PGM测序方法protocol.docx

1、PGM测序方法protocol314芯片测序方法文库构建：PCR扩增基因组DNA的目标区域1.选择下方合适的表格是基于用户选择的是2x的引物池还是5x的引物池。对每一 个DNA和引物池的混合，将以下组分加入PCR管内。以下表格提供了包含和未包 含Ion Amp I i Seq Samp I e ID Panel的反应体系。对多个反应可准备配置混合溶液。2X 引物池(Cat. nos. 4477685, 4477686, and custom panels)5X 引物池(Cat. nos, 4471262 and 4475346)2.充分震荡，简单离心。3.将PCR管賓.于PCR仪内，运行一下程

2、序以扩增基因组上目标区域。阶段步骤温度时间持续酶活化99 C2分钟循环数（根据下变性99C15秒表格设置）退火/延伸60C4/8/16* 分钟持续10C持续+*4分钟是对W1536对引物池：8分钟是对1537-6144对引物池：16分钟是对6145-24576对引物池。+PCR产物可置于10C过夜储存。注意：Ready- to - use panels：当加入 Ion Amp I iSeq Samp I e ID panel 时不需要调整彳盾 环数。Custom primer pools：如果一个custom设计的panel中包含两个引物池， 并分别落在不同的循环数分类中，请选用更大的循环数来

3、扩増这两个引物池。一般标准样品可以增加一个徧环，从而保证其扩增效率，石蜡切片样品可增加2-3个徧环。暂停点-PCR产扬可以储存在10 C过夜，需要更长时间储存，可以置于2（T C.部分消化引物序列1.轻度离心PCR管将反应后溶液收集到管底。往每个混合反应液中加入2微升 FuPa Reagent ,总体系达到22微升。2.充分振荡混匀，轻度离心将液体收集到管底。（也可以选择用枪吸取一半以上的液 体上下吹打至少5次来混匀）3.将PCR管放入PCR仪，按以下程序运行。温度时间50C10分钟55C10分钟60C20分钟10C持续（最长至1小时）将接头连接至扩增产物并纯化配蚤并运行连燥反应1.如果有可见

4、的沉淀物在Switch溶液中，通过室温下炭荡或上下吹吸来溶解并重悬。2.小心PCR管加入以下成分到每个反应孔内消化样本。在加入之前可先混合Switch 溶液和接头。Example barcode adapter mix for up to 厶 reactionsComponentVolumeIon P1 Adapter2pLIon Xpress,M Barcode X*2pLNuclease-free Waterh pLTotal8 pLX = barcode chosen成分 体积（u L）Switch Solution4稀释的barcode接头混合物2总体积283.在每个PCR管内加入2微

5、升DNA连接酶。4充分振荡混匀，轻度离心将液体收集到管底。（也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀）5将PCR管放入PCR仪，按以下程序运行。温度时间22C30分钟72C10分钟10cC持续（最长至1小时）暂停点-产物可以1于-20 C保存。纯化未扩增的文库使用Agencourt AMPure XP试剂1.5x样本体积重要事项!-将AMPureXP reagent 置于室温并充分振荡将磁殊混匀，使用时缓慢吸 取接下来的步骤需要使用新鲜配置的70%乙醇。对每个样品，混合230微升无水乙醇和100 微升无核酶水。1.将加完接头的文库转移至1.5ml离心管内，加入45微升（15x样本

6、体积）的 Agencourt AMPure XP试剂。用枪吹打5次使DNA与磁珠悬浮液充分混匀。2.将混合液置于室温5分钟。3.将 1.5ml 离心管置于 DynaMag - 96 Side Magnet （Cat. no. 12331D）磁力架 上，静置2分钟或者等溶液变清澈。小心地吸走并弃掉上清，不要扰动磁珠。4.向离心管中加入150 uL新鲜配制的70%乙醇，在磁力上来回移动1.5ml离心管来 洗涤磁珠，然后小心地弃去上清，不要扰动磁珠。5.重复第4步，进行第二次洗涤。6.确保乙醇液滴已全部从孔中吸走。将1.5ml离心管放置于磁力架上，室温空气干燥 5分钟，注意不要过度干燥。7.将1.5

7、ml离心管从磁力架上拿开.在毎管中加入50 u L Low TE充分浸润磁珠。充 分振荡混匀，轻度离心将液体收集到管底。（也可以选择用枪吸取一半以上的液体 上下吹打至少5次来混匀）8.将1.5ml离心管置于磁力架上2分钟。上清液中含有文库。文库扩增：1将 1.5ml EP 管从Z兹力架上取下，加 50 IPI at i num PCR SuperMix High Fidelity 和 2 u Iof L i brary Amp Ii f i cat i on Pr imer Mix。Platinum PCR SuperMix H i gh Fidel ity和Library Amp I i f

8、 i cat i on Pr imer Mix需要事先混合好。充分漩涡震 荡E简单离心，或者用枪上下吹吸5次。2.将1.5ml EP管放在型力架上至少2分钟，将上清约50 u I转移到一个干净的 200 u L PCR 内。3.运行一下PCR程序StageTemperatureTimeHold98C2 min5 cycles98C15 sec64C1 minHold10CHold纯化扩增后的文库第一轮纯化1. 力u入 25 n I （0. 5X 的样品体积）Agencourt AMPure XP Reagent 到每个样品管中，用移液枪吹吸5次。2.室温下静置5分钟。3.将样品管放在離力架上至

9、少5分钟，直至溶液变澄清。4.小心的将上清移入另一个干净的PCR管中。第二轮纯化1.在第一轮纯化取到的上清中加入 60 u I Agencourt AMPure XP Reagent,用枪头反复吹吸 5 次2.室温下静置5分钟。3.将样品管放在磁力架上至少3分钟，直至溶液变澄清，将上清吸除。4.加入150 u I新鲜配置的70%的酒精，缓慢璇转两圈，将上清吸除。5.重复步骤46.确保酒精完全被移除，打开管盖，常温干燥5分钟。7.将样品管从磁力架上取下，加入50 n I Low TE,充分漩涡震荡，简单离心， 或将移液枪调至40 u I吹吸5次。8.将样品管放入離力架后，静置两分钟，将上清转移到

10、新的1.5ml离心管。Qubit定量1制 备 Qubit dsDNA HS reagent 稀 释液： 1 u I Qubit dsDNA HS reagent 加 199 u I Qubit dsDNA HS Buffero2在 10 n L 的 amp I i f i ed Ion Amp I iSeq I ibrary 中加入 190 1 L 的dye reagent,混合充分后静置2分钟。3.1 p L样品中加入199 n L dye reagent进行测样。定量完成后，不同引物的相同样品的管合为一管（相同浓度）每管定到300PM,混合后能达到100PMoIon PGM 200bp自动

11、模本制备在 Ion OneTouch 2 instrument Ji制备模板 ISP1.4.1 Ion OneTouch 2 仪器准备1.4.1.1打开Ion OneTouch 2背面的电源开关：按触摸屛上OPEN LID,等待离心机盖 打开；1.4.1.2 参照图 1 将 Recovery Tubes (Ion PGM M Template 0T2 Suppl ies 200)放置于Ion OneTouch 2离心收集器的转子中，随后将Recovery Routers (Ion PGMTemplate 0T2 Suppl ies 200) 放置于相应位置，手动盖上离心机盖：Reorders1

12、Romer -Tube1.4.1.3 参照图 2 顺序将 Ion OneTouch 2 Amp I i f i cat i on PI ate ( Ion PGM M Template0T2 Suppl ies 200)放置于加热模块中，将加热模块手柄压向自己身体方向,盖上Ion OneTouch Lid,导管固定于上端的卡口和正面右上角的支架上， 将 Ampl if icat ion Plate 的注射针垂直插入 Ion OneTouch DL Injector Hub, 直至接触到底部的Recovery Router,然后松开注射针 s1.4.1.4 Ion OneTouch Oi I 和

13、 Ion PGM 0T2 Recovery So I ut i on 添加1.4.1.4.1每次开始使用新的Ion PGM Template 0T2 200 Kit,丢弃掉前一个试剂盒 使用的 Ion OneTouch Sipper 和 Ion OneTouch1 Tubes,戴上新的乳胶手 套，装上新的 Ion OneTouch Sipper； Ion OneTouch Oi I 瓶(Ion PGMM Template 0T2 Solutions 200)上下颠倒10次，倒入任意一个新的Ion OneTouch Tube中，约1/2满，安装至标示有人 的下方相应位置拧紧； Ion PGM 0

14、T2 Recovery So I ut i on (Ion PGM w Template 0T2 Solutions 200) 倒入另一个新的I on OneTouch Tube中，约1/3满，安装至标示有0的下 方相应位置拧紧；1.4.1.4.2 同一个 I on PGM Temp I ate 0T2 200 Kit 的后续使用准备时，将 I on OneTouch Oi I (Ion PGM Q Template 0T2 Solutions 200)瓶上下颠倒 10 次，取 下有Ion OneTouch 0i I的Ion OneTouch Tube,剧烈混匀至产生微小的 气泡(图3),加入

15、Ion OneTouch Oil,约1/2满，安装至标示有(人的 下方相应位置拧紧：将 Ion PGM 0T2 Recovery So I ut i on ( Ion PGM Template 0T2 Solutions 200)倒入另一个的含有 Ion PGM 0T2 Recovery Solution 的I on OneTouch Tube中，约1/3满，安装至标示有的下方相应位置拧 紧；1.4.2 Ion OneTouch反应液相准备及上机1.4.2. 1按照如下表格顺序室温配置体系，试剂来自I on PGM Temp I ate 0T2 Reagents200顺序试剂管盖颜色体积（ul

16、）处理方式及状态1Nuclease-Free Water252Ion PGM Template 0T2 200 Reagent Mix紫色500提前室温放置，充分溶解 至无沉淀，漩涡混合确保 充分溶解，使用后剩余的 保存于4C3Ion PGM Template 0T2 200 PCR Reagent B蓝色300充分溶解至无沉淀，漩涡 混合确保充分溶解，使用 后剩余的保存于室温4Ion PGM Template 0T2 200 Enzyme Mix褐色50短暂离心后，冰上放置5測序用文库25将定莹好的文库稀释至15ng/mI,取2ul稀释到25ulTota I9001.4.2.2将上述体系涡旋

17、農荡5s,稍离心;1.4. 2.3 将 Ion PGMTemplate 0T2 200 Ion Sphere Particles最大速漩涡混匀1.4. 2. 4 将 Ion PGM OneTouch1minT上下吸打5次后，吸取100ul,加入6. 4. 2. 1的液相体系中.上下吸打 混匀，室温放置备用；Plus React i on FiIter (Ion PGM M Template 0T2Reactions 200）置于15ml离心管上（图4）,将6. 4. 2. 3种配制好的液相体系漩涡混匀5s,短暂离心2s：用1000ul移液器将所有的液相缓慢从距离 另外两个孔较远的样品孔（图4）

18、注入reaction fi Iter，注意移液头与样品孔紧密接触插紧:Fi Iter Tip移液头（防止交叉污染），再缓慢加入500ul Ion OneTouchReaction Oil;1.4.2. 6如图5,将加样孔置于左侧，顺时针倒转reaction f i Iter,避免管内导管接触反应液相；图51.4.2. 7如图6,将reaction f i Iter插入Ion OneTouch相应位置，边缘凸起位置朝向自己；1.4.2.8在系统显示屏上选择RUN （图7）:ion torrentOf bClean Run OptionsOpen Lidj ：1.65 $ 0.00 PSI j 3

19、5.1 C图71.4.2.9 选择 Ion PGM Template 0T2 200 kit （图 8）PGM： Ion PGM Template OT2 200 Kit图81.4.2. 10然后选择Expert,最后点击NEXT开始运行。1.4.3 运行结束及Ion OneTouch 清洗6. 4. 3. 1模板制备程序运行结束，在显示屏上选择两次next键，进入离心程序，约10m i n;6. 4. 3. 2将注射针拔出，放入一个空的50mL的管子（图9）;图91.4.3. 3打开离心收集器盖，用淸洁纸巾将盖子上的液体擦拭干净，拿掉RecoveryRouter,小心缓慢将Recovery

20、Tubes取出放于板架上，模板ISP位于Recovery Tubes 底部外侧（图 10）Rwvery TubeLocation or iSP peiiee图101.4.3. 4 拿 4 Reaction Filter,将 Cleaning Adapter （ Ion PGM Template 0T2Suppl ies 200）凸出部分面向自己插入相应位置（图门）图111.4.3.5选择next铁退出离心程序，回到主界面，在屏幕上选择Clear,1.4.3.6根据提示选择next,直至程序运行，运行时间约10min1.4.3. 7清洗结束后取下Ampl if ication Plate和废液管

21、一起扔进专门的垃圾桶, 关闭电源Ion OneTouch ES的操作及阳性模板富集1.5.1沿远离沉淀一侧，自液面开始小心将两管Recovery Tubes中的上清液吸掉， 各舸余约50uL;1.5.2 取一个新的 1.5mL 的 Non-St ick Tube,将 Recovery Tubes 中剩余 50uL 液 体吹打10次后吸入其中；1.5.3 在两管 Recovery Tubes 中各加入 100uL Wash Solution (Ion OneTouch 200 Solutions Kit v2),吹打混匀后，吸入 6. 4. 2 的 1.5mL Non-Stick Tube 中；

22、1.5 4 在 6. 5. 3 的5mL Non-Stick Tubes 中再加入 1000uL 200uL Wash Solution, 最大转速漩涡振荡10s混匀，15500g离心3min;1.5.5沿远离沉淀一侧，自液面开始小心吸掉上清液，剩余100uL在管底，低速漩 涡振荡10s混匀；1.5.6配制好新鲜的1M NaOH(1M NaOH 长可在一周内使用)；取一个15mL普通离心管，按如下表格配制Melt-Off Solution (每次新鲜 配制)顺序试剂体积(ul)1Tween solution (Ion PGM Template 0T2Solutions 200)28021M N

23、aOH40Total3201.5.7 吸取 130uL MyOne Beads Wash So I ut i on到一个新的 15mL 的 Non-Stick Tube 中；将 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads 最大转速漩涡震 荡30s,取13.0uL到上述15mL的Non-Stick Tube,漩涡振荡混匀30s, 短暂离心2s;1.5.8将6. 5. 7的离心管置于DynaMag -2 magnet Ji 2min或至溶液澄淸，小心吸 掉上淸，避免碰触沉淀；将离心管从DynaMag -2 magnet上取下，吸取130uL MyOne Beads

24、Wash Solution 到离心管中，漩涡振荡悬浮 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads;1.5. 9 取一个 8-we I I strip (Ion PGM Template 0T2 Supplies 200),方头永远自己的左面，从左到右依次编号为1到8 （图12）:图121.5.10按如下表格在8-we I I strip中加入相应试剂(Ion PGM Temp I ate 0T2Solutions 200)孔綸号对应孔试剂1（方头第一个）6. 5.5 中的 100ul 模板 ISP (U)26. 5. 8 中 130ul Dynabeads My

25、One Streptavidin C1 Beads (B)3300uL Ion OneTouch Wash So Iut ion (W)4300uL Ion OneTouch Wash So Iut ion (W)5300uL Ion OneTouch Wash So Iut ion (W)6空7吸取 300uL6. 5. 6 中新绊配制的 Melt-Off solution (M)8空1.5.11将8-well strip放入Ion OneTouch ES前方白色模块中的凹槽中，方头在左，紧亲在凹槽右侧；1.5.12 取一个新的 Tip (Ion PGM w Template 0T2 Sup

26、pl ies 200)放入 Tip Loader中，从支架上取下Tip Arm插入Tip Loader中，用力向下按紧1s,松开，取下Tip Arm放回支架上（一定要放到位），新的Tip已装在Tip Arm下方（图13）:图131.5.13在Tip Arm下方的洞中放一个开口的02ml的PCR管，里面加入 Neutra I ization So I ut i on 10u I （Ion PGM Template 0T2 Solutions 200）;1.5.14打开Ion OneTouch ES电源，按Start/Stop键，运行过程中显示屏上一 直显示run , Ion OneTouch E

27、S自动开始阳性模板富集；1.5.15富集过程结束是,Ion OneTouch ES会有蜂鸣提示，并且显示屏显示“End”, 整个过程约40mi n:1.5.16结束后，将用过的Tip取下，和8-wel I strip 起扔进专门的垃圾桶，关 闭电源1.5.17取出0. 2mL PCR管扣上盖子,15500g离心3min;1.5.18沿远离沉淀一侧，从液面开始小心吸掉上清,剩余10uL在管底；1.5.19 加入 200uL Ion OneTouch Wash Solution,上下吹打混匀 10 次,15500g 离心3min,沿远离沉淀一侧，从液面开始小心吸掉上清，剩余10uL在管底；1.5.

28、20 加入 100uL Ion OneTouch Wash Solution,上下吹打混匀 10 次，若不立 即进行后续的测序，可置于4C保存2-3天。Ion PGM 200bp读长上机测序操作PGM的清洗1.2.1氣片清洗（如果PGM趨过48个小时未使用，请首先用氟片清洗）：1.2.1. 1将VM氣片淸洗瓶用每次50ml 18MQ去离子水漂洗3次，备用：W1清洗瓶用每 次50ml 18MQ去离子水漂洗3次后.加满250ml 18MQ去离子水，备用；1.2.1.2将1L的容器用毎次100ml 18MQ去离子水漂洗3次，装满1L18MQ去离子水， 放入一片 PGM Cleaning Tablet

29、 （Ion PGM Sequencing Solutions 200 Kit v2）,静置 10min;1.2.1.3 10min后，加入1ml 1M NaOH,混匀（该溶液请在2-3小时之内使用）;1.2.1.4用0. 22um滤器过滤250ml以上氟片溶液到W1氣片清洗瓶中；1.2.1.5打开PGM电源，氨气输出气压调至30psi;1.2.1.6 PGM启动完毕后，点击进入Clean莱单，确保芯片座上有一块旧芯片；1.2.1.7 按屛幕提示，勾选 Chlorite cleaning,点击 NEXT:1.2.1.8通过后扶提示将W1氣片清洗瓶拧上W1位（保证有吸管）：1.2.1.9将W2和W

30、3清洗瓶拧上相应的位置保证有各自的空清洗瓶及吸管，清空废液瓶 的废液；1.2.1.10去掉前端四种dNTPs尖底管，不要职下吸管，在吸管下放置废液缸；1.2.1.11按next,进入清洗程序；1.2.1.12第一轮清洗结束后，用18MQ去离子水涮洗W1位的吸管，将含250ml 18MQ 去离子水的W1清洗瓶拧上W1位，按next进入第二轮清洗程序；1.2.1.13第二轮清洗结束，整个PGM清洗结束，可进入初始化步骤：1.2.218MQ去离子水清洗（两次初始化之间小于24h）:1.2.2.1 W1清洗瓶用毎次50ml 18MQ去离子水漂洗3次后，加满250ml 18MQ去离子水，备用；1.2.2. 2 打开PGM电源，欽气输出气压调至30psi;1.2.2. 3 PGM启动完毕后，点击进入Clean菜单，确保芯片座上有一块旧芯片；1.2.2. 4 按屏幕提示，勾选 18-M0hm water cleaning,点击 NEXT:1.2.2.5 通过后按提示将W1清洗瓶拧上W1位(保