网络药理揭示脾气虚证的生物学基础及中药治疗.docx

1、网络药理揭示脾气虚证的生物学基础及中药治疗Oxidative Medicine and Cellular Longevity-氧化药物与细胞寿命研究文章网络药理揭示脾气虚证的生物学基础和中草药治疗脾气虚（SQD）综合征是与多种疾病（包括慢性炎症和高血压）相关的基本中医（TCM）综合征之一，并指导许多草药配方的使用。但是，由于缺乏适当的方法，SQD综合征的生物学基础尚未明确阐明。在这里，我们提出了一种结合计算，临床和实验研究的网络药理策略，以研究SQD综合征的生物学基础。从计算方面来看，我们使用了功能强大的疾病基因预测算法来预测SQD综合征生物分子网络，该网络显着丰富了包括免疫调节，氧化应激和脂

2、质代谢在内的生物学功能。从临床角度来看，SQD综合征涉及局部和整体疾病，即消化系统疾病和全身功能异常。我们分别研究与SQD综合征相关的消化系统疾病，包括慢性胃炎和肠易激综合症以及全身功能障碍，例如慢性疲劳综合征和高血压。我们发现慢性胃炎患者和肠易激综合征患者的SQD综合征生物分子网络功能异常先天性免疫和氧化应激模块。慢性疲劳综合征患者和高血压患者的淋巴细胞模块被下调。从实验方面，网络药理分析表明，黄芪和其他四种常用于SQD综合征的草药的靶点在SQD综合征生物分子网络中显着丰富。实验进一步证实了黄芪成分能促进免疫功能，例如巨噬细胞增殖和淋巴细胞增殖。这些发现表明，SQD综合征的生物学基础与免疫反

3、应不足密切相关，包括降低的巨噬细胞活性和降低的淋巴细胞增殖。这项研究不仅证明了SQD综合征的潜在生物学基础，而且为从网络药理学角度探讨疾病-综合征-草药的相关分子机制提供了新的策略。1.引言了解综合症的生物学基础（繁体中文为“ZHENG”）是中医药现代化的重要组成部分。脾气虚（SQD）综合征是最常见的中医综合征之一，其特征是疲劳，腹胀，无聊和其他表型1、2。但是，当前对SQD综合征的研究在某种程度上是有限的3，可能不适合从系统的角度阐明SQD综合征的生物学基础。一些研究探索了中医某些典型证候的生物学基础，例如冷证候和热证候。根据网络药理分析，感冒综合症和热感综合症与代谢免疫失衡密切相关4。通过

4、整合临床转录谱，已将冷综合症和热综合症的生物学网络应用于临床研究。感冒综合症背后的网络模块表明，感冒综合症患者的能量代谢下降5。此外，Hot综合征的生物分子网络表明，患有Hot综合征的慢性胃炎的炎症反应增加6。这些发现为研究其他典型综合征（如SQD综合征）的分子和系统水平提供了重要基础。与SQD综合征相关的研究主要包括临床观察和实验。在临床上，从中医的整体观点来看，SQD综合征不仅指局部消化系统疾病，例如慢性胃炎和肠易激综合症，还包括全身功能障碍，例如慢性疲劳综合征和高血压7-9。用实验术语，通过利血平注射或不规律的食物管理已经建立了动物模型10。了解SQD综合征的生物学基础可能会指导循证使用

5、草药配方。 中国国家基本医疗保险药物目录中的“四君子”汤等中草药配方在临床上被广泛用于治疗慢性胃炎和其他与SQD综合征相关的疾病11，12。这些草药配方的大多数研究都集中在免疫，抗氧化和新陈代谢上13-15。从系统的角度揭示中医证候的生物学基础，对于中医证候相关疾病的精准医学将有很大帮助。随着人工智能和大数据时代的到来，信息科学和组学技术的飞速发展为超越当前医学研究方法的局限性和建立新的基于网络的方法提供了坚实的基础4，16。近年来，提出了“网络目标，多成分治疗”方法来研究复杂疾病和草药配方17。网络目标是网络药理学的核心原则。网络目标不同于“一种目标，一种药物”的范式，它是指将疾病和中医综合

6、症的潜在生物网络作为治疗目标，从而破译多目标药物和草药配方的系统作用机制的新颖概念18。 。越来越多的证据表明，网络目标方法适合于阐明中医证候的生物学基础和草药治疗。例如，网络目标方法用于检测中药方清络阴的抗风湿机理，以治疗热综合征相关的类风湿性关节炎19，并揭示葛根根秦连汤的分子机制。一种古老而有效的草药配方，用于治疗“湿热”综合征II型糖尿病20。在本文中，基于网络目标理论，我们进一步提出了一种将计算机，临床和实验研究相结合的网络药理学方法，以阐明SQD综合征，疾病和草药之间的生物学联系（图1）。首先，我们通过计算预测与SQD综合征相关的生物分子网络。然后，我们从SQD综合征相关疾病（如慢

7、性胃炎和高血压）的临床转录组数据中进一步研究了该网络的生物学功能，包括免疫和氧化应激。此外，网络药理分析表明，常用于SQD综合征的黄芪，白术，党参，人参和薯Di的靶标在SQD综合征生物分子网络中显着丰富。实验进一步证实了黄芪成分能促进SQD综合征生物分子网络的免疫模块。网络药理策略可以为将基于经验的中医证候转化为基于生物网络的中医精准医学提供一种新方法。材料和方法2.1 SQD综合征生物分子网络的预测方法。在这项工作中，我们使用CIPHER算法和SQD综合征的14种临床表型在全基因组水平上预测了SQD综合征相关的生物分子（补充表S1）。根据算法的高精度，选择前500个生物分子以形成与SQD相关

8、的生物分子列表。根据预测的生物分子，蛋白质-蛋白质相互作用和信号传导途径，我们生成了SQD综合征生物分子网络。 CIPHER是一种功能强大的基于疾病基因网络的预测算法21。原则上，此算法通过基于网络的OMIM记录的疾病和TCM综合征之间的多种表型相似性以及候选生物分子之间的蛋白质相互作用（PPI），探索了人类表型生物分子的模块性。该网络药理算法已在国际期刊上进行了稳健的评估，并用于鉴定临床生物标志物22，23。2.2 SQD综合征生物分子网络的计算验证。在挖掘有关SQD综合征或化合物的文献时，我们使用关键词“脾气虚弱综合征”或摘要中的化合物名称搜索PubMed数据库，并记录了搜索结果的总数。我

9、们下载了已识别的摘要，并使用文本处理程序提取了摘要中列出的生物分子。为了对SQD综合征相关生物分子进行CIPHER预测的可靠性，我们随机将蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络随机洗牌1000次，以计算一致性得分以预测表型与基因的关系。 PPI网络是通过13,388个生物分子之间的137,037个相互作用生成的。我们每次在网络中选择500个生物分子作为SQD综合征的预测生物分子。文献挖掘是通过开源编程语言Ruby（版本2.3.0）进行的。如果一个生物分子的摘要与SQD综合征或化合物名称同时出现，则我们手动验证并认为该生物分子与SQD综合征和草药成分有关。我们计算召回率以进行预测和精确度计算，分别

10、为查全率= 预测的生物分子与报告的生物分子/报告的生物分子的交集100，精度= 预测的生物分子与报告的生物分子/预测的生物分子的交集100。图1：用于揭示SQD综合征和草药治疗的生物学基础的网络药理策略工作流程。2.3 SQD综合征生物分子网络的生物学功能富集分析。 我们对与SQD综合征相关的预测生物分子进行了生物功能富集分析。使用Fisher精确检验确定了预测的生物分子在GO生物学过程或KEGG信号通路的基因集中的富集意义24，25。 选择了显着丰富的生物学过程和途径（P 0:05）进行进一步的计算分析。 wQED由以下公式33计算： 其中d是单个期望函数，是应用于每个函数的权重，n是描述符

11、的数量。所选成分的潜在目标是通过drugCIPHER预测的34，这是一种用于预测化合物目标的网络药理算法。原则上，通过将给定化合物与FDA批准的药物的关联以及FDA批准的药物的已知靶标的关联整合到PPI网络中，药物CIPHER可以预测每种化合物的目标列表。复合目标相互作用的可能性定义为其中dj是与给定蛋白p结合的已知药物j.p和pdj是模型系数。 CSd是化合物d与算法模型中已知药物的相似性向量。 根据每个化合物目标的一致性得分，drugCIPHER优先考虑PPI网络中的蛋白质，并通过以下公式将具有较高一致性得分pd的候选蛋白假定为该化合物的推定目标：具有高一致性分数的化合物和蛋白质更可能表现

12、出药物-靶标相互作用。 根据drugCIPHER算法的高精度，将每种化合物的前100个预测目标选作潜在目标。一些目标可能出现在SQD综合征的草药中许多成分的目标列表中。 为了评估目标蛋白与草药有关的SQD综合征药理作用的可能性，我们比较了所有成分的目标列表中每个目标的出现次数。 建立统计模型以比较每种草药与随机背景中目标蛋白的出现次数； 这项分析得出了每种草药的靶标，它们是频繁发生的靶标（P k衡量目标在1000多个随机案例中出现在k个以上目标列表中的概率。 调整后的P值表明针对SQD综合征的草药靶标具有重要意义（P值0.05为显着）。 SQD综合征的草药目标预测由开源编程语言R（版本3.6.

13、1）执行。2.6. SQD综合征生物分子网络的实验材料和方法2.6.1.试剂。 黄芪甲苷I和黄芪甲苷II购自南京精竹生物技术有限公司。黄芪甲苷IV（98纯度）购自成都Herbpurify有限公司，黄芪多糖（70纯度）购自上海麦克林有限公司。 将化合物溶解在二甲基亚砜（DMSO）中（最终浓度0：1），用作实验的溶剂对照。 为了进行实验，将化合物溶解在碱性溶液中。 青霉素钠盐和硫酸链霉素购自华北制药有限公司。DMEM和胰蛋白酶购自Gibco。 RPMI-1640培养基购自北京Keyin Watson科学发展有限公司，胎牛血清购自北京元上圣马生物技术研究所。 DMSO由北京化工厂生产。 溴化四氮唑（

14、MTT）由北京索莱布尔技术有限公司提供。 ConA和LPS购自Sigma-Aldrich。2.6.2。 细胞培养。 小鼠巨噬细胞RAW264.7是王文杰教授（中国医学科学院药物研究所的礼物）提供的。 将细胞在37下在含有5CO 2的培养箱中在补充有10胎牛血清和100U / ml青霉素的DMEM中培养。 所有细胞用0.25胰蛋白酶-EDTA消化，并每周传代两次。2.6.3。 用于SQD综合征的草药的巨噬细胞增殖。 将Raw264.7细胞以5104细胞/ ml的浓度接种到96孔板中。 温育24小时后，将细胞分别用5M或50M黄芪甲苷I（wQED = 0：131），黄芪甲苷II（wQED = 0：

15、131），黄芪甲苷IV（wQED = 0：131）和黄芪多糖（ wQED = 0：571）。 然后，将细胞置于培养箱中96小时。 孵育结束前四个小时，将50lMTT储备溶液（2 mg / ml； Soleble Technology，中国）添加到每个孔中。孵育后，通过离心（2000 rpm，10分钟）沉淀细胞。 然后，我们轻轻倒出细胞培养基，并用纸巾干燥样品。 然后，将150L的DMSO添加至每个孔。 通过振荡将细胞和DMSO完全混合后，使用ELISA读数器（美国Bio-Rad）测量570 nm处的光密度（OD）。2.6.3。 用于SQD综合征的草药的巨噬细胞增殖。 将Raw264.7细胞以5

16、104细胞/ ml的浓度接种到96孔板中。 温育24小时后，将细胞分别用5M或50M黄芪甲苷I（wQED = 0：131），黄芪甲苷II（wQED = 0：131），黄芪甲苷IV（wQED = 0：131）和黄芪多糖（ wQED = 0：571）。 然后，将细胞置于培养箱中96小时。 孵育结束前四个小时，将50lMTT储备溶液（2 mg / ml； Soleble Technology，中国）添加到每个孔中。 孵育后，通过离心（2000 rpm，10分钟）沉淀细胞。 然后，我们轻轻倒出细胞培养基，并用纸巾干燥样品。 然后，将150l的DMSO添加至每个孔。 通过振荡将细胞和DMSO完全混合后，

17、使用ELISA读数器（美国Bio-Rad）测量570 nm处的光密度（OD）。2.6.4. SQD综合征中草药的脾脏淋巴细胞增殖。用于SQD综合征的草药，即能增强脾气的草药，例如黄芪，通常用于治疗结肠癌36。结肠癌具有SQD综合征的临床表型。为了了解中药对SQD综合征的免疫调节作用，我们在与SQD综合征相关的结肠癌模型中进行了脾淋巴细胞增殖实验。所有实验方案均符合实验动物护理和使用指南，并经中国医学科学院北京协和医学院动物护理和使用委员会批准，Balb / c小鼠购自北京微通力华实验所。动物科技有限公司（编号SCXK2012-0001）。将Balb / c雌性小鼠饲养在18-25，50至70相

18、对湿度的受控环境中。 C26细胞由中国医学科学院和北京协和医学院药理研究所保存。将活跃生长的肿瘤组织解剖，切割并研磨，以在无菌生理盐水（5107细胞/ ml）中产生肿瘤细胞悬液。将每只小鼠的背面接种0.2ml细胞悬液。接种后第二天，将Balb / c小鼠随机分为两组，每天一次，给药12天。为了说明用于调节SQD综合征生物分子网络的淋巴细胞功能模块的草药治疗，根据小鼠的初步实验结果，一组接受盐水作为阴性对照，另一组接受50 mg / kg黄芪甲苷IV的治疗。用黄芪甲苷IV处理后，通过颈脱位法处死小鼠，并在无菌条件下取出脾脏，并使用1 ml无菌注射器在研钵中研磨。 然后将细胞悬浮液转移到塑料离心管

19、中并沉淀。 将细胞稀释至1107细胞/ ml，并将100l/孔的细胞悬浮液接种在96孔细胞培养板（含3.0g/ ml的ConA或5.0g/ ml的LPS）中。 将细胞培养板置于37，5CO 2的培养箱中48小时。 孵育结束前四个小时，将50lMTT溶液（2 mg / ml； Soleble Technology，中国）添加到每个孔中。 然后，将板以2000 rpm离心10分钟以沉淀细胞，并用组织除去残留的MTT溶液。 向每个孔中总共添加150lDMSO。 完全混合后，使用ELISA读数器（Bio-Rad，USA）测量570nm处的OD。2.7。 SQD综合征生物分子网络的统计分析。 统计显着性

20、是通过GraphPad Prism 5.0使用Student t检验在临床转录谱和实验中进行的。 数据表示为实验中的平均值标准偏差。 费希尔的精确测试通过编程语言R（版本3.6.1）和Ruby（版本2.3.0）进行了富集分析。 P值小于或等于0.05被认为是显着的。表1：SQD综合征生物分子网络的几种丰富的生物学过程和途径。3.结果3.1。 SQD综合征生物分子网络的计算分析。 我们使用14种SQD综合征临床表型的CIPHER方法在全基因组水平上预测了SQD综合征生物分子网络（补充表S1）。根据CIPHER算法的高准确度，预计前500个生物分子将形成与SQD相关的生物分子网络21。 如表1所列

21、，这些生物分子在免疫途径和生物学过程中显着丰富，包括免疫力，代谢，内分泌生物学功能，例如T细胞受体信号传导途径，对氧化应激的反应以及脂质代谢过程的调节。 结果表明，SQD综合征的生物学基础与上述生物学过程密切相关，如图2（a）所示。通过文献挖掘进一步验证了SQD综合征生物分子网络的富集结果。我们在文献中寻找丰富的生物学功能与SQD综合征之间的关系。患有SQD综合征的患者可能会出现免疫疾病。我们以SQD综合征相关网络的免疫模块为起点，系统地了解SQD综合征的免疫相关生物学基础（图2（b）。计算通过CIPHER预测的与SQD综合征相关的预测生物分子的准确性和召回率，以通过文献挖掘进行验证。与SQD

22、综合征相关的预测生物分子的准确性和召回率显着高于随机选择的生物分子（图2（c）。表2列出了SQD综合征免疫生物分子网络中度数最高的前20个节点及其生物学功能。如图2（d）所示，文献中未引用的与SQD综合征相关的预测分子为上游或同一路径。 SQD综合征生物分子网络为进一步揭示SQD综合征的生物学基础提供了科学支持。SQD综合征表型-生物分子协同模块网络SQD综合征的生物分子网络与免疫功能图2：基于临床表型和蛋白质-蛋白质相互作用构建了SQD综合征基础的生物分子网络。 （a）SQD综合征表型-生物分子协同模块网络。 （b）SQD综合征免疫生物分子网络（标记了在免疫生物过程和途径中显着丰富的生物分子

23、，P 0:05）。 （c）验证SQD综合征生物分子网络。 （d）文献中未报道的SQD综合征的预测生物分子位于上游或处于同一途径。表2：SQD综合征生物分子网络中的免疫相关结点。3.2、慢性胃炎患者和IBS患者转录特征中SQD综合征生物分子网络的先天免疫模块减少。从中医的整体观点来看，SQD综合征既涉及局部疾病，也涉及整体疾病，与许多疾病密切相关。在中国国家知识基础设施（CNKI）数据库的摘要中进行了文献挖掘，以识别与SQD综合征相关的疾病。慢性胃炎和肠易激综合症（IBS）是与SQD综合征相关的消化系统疾病。我们分析了患有冷综合征（诊断为SSDC综合征）或热综合征（诊断为SSDH综合征）和IBS

24、患者或正常个体的慢性萎缩性胃炎（CAG）患者组织样本中的基因表达谱。 SSDC综合征和IBS与SQD综合征密切相关，SQD综合征表现出相似的表型（例如，无聊，疲劳，疲倦和粪便稀疏）。 SQD综合征生物分子网络中患有Cold综合征的慢性胃炎和IBS患者的DEG参与免疫功能和对氧化应激的反应（图3（a）。 DEG分析显示，慢性胃炎和肠易激综合症的几种免疫功能和氧化应激异常（图3（b）和3（c）。就免疫功能而言，通过整合转录组数据，慢性感冒综合征的慢性胃炎患者中，SQD综合征生物分子网络的巨噬细胞增殖相关基因表达水平较低（图3（d）和3（e）。在IBS患者的转录组数据中，与NK细胞活性有关的基因表达

25、在网络中下降（图3（f）和3（g）。在氧化应激方面，网络节点JAK2介导与JAKSTAT信号通路相关的氧化应激，而GSTT1调节谷胱甘肽代谢过程以执行氧化应激活性。通过整合网络分析和转录谱，我们说明了SQD综合征生物分子网络中先天免疫和氧化应激模块的功能障碍。慢性胃炎和IBS基因在SQD综合征生物分子网络中有差异表达图3：SQD综合征的免疫分子网络涵盖了慢性胃炎患者和IBS患者免疫功能中的DEG。 （a）SQD综合征生物分子网络中患有SSDC综合征的慢性胃炎患者的DEG和IBS患者的IBS患者的DEG。 （b）在患有SSDC综合征或SSDH综合征的慢性胃炎患者中所选基因的表达。 （c）所选基因

26、在正常个体和IBS患者中的表达。 （d）与SSDC综合征的慢性胃炎中巨噬细胞有关的基因表达。 （e）SQD综合征免疫分子网络中患有SSDC综合征的慢性胃炎的DEGs会降低巨噬细胞功能。 P 0:05， P 0:01：与患有SSDH综合征的慢性胃炎患者相比。 （f）与IBS患者中NK细胞介导的生物活性有关的基因表达。 （g）调节SQD综合征SQD综合征生物分子网络中NK细胞途径的IBS患者的DEG。 P 0:05， P 0:01：与正常组相比。3.3。 CFS患者和高血压患者的转录特征中SQD综合征生物分子网络的淋巴细胞活性降低。 SQD综合征也是一种全身机能障碍。从中医的整体角度来看，SQD综

27、合征不仅指局部消化系统疾病，而且还包含全身功能障碍，例如慢性疲劳综合征（CFS）和高血压。 CFS和高血压具有SQD综合征的某些临床表现7，37。因此，为了调查SQD综合征的整体生物学基础，我们分析了与CFS和高血压相关的基因表达谱，以阐明SQD综合征生物分子网络的生物学特征。这些疾病中与免疫相关的DEG被SQD综合征免疫生物分子网络显着覆盖（P 0:05）。 SQD综合征免疫生物分子网络中存在CFS和高血压中的免疫相关DEG（图4（a）。差异基因表达的分析揭示了慢性疲劳综合征（图4（b）和高血压（图4（c）中的几种免疫功能障碍。 CFS患者中某些表达降低的基因与T细胞功能显着相关（图5（a）

28、。例如，NFATC1的低表达调节IFNG和其他基因以减少适应性免疫反应（图5（b）。此外，高血压患者的基因下调与B细胞功能有关，如图5（c）所示。 B细胞受体信号传导途径中VAV3和其他基因的减少降低了Ig的产生（图5（d）。以上结果表明SQD综合征的适应性免疫功能降低。图4：SQD综合征的免疫生物分子网络包含SQD综合征相关疾病的免疫功能。 （a）CQD综合征免疫分子网络中CFS或高血压中的DEG。 （b）所选基因在正常人和CFS患者中的表达。 （c）所选基因在正常个体和高血压患者中的表达。图5：（a）在正常个体和CFS患者中选择的基因表达。 （b）SQD综合征免疫分子网络中CFS中的DEG

29、s降低了T细胞免疫功能。 （c）在正常个体和高血压患者中选择的基因表达。 （d）SQD综合征免疫分子网络中高血压中的DEGs降低了B细胞的免疫功能。 P 0:05， P 0:01：与正常组相比。3.4、 SQD综合征中草药治疗的网络药理分析。 SQD综合征表现出其特定的表型，并且与增强脾气的草药密切相关。因此，SQD综合征不仅与表型有关，而且与草药治疗有关。 CNKI数据库中与SQD综合征相关的表型通常使用五种草药，即用于补脾益气的草药，如白术，黄芪，党参，人参和山药。这些草药还用于治疗与SQD综合征相关的疾病11，38-40。草药成分往往会结合多个靶标。因此，我们试图确定由草药成分调节的目标，并了解预测目标之间的关系18，41。我们通过对100多个文献记录的SQD综合征中草药成分进行文献挖掘来验证预测目标的可靠性。如图6（a）所示，与具有文献证据的代表性草药成分相关的生物分子中有70以上是相关的通过直接映射或间接连接（例如PPI或信号通路）与潜在目标联系。结果表明，预测的目标可以帮助描述这些草药治疗SQD综合征的机制。SQD综合征免疫生物分子网络可用于区分SQD综合征的草药和其他综合征的草药。在这里，在CNKI数据库中选择了五种没有文献证据来治疗SQD综合征的