实验室常用技术参数资料精.docx

1、实验室常用技术参数资料精实验室常用技术参数资料一、核酸及蛋白质常用数据 1核苷三磷酸的物理常数化合物分子量max(pH7.0)1摩尔溶液（pH7.0）中max时的最大吸收值OD280/OD260ATP507259154000.15CTP48327190000.97GTP523253137000.66UTP484262100000.38dATP494259152000.15dCTP46727193000.98dGTP507253137000.66dTTP48226796000.712常用核酸的长度与分子量核酸核苷酸数分子量DNA48502（双链环状）3.0107pBR3224363（双链）2.8

2、10628SrRNA48001.610623SrRNA37001.210618SrRNA19006.110519SrRNA17005.51055SrRNA1203.6104tRNA（大肠杆菌）752.51043常用核酸蛋白换算数据（1）重量换算1g=10-6g 1pg=10-12g1ng=10-9g 1fg=10-15g（2）分光光度换算：1A260双链DNA=50g/ml1A260单链DNA=30g/ml1A260单链RNA=40g/ml（3）DNA摩尔换算：1g 100bp DNA=1.52pmol=3.03pmol末端1g pBR322 DNA=0.36pmol1pmol 1000bp

3、DNA=0.66g1pmol pBR322=2.8g1kb双链DNA（钠盐）=6.6105道尔顿1kb单链DNA（钠盐）=3.3105道尔顿1kb单链RNA（钠盐）=3.4105道尔顿（4）蛋白摩尔换算：100pmol分子量100，000蛋白质=10g100pmol分子量50，000蛋白质=5g100pmol分子量10，000蛋白质=1g氨基酸的平均分子量=126.7道尔顿（5）蛋白质/DNA换算：1kb DNA=333 个氨基酸编码容量=3.7104MW蛋白质10，000MW蛋白质=270bp DNA30，000MW蛋白质=810bp DNA50，000MW蛋白质=1.35kb100，000

4、MW蛋白质=2.7kb DNA4常用蛋白质分子量标准参照物（1）高分子量标准参照（2）中分子量标准参照（3）低分子量标准参照肌球蛋白分子量磷酸化酶B97，400碳酸酐酶31，00肌球蛋白212，000牛血清白蛋白66，200大豆脻蛋白酶21，500-半乳糖甘酶B116，000谷氨酶脱氢酶55，000抑制剂磷酸化酶B97，400卵白蛋白42，700马心肌球蛋白16，900牛血清白蛋白66，200醛缩酶40，000溶菌酶14，400过氧化氢酶57，000碳酸酐酶31，000肌球蛋白（F1）8，100醛缩酶40，000大豆脻蛋白酶21，500肌球蛋白（F2）6，200抑制剂肌球蛋白（F3）2，500

5、溶菌酶14，4005常用DNA分子量标准参照物DNA/HindDNA/EcoR/Hind+EcoRpBR322/Hae23130212262122758712394167421514840510465575804497350489436156434268458802322484335304346420273530202726757564190423451125158421321137519218974184118311247564125续上表pBR322/Hinf174/Hinf174/Hae 174/Tap1631726140135329145177131181078117550655310

6、0872404396500826033273444176631023129841348281141221311422718722024940234541542002419433751511182072二、常用缓冲液1分子克隆常用缓冲液2磷酸缓冲液（1）25下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制pH1mol/L K2HPO4(ml)1mol/L KH2PO4(ml)5.88.591.56.013.286.86.219.280.86.427.872.26.638.161.96.849.750.37.061.538.57.271.728.37.480.219.87.686.613.47.890.89.

7、28.094.06.2（2）25下0.1mol/L磷酸钠缓冲液的配制pH1mol/L Na2HPO4(ml)1mol/L NaH2PO4(ml)5.87.992.16.012.088.06.217.882.26.425.574.56.635.264.86.846.353.77.057.742.37.268.431.67.477.422.67.684.515.57.889.610.48.093.26.8:用蒸馏水将混合的两种1mol/L贮存液稀释至1000ml，根据Henderson-Hasselbalch方程计算其pH值：pH=pK+1g(质子受体/质子供体)在此，pK=6.86(25)。3电

8、泳缓冲液测序凝胶加样缓冲液98%去离子甲酰胺10mol/L EDTA(pH8.0)0.025%二甲苯青FF0.025%溴酚蓝甲酰胺：许多批号的试剂级甲酰胺，其纯度符合使用要求，无须再进行处理。不过，一旦略呈黄色，则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与Dowex XG8混合床树脂共同搅拌1小时进行去离子处理，并用Whatman 1号滤纸过滤2次，去离子甲酰胺分装成小份，充氮存于-70。常用的电泳缓冲液缓冲液使用液浓贮存液（每升）Tris-乙酸（TAE）1：0.04mol/L Tris-乙酸50：242g Tris碱0.001mol/L EDTA57.1ml冰乙酸100ml 0.5mol/L EDTA(p

9、H8.0)Tris-磷酸（TPE）1:0.09mol/L Tris-磷酸10:10g Tris碱0.002mol/L EDTA15.5ml85%磷酸（1.679g/ml）40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)Tris-硼酸（TBE）a0.50.045mol/L Tris-硼酸5：54g Tris碱0.001mol/L EDTA27.5硼酸20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)碱性缓冲液b1:50mmol/L NaOH1:5ml 10mol/L NaOH1mmol/L EDTA2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)Tris-甘氨酸c1:25mmol/L Tri

10、s5:15.1g Tris250mmol/L 甘氨酸94g 苷氨酸（电泳级）（pH8.3）0.1% SDS50ml 10% SDS(电泳级)说明：TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存5溶液，出现沉淀后则予以废弃。以片都以1TBE作为使用液（即1：5稀释浓贮液）进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以1：10稀释的贮存液作为使用液。进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小， 故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用1TBE以提供足够的缓冲容量。碱性电泳缓冲液应现用现配。Tris-甘氨酸缓冲液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电

11、泳。2SDS凝胶加样缓冲液：100mmol/L TrisHCl(6.8)200mmol/L二硫苏糖醇（DTT）4%SDS（电泳级）0.2%溴酚蓝20%甘油不含DTT的2SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，应在临用前取1mol/L贮存液现加于上述缓冲液中。4凝胶加样缓冲液缓冲液类型6缓冲液贮存温度0.25%溴酚蓝40.25%二甲苯青FF40%（W/V）蔗糖水溶液0.25溴酚蓝室温0.25%二甲苯青FF15%聚蔗糖(Ficoll400)0.25%溴酚蓝40.25%二甲苯青FF30%甘油水溶液0.25%溴酚蓝440%(W/V)蔗糖水溶液碱性加样缓冲液:300mmol/L NaOH6mmol/L EDT

12、A18%聚蔗糖(Ficoll400)40.15%溴甲酚绿0.25%二甲苯青FF使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品密度；以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍，而与琼脂糖浓度无关。以0.5TBF作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5%1.4%的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是，对于碱性凝胶应当使用溴

13、甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性pH条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。5各种pH值的Tris缓冲液的配制各种pH值的Tris缓冲液的配制所需pH值（25）0.1mol/L HCl的体积714577244773434744207540376385773667834579320802928.126.28.222.98.319.98.417.28.514.78.612.48.710.38.88.58.97.0某一特定pH值的0.05mol/L Tris缓冲液的配制：将50ml 0.1mol/L Tris碱溶液与上表所示相应体积（单位：ml）的0.1ml/L HCl混合，加水将体积调至100ml（2）温度对

14、50mmol/L TrisHCl液pH值的影响42537817572827673837774847875857976868077878178888279898380908481918582928683938784948885（6）常用缓冲液的pKa值缓冲液分子量pKa值缓冲范围Trisa12.18.087.17.9HEPESb283.37.477.28.2MPOSc209.37.156.67.8PIPESd304.36.766.27.3MESe195.26.095.46.8a：三羟甲基氨基甲烷；b：N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磷酸；c：3-（N-吗啉代）丙磺酸；d：N，N-双（2-乙磺酸）哌

15、嗪；e：2-（N-吗啉代）乙磺酸。7温度对常用缓冲液pH的影响缓冲体系pKa(20)pKa/10Mes6.15-0.110Ada6.60-0.110PiPes6.80-0.085Aces6.90-0.200Bes7.15-0.160Mops7.20-0.013Tes7.50-0.200Hepes7.55-0.014Tricine8.15-0.210Tris8.30-0.310Bicine8.35-0.180Glycylglycine8.40-0.280三、常用酶的配制1溶菌酶用水配制成50mg/ml的溶菌酶溶液，分装成小份并保存于-20。每一小份一经使用后便予丢弃。2蛋白水解酶类贮存液贮存温度

16、反应浓度反应缓冲液温度预处理0.01mol/L Tris(pH7.8)链霉蛋白酶a20mg/ml-20（溶于水）1mg/ml0.01mol/L EDTA37自消化b0.5% SDS0.01mol/L Tris(pH7.8)蛋白酶Kc20mg/ml-20（溶于水）50g/ml0.005mol/L EDTA3756无须预处理0.5% SDSa：链霉蛋白酶是从链球菌（Streptomyces griseus）中分离到的一种丝氨酸酶和酸性蛋白酶的混合物。b：自消化可消除DNA酶和RNA酶的污染，经自消化的链酶蛋白酶的配制方法如下：把该酶的粉末溶解于10mmol./l TrisHCl(pH7.5)、10

17、mmol/l NaCl中，配成20mg/ml浓度，于37温育1h。经消化的链霉蛋白酶分装成小份放在密封试管中，保存-20。c：蛋白酶K是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，从林伯氏白色念球菌（Tritirachium album Limber）中纯化得到。该酶有两个Ca2+结合位点，它们离酶的活性中心有一定距离，与催化机理并无直接关系。然而，如果从该酶中除去Ca2+，由于出现远程的结构变化，催化活性将丧失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染酸制品的蛋白质。所以，蛋白酶K消化过程中通常加入EDTA（以抑制依赖于Mg2+的核酸酶的作用）。但是，如果要消化对蛋白酶K具有较强耐性的蛋白，

18、如角蛋白一类，则可能需要使用含有1mmol/l Ca2+而不含EDTA的缓冲液。在消化完毕后、纯化核酸前要加入EGT（pH8.0）至终浓度为2mmol/L,以鳌合Ca2+。3无DNA酶的RNA酶将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/l TrisHCl(pH7.5)、15mmol/l NaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20。四、常用抗生素溶液抗生素贮存液a工作浓度浓度保存条件严紧型质粒松弛型质粒氨苄青霉素50mg/ml(溶于水)-2020g/ml60g/ml羧苄青霉素50mg/ml(溶于水)-2020g/ml60g/ml氯霉素3

19、4mg/ml(溶于乙醇)-2025g/ml170g/ml卡那霉素10mg/ml(溶于水)-2010g/ml50g/ml链霉素10mg/ml(溶于水)-2010g/ml50g/ml四环素b5mg/ml(溶于乙醇)-2010g/ml50g/mla：以水为溶剂的抗生素贮存液通过0.22m滤器过滤除菌。以乙醇为溶剂的抗生素溶液无须除菌处理。所有抗生素溶液均应放于不透光的容器保存。b：镁离子是四环素的拮抗剂，四环素抗性菌的筛选应使用不含镁盐的培养基（如LB培养基）。五、常用贮存液的配制130%丙烯酰胺溶液【配制方法】将29g丙烯酰胺和1g N，N-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中。加热至37溶解

20、之，补加水至终体积为100ml。用Nalgene滤器（0.45m孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温。【注意】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。一些价格较低的丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有一些金属离子，在丙烯酰胺贮存液中加入大约0.2体积的单床混合树脂（MB-1Mallinckrodt），搅拌过夜，然后用Whatman 1号滤纸过滤以纯化之。在贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酰和双丙烯酸。240%丙烯酰胺

21、【配制方法】把380g丙烯酰胺（DNA测序级）和20g N，N-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为600ml的蒸馏水中。继续按上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法处理，但加热溶解后应以蒸馏水补足至终体积为1L。【注意】见上述配制30%丙烯酰胺的说明，40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列测定。3放线菌素D溶液【配制方法】把20mg放线菌素D溶解于4ml 100%乙醇中，1：10稀释贮存液，用100%乙醇作空白对照读取OD440值。放线菌素D（分子量为1255）纯品在水溶液中的摩尔消化系数为21，900，故而1mg/ml的放线菌素D溶液在440nm处的吸光值为0.182，放线菌素D的贮存液应放在包有箔片的试管中，

22、保存于-20。【注意】放线菌素D是致畸剂和致癌剂，配制该溶液时必须戴手套并在通风橱内操作，而不能在开放在实验桌面上进行，谨防吸入药粉或让其接触到眼睛或皮肤。药厂提供的作治疗用途的放线菌素D制品常含有糖或盐等添加剂。只要通过测量贮存液在440nm波长处的光吸收确定放线菌素D的浓度，这类制品便可用于抑制自身引导作用。40.1mol/L腺苷三磷酸（ATP）溶液【配制方法】在0.8ml水中溶解60mg ATP,用0.1mol/L NaOH调至pH值至7.0，用蒸馏水定容1ml，分装成小份保存于-70510mol/L乙酸酰溶液【配制方法】把770g乙酸酰溶解于800ml水中，加水定容至1L后过滤除菌。6

23、10%过硫酸铵溶液【配制方法】把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中，该溶液可在4保存数周。7BCIP溶液【配制方法】把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐（BCIP）溶解于10ml 100%的二甲基甲酰胺中，保存于482BES缓冲盐溶液【配制方法】用总体积90ml的蒸馏水溶解1.07g盐溶液BESN，N-双（2-羟乙基）-2-氨基乙磺酸、1.6g NaCl和0.027g Na2HPO4，室温下用HCl调节该溶液的pH值至6.96、然后加入蒸馏水定容至100ml，用0.22m滤器过滤除菌，分装成小份，保存于-20。91mol/L CaCl2溶液【配制方法】在200ml蒸馏水中溶解

24、54g CaCl26H2O，用0.22m滤器过滤除菌，分装成10ml小份贮存于-20。【注意】制备感受态细胞时，取出一小份解冻并用蒸馏水稀释至100ml，用Nalgene滤器（0.45m孔径）过滤除菌，然后骤冷至0。102.5mol/L CaCl2溶液【配制方法】在20ml蒸馏水中溶解13.5g CaCl26H2O，用0.22m滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20。111mol/L二硫苏糖醇（DTT）溶液【配制方法】用20ml 0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT，过滤除菌后分装成1ml小份贮存于-20。【注意】DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理。12脱

25、氧核苷三磷酸（dNTP）溶液【配制方法】把每一种dNTP溶解于水至浓度各为100mmol/L左右，用微量移液器吸取0.05mol/l Tris碱分别调节每一dNTP溶液的pH值7.0（用pH试纸检测），把中和后的每种dNTP溶液各取一份作适当稀释，在下表中给出的波长下读取光密度计算出每种dNTP的实际浓度，然后用水稀释成终浓度为50mmol/L的dNTP，分装成小份贮存于-70。碱基波长（nm）消化系数（）L/（molcm）A2591.54104G2531.37104C2719.10103T2607.40103比色杯光径为1cm时,吸光度=M130.5mol/l EDTA(pH8.0)溶液【配制方法】在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2H2O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0（约需20g NaOH颗粒）然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。【注意】EDTA二钠盐需加入NaOH将溶液的pH值调至接近8.0，才能完全溶解。14溴化乙锭（10mg/ml溶液）【配制方法】在100ml水中加入1