一个新的方式，点击newmethod。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，依照需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方式需要包括：a.进样前的稳流，一样2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时刻，随不同的样品而不同

19、。8)进样和进样后操作。选定走样方式，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方式走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全数样品走完后，再用上面的方式走一段基线，洗掉剩余物。9)关机时，先关运算机，再关液相色谱。10)填写记录本，由负责人签字。注意事项：1)流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要警惕振动尽可能不引发气泡。2)柱子是超级脆弱的，第一次做的方式，先不要让液体过柱子。3)所有过柱子的液体均需严格的过滤。4）压力不能太大，最好不要超过2000psi流动相注意事项高效液相色谱的流动相一般是各类低沸点溶剂和水溶液。它是阻碍分离的一个超级重要因素。在实际工作

20、中，流动相的选择和优化是确信色谱分析的要紧工作。一、 流动相溶剂的选择1.所选用的流动相溶剂要有必然的化学稳固性，不与固定相和样品组分起反映，其纯度和化学特性必需知足色谱进程的稳固性和重复性的要求。2.溶剂应当不干扰检测器的工作，溶剂应与检测器匹配，选择不阻碍检测器正常工作应选择在测定波长范围内无吸收的流动相。3.在制备分离中, 溶剂应当易于除去, 不干扰对分离组分的回收。4.溶剂的粘度要小，保证适合的柱压降。5.从有效角度考虑，溶剂应当价钱低廉，容易购得，利用平安，纯度要高。二、流动相溶剂利用的注意事项1.流动相溶剂应选择HPLC的溶剂或依此为标准的溶剂。流动相利用前用m滤膜过滤、脱气，清除

21、微粒和尘埃。 在送液泵内，为了避免杂物（固体）进入流路，装有吸滤器，但网孔径为10m，比此更小的颗粒仍然可通过，这会致使流路和柱子堵塞和污染。为此，建议经常使用m滤膜过滤。流动相溶剂须经脱气，如不脱气，在溶剂混合时，或压力温度转变时容易产生大量气泡，会致使泵误动作和输液不顺畅，检测器产生噪声信号等。2.流动相恢复到室温后利用。流动相温度与室温相差时，流动相在恢复到室温前，基线水平很难稳固，专门是发生漂移，也容易产动气泡等现象。水与有机溶剂混合时，混合液转变大，往往会与室温相差专门大，务必注意。3.做HPLC流动相的试剂应用HPLC级的、水应用二次蒸馏水，水相流动相需常常改换，避免长菌变质。利用

22、去离子水、针剂水、纯净水（炊用）并非适合、尤其是做梯度洗脱时，水中的不纯物会成为鬼峰，从而干扰分析结果。4.流动相的pH值太高或太低，流动相利用纯水，利用高浓度磷酸盐缓冲溶液，利用离子对试剂等，都可能造成色谱柱填料被化学破坏，这种对色谱柱固定相及键合相的破坏一般是不可修复的5.用缓冲盐做流动相时，在利用前和利用后都要用水清洗流路，绝对禁止将缓冲溶液留在流路中静置留宿或更长时刻。6.假设需要利用含盐的流动相，利用前请务必过滤。而且利用该含盐流动相前，色谱柱需先用低比例有机相（有机相含量应不低于10%）的溶液冲洗，以避免缓冲盐析出。流动相假设为蒸馏水或含盐的缓冲液，建议现用现配，以避免流动相因滋长

23、微生物而造成柱填料的污染。7.进行梯度实验时要注意梯度转变进程中流动相的互溶性，幸免因流动相不互溶而致使的缓冲盐析出问题。反相系统改换正相系统或正相系统改换反相系统时，用异丙醇置换系统内的贮存流动相后在接柱子。8.在改换两种互不相溶的流动相时，中间要用异丙醇溶液清洗过渡。例如：先用甲醇水做流动相，然后在用正己烷做流动相时，必然要先用异丙醇溶液冲洗甲醇水，然后用正己烷冲洗异丙醇，反之也是一样。在改换流动相时还要考虑色谱柱是不是改换。9.仪器在短时间（两三天）不历时，流路中能够是甲醇或水。仪器在长期不历时，流路中应用甲醇。10.关于UV等检测器用于高灵敏度检测时，要利用UV吸收性小的HPLC的溶剂

24、作为流动相溶剂，如甲醇、乙腈等。11.当流动相溶剂为乙腈时，流速为1ml/min泵的正常压力57Mpa之间，若是压力慢慢降低，基线也显现异样。这是由于乙氰的粘性大，致使泵的流速降低。可适当提高流速使泵的压力恢复正常即可。12.流动相含有浓硫酸、浓硝酸、二氯乙酸、二氯甲烷、氯仿、丙酮、四氯呋南、二甲化砜等溶剂，会对流路中的PEEK树脂管路强度变成差、PEEK树脂管容易破裂使溶剂外溅。流动相含有卤素离子的溶剂，如KCI、NaCI、NH4CI等。对流路中的不锈钢材料有侵蚀作用，以上的溶剂须尽可能幸免利用。非用不可时，分析完了后，应立刻用蒸馏水把全流路清洗干净。13.用于检定梯度等性能时，短时刻利用在

25、%以下的低浓度丙酮水溶液是没有问题的。14.注意：稀硝酸与甲醇不能混合，不然有可能会引发爆炸。三、液相色谱流动相的贮存流动相一样贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂，致使溶剂受污染。这种被污染的溶剂如用于HPLC系统，可能造成柱效降低。贮存容器必然要盖严，避免溶剂挥发引发组成转变，也避免氧和二氧化碳溶入流动相。磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽可能新鲜配制利用，不要贮存。如确需贮存，可在冰箱内冷藏，并在3天内利用，用前应从头滤过。容器应按期清洗，专门是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。因甲醇有防腐作用，因此盛甲醇的瓶子无此现象。