常用培养基.docx

1、常用培养基1前 言近几十年来，极端环境微生物引起了人们的极大的兴趣，极端环境微生物的研究逐渐成为生命科学的研究热点。在极端环境下,生存有独特的微生物,与普通微生物相比，可能存在着不相同的代谢途径和遗传背景,具有多方面的潜在利用价值，吸引着人们去探索、研究和开发。酸性环境微生物（包括嗜酸微生物及耐酸微生物）就是一类极其重要的极端环境微生物。自然界大多数环境的pH值为59，它适合多数微生物生长。嗜酸菌是一种能在低pH条件下生长和繁殖的极端环境微生物，通常在pH25生长很好，pH5.5以上生长不好1,7,9,13。有些嗜酸菌在中性pH条件下根本不生长，如氧化硫硫杆菌(Thiobacillus thi

2、ooaidans)，酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)，酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)等，最佳生长pH是2.03.0，这些都是专性嗜酸菌。一些真菌也能在pH5.0或更低条件下生长，实际上是耐酸菌9。嗜酸微生物种类丰富，在三域生命中存在嗜酸类群，在某些酸性环境中真核生物比原核生物具有更高的多样性7。极端嗜酸菌(Acidophiles)能生活在pH 1 以下的环境，有些甚至可以生活在pH低于0的环境中。而耐酸微生物还可生长于中性环境中。酸性环境微生物广泛分布于酸性矿山废水、生物沥滤堆以及含硫温泉和土壤，火山区域含硫量极为丰富的地区。对

3、酸性环境微生物应用研究较多的是无机化能自养型嗜酸菌，这些嗜酸菌氧化Fe2+ 、元素硫以及硫化物矿物的生理特性，被用在冶金、环保和农业等领域。用细菌从矿石中提取金属称作细菌浸出或生物湿法冶金，并在在冶金工业上获得成功应用29。多数酸性环境微生物，特别是无机自养型细菌，它们在低品位矿生物沥滤回收贵重金属，原煤脱硫及环境保护等方面有着巨大的优越性和潜在应用价值。其中嗜酸热古细菌还是耐高温酶的重要来源，对它们的研究和应用无疑将开拓酶工业新的领域。此外，酸性环境微生物还被广泛应用到重金属污染土壤的生物修复、硫铁矿烧渣的综合治理、厌氧废水处理系统中H2S的去除以及煤和石油中硫的脱除等方面10,12。对酸性

4、环境微生物的次级代谢产物研究报道较少，近年研究人员发现，酸性环境微生物也可以发现化学结构新颖，作用机理崭新的生物活性物质。美国的研究者从酸性矿山废水中分离到微生物，以海虾致死法等方法确定活性菌株，分离得到具有抗肿瘤活性的Berkelic Acid22，Berkeleydione and Berkeleytrione20,等新化合物。这说明酸性环境微生物也是新颖生物活性物质的重要来源。Berkelic AcidBerkeleydione and Berkeleytrione本实验室近年来致力于微生物活性次级代谢产物的研究，在极端环境微生物次级代谢产物方面做了较多工作，积累了一定经验。酸性环境微生

5、物的活性次级代谢产物研究，国内未见有报道，国际上也报道极少。因此，本实验室开展了耐酸微生物活性物质的研究。本论文即以采自云南建水锰矿（包括矿区土壤）与紫陶土壤为样品，进行耐酸微生物分离、纯化，TLC排重，并采用小鼠白血病细胞P388测试其抗肿瘤活性，为进一步活性代谢产物研究奠定基础。2实验部分2.1耐酸微生物的分离2.1.1实验材料2.1.1.1样品来源本实验采用的样品为云南建水锰矿（包括锰矿土壤）与紫陶土壤，共17个样品。2.1.1.2培养基配方1、PDA培养基土豆20%蔗糖2%琼脂2.3%氯霉素0.02%pH2.0（土豆切丁煮沸20min，纱布过滤，滤液定容：每200g土豆定容1000ml

6、水）2、高氏一号培养基KNO30.1%NaCl2%FeSO4.7H2O0.001%可溶性淀粉2%K2HPO40.05% MgSO4 0.05%琼脂2.3%pH2.0 3、牛肉膏蛋白胨培养基蛋白胨1.0%NaCl0.5%牛肉膏 0.5%琼脂2.3%pH2.0 2.1.1.3实验主要设备与仪器培养皿、试管若干三角瓶：200ml、300ml、500ml、1000ml天平：美国赛多利斯公司BP121S 型高压灭菌锅 MLS3750 SANYO恒温培养箱 MIR253 SANYO洁净工作台 Air Tech 苏州安泰空气技术有限公司2.1.1.4实验试剂麦芽糖 B.R. 甘露醇 B.R. 牛肉膏 B.R

7、. 蛋白胨 B.R. 硫酸镁 A.R. 氯化钠 A.R. 琼脂 A.R. 味精 A.R. 葡萄糖 A.R. 盐酸 A.R. 蔗糖 A.R. 磷酸二氢钾 A.R. 磷酸氢二钾 A.R. 七水合硫酸亚铁 A.R.2.1.2 实验方法2.1.2.1样品分类建水紫陶土壤 红色样1# 建水锰矿土壤 1号样 红色样2# 2号样黄土 3号样白土（砂） 建水锰矿 放电锰（MnO2）1#紫土 放电锰（MnO2）2#黑土 放电锰（MnO2）3#五色混和泥 冶金锰1#建水紫陶半成品样 冶金锰2# 冶金锰3#2.1.2.2涂布a.土壤样品，配三个浓度梯度0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml的土壤悬浊液并

8、涂布平板。置于28C培养箱中培养。比较后选择0.1mg/ml浓度。b.矿石样品在无菌环境以少量无菌水冲洗表面，吸取冲洗液0.3ml涂布平板。2.1.2.3纯化菌落长出后将平板上的单菌落挑出，划线分离，置于28C培养箱中培养。待长出菌落后，挑取单菌落接种于斜面上，置于28C培养箱中培养。待生长好放入4C冰箱保藏。 2.1.3结果与讨论对17个样品进行微生物分离，纯化，总共分到90株酸性环境微生物，包括真菌75株，放线菌15株。其中，从锰矿中分得29株菌，从锰矿土壤和紫陶土中分得61株菌（见图1，表1）。可见在矿区酸性环境下，比较高等的真菌生长更好。在锰矿土壤和紫陶土中可分到大量菌株，而在锰矿中分

9、到的菌种有限。提示土壤中营养成分可能更加丰富，利于微生物生长。17个样品中，建水锰矿土壤、黄土、白土（砂）、五色混和泥、红色样1#、红色样2#,建水锰矿 放电锰（MnO2）3#中分离得到的菌株较多。三种固体培养基中，PDA培养基分到39株，高氏一号培养基分到19株，牛肉膏-蛋白胨培养基分到32株。真菌在三种固体培养基中都可以生长；放线菌主要在PDA培养基上长出。 图1 菌株分离及纯化后的部分菌株照片 表1 分离菌株统计表样品类别锰矿紫陶土壤种 类菌株数总菌株数真菌31放线菌10真菌44放线菌541492.2菌株的TLC排重和细胞毒活性筛选2.2.1实验材料2.2.1.1菌株来源从云南建水锰矿与

10、紫陶土中分得的75株真菌和15株放线菌。2.2.1.2培养基真菌二号 甘露醇2%麦芽糖2%葡萄糖1%味精1%KH2PO40.05%MgSO40.03%酵母浸膏0.3%pH2.0放线菌六号 葡萄糖1%蛋白胨0.5%NaCl0.1%可溶性淀粉1%酵母浸粉1%CaCO30.3%甘油1%pH2.02.2.1.3实验仪器与设备20*200试管若干洁净工作台 Air Tech 苏州安泰空气技术有限公司真空浓缩仪：Savant公司SC250DDA 型。天平：美国赛多利斯公司BP121S 型。三用紫外仪：上海嘉鹏科技有限公司ZF-6 型。高压灭菌锅 MLS3750 SANYO试管式振动培养箱 TCC100R

11、高崎科学器械株式会社 TICSPECTRAMAXplus型酶标仪：美国Molecular Devices Corporation冷冻离心机Biofuge fresco型和Biofuge primo型 (Heraeus公司)相差倒置显微镜CK40 (OLYMPUS公司)二氧化碳培养箱MCO175 (SANYO公司)超净工作台MCV-131BNF(T) (SANYO公司)电动吸引机YB-DX23B (上海医疗器械工业集团公司)2.2.1.4实验试剂甲醇乙酸乙酯5%、80%乙醇氯仿80%三氯醋酸1%醋酸0.4%SRB的1%醋酸溶液Tris非缓冲液2.2.2实验方法2.2.2.1发酵用20*200试管

12、装5ml培养基，将真菌接种于真菌二号培养基，放线菌接种于放线菌六号培养基，试管摇床28、205rpm振荡培养，培养9天以上直至菌体长成熟。2.2.2.2发酵物浸膏的提取向发酵液以1：2加入萃取液，萃取液甲醇：乙酸乙酯为1.5：8.5。发酵液及菌体破碎。加入乙酸乙酯，振荡混合,静置过夜。滤取乙酸乙酯层，真空浓缩得浸膏。浸膏提取流程：2.2.2.3固相萃取取浸膏以5%乙醇溶解上样（XAD-16 树脂柱），用固相萃取仪以5%乙醇洗脱，除去糖和无机盐，馏分收集10ml后弃去。再用80% 乙醇洗脱，收集馏分10ml。余在柱上为脂肪酸等，纯乙醇处理，回收树脂。将80% 乙醇洗脱收集的馏分浓缩，得浸膏，转移

13、至eppendorf管，称重并记录。2.2.2.4 TLC排重取固相萃取后浸膏，以氯仿：甲醇 1：1溶解，高效薄层板点板排重。分别以两个系统：9:1 CHCl3-MeOH以及6:2:1 AcOEt-MeOH-H2O展开，紫外荧光灯254nm下观察，5%磷钼酸及5%香草醛-浓硫酸显色。2.2.2.5活性测试取对数生长期的小鼠白血病P388细胞，用新鲜的DMEM培养基配制成密度为每毫升2104个细胞的细胞悬液，按每孔 200微升接种于96孔板中。预培养24 h后，每孔加入2微升样品，置于37、5%CO2培养箱中培养24 h。取药物作用下培养后的细胞，首先在光学显微镜下观察药物处理引起的形态学变化，

14、判断有无细胞周期抑制，细胞凋亡或细胞坏死的形态学特征。每孔细胞中加入80%三氯醋酸50微升，置于4oC固定1.5小时，用水冲洗5次并空气干燥。每孔加入0.4% SRB的醋酸溶液150微升并在室温静置30分钟。用1%醋酸水清洗4次，除去未结合的游离SRB染料。每孔加入150微升Tris非缓冲液 (10 mmol/L, pH 10.5) 溶解蛋白结合染料并利用MD公司产SPECTRA MAX Plus型酶标仪测定每孔在515 nm处的光密度（OD）值。在同一块96孔板中每个样品均设置三孔，另设三孔空白对照（如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞调零）。取三孔平均OD值按IR%=(OD空白对照-OD样

15、品)/ OD空白对照X100%式计算该浓度下的细胞增殖抑制率 (IR%)。2.2.3结果与讨论 部分菌株发酵时生长缓慢,长势弱,菌体量少,这一现象在从锰矿样品分离到的菌株和放线菌中尤为普遍。宜适当延长在试管摇床中培养的时间，9-21天，每日观察菌体量以确定培养时间。 TLC是一种简便，灵敏的方法，可以提供一定的菌株代谢产物的信息。不同菌株可产生相同的次级代谢产物。因此TLC 排重可行。经过TLC排除重复的菌株，能够减少活性测试及后续化学实验部分的重复工作，所以此步为必须步骤。经排重留下54株（见图2）。 图2 部分菌株TLC点板照片 （展开剂： CHCl3-MeOH9:1，AcOEt-MeOH

16、-H2O6:2:1；显色剂5%磷钼酸和5%香草醛-浓硫酸。）经活性筛选，测得活性菌株数为15株，其中真菌8株，放线菌7株（见图3、表2、表3）。通过活性筛选结果可知，放线菌虽然分到的数量不多，但活性率较高。从锰矿，锰矿土壤和紫陶土中都分离得到了活性菌株。通过本论文的研究，表明酸性环境存在着大量的微生物，其中部分微生物显示了较好的抗肿瘤生物活性。这说明酸性环境微生物也是活性物质研究的重要的资源菌株，其研究前景及开发潜力十分广阔。 图3 活性菌株的细胞活性图表2 菌株活性筛选结果真菌放线菌总计菌株数401454活性菌株数8715筛得率20.00%50.00%27.78%表3 活性菌株统计菌株编号种

17、类样品来源照片JS-85真菌冶金锰1#JS-82真菌白土（砂）JS-48放线菌建水锰矿土壤 1号样JS-57放线菌建水锰矿土壤 3号样JS-61真菌黄土JS-77放线菌白土（砂）JS-60真菌黄土JS-36放线菌五色混和泥JS-22真菌放电锰（MnO2）2#JS-45真菌黑土JS-62放线菌黄土JS-39真菌五色混和泥JS-89放线菌冶金锰2#JS-27真菌放电锰（MnO2）3#JS-87放线菌冶金锰2#3、结 语本论文以云南建水锰矿（包括矿区土壤）与紫陶土壤为样品，以平板分离法对17个样品进行微生物分离，纯化，总共分到90株耐酸菌，其中真菌75株，放线菌15株。将分到的菌株发酵,提取浸膏。再

18、经固相萃取及TLC排重，留下54株。对选择的菌株以小鼠白血病P388细胞及SRB法进行细胞活性测试。得到15株细胞毒活性菌株。其中真菌8株，放线菌7株。4、综 述4.1.极端微生物4.1.1研究概况 现在，在许多以前被认为是生命禁区的极端恶劣环境(地球上最寒冷、最炎热以及最不适宜生活的地方)，也发现有数以十亿计的生命体，这一些生命体被称为极端微生物(Extremophiles)。极端微生物(Extremophiles)，是依赖于一种或多种极端物化因子的极端生命形式，与普通微生物相比，它们不仅生活环境奇特，而且具有独特的分子组成、物理化学性能、酶特性及代谢功能，其存在的原理与意义为人们更好地认知

19、生命现象及本质，发展生物技术，揭示生命起源和进化规律提供了宝贵的知识源泉，对阐明生物多样性的形成和演变机制，认识生命与环境的相互作用，不断深化和更新对自然界的认识有重大意义。目前极端微生物主要研究内容16包括：(1)新物种的发现；(2)新产物的研究与生产；(3)极端酶的结构与功能及其基因的克隆表达；(4)适应机理的分子基础及遗传原理 ；(5)基因组分析。所谓极端环境，是指高温、低温、高pH、低pH、高盐度、高压等普通微生物所不能生存的环境。已发现的极端微生物有嗜热菌、嗜冷菌、嗜碱菌、嗜酸菌、嗜盐菌、嗜压菌等。在天然的极端环境下生存的独特的微生物,有很高的利用价值。 尽管,到目前为止, 国内外这

20、方面的研究已相当多, 但仍有很多类群和机理未弄清楚，应用领域也有待于探索。相信随着科学手段的不断提高, 开发和应用极端环境的微生物将会出现诱人的前景。4.1.2分类及特点极端嗜热菌(Thermophiles) 嗜热菌一般指在55以上的高温环境中生长、繁殖的细菌。菌种不同,其生长温度的上限也不同,有的可达90以上。在海底火山喷口及其周围区域,温泉工厂高温废水排放区常可发现不同菌种的嗜热菌。 如德国的斯梯特(K, Stetter)研究组,在意大利的海底火山喷口发现一族古细菌, 能生活在110以上高温中,最适温度为98, 降至84即停止生长, 斯坦福大学科学家发现的一种嗜热菌, 最适生长温度为100

21、, 80以下即失活。极端嗜冷菌(Psychophiles) 在地球极地冰海环境中存在许多独特的微生物分类群。如异养产气泡的细菌(Octadecabacter) 只在冰海和靠近冰海的环境存在。而Polaromonas Vacuolata 最适生长温度为4, 高于10则不能生长。极端嗜酸菌(Acidophiles) 这种微生物能生活在pH 1以下的环境。它们往往生长在火山区域含硫量极为丰富的地区。如氧化硫杆菌,可以在pH 0.94范围内生长, 最适pH = 2.5 左右;德国斯梯特就发现一族生活在96以上高温,pH 值低于1 的环境中生物,它们被命名为Acidianus Infernus。嗜酸菌体

22、内环境保持pH 值7 左右。嗜酸菌往往也是嗜高温菌。极端嗜盐菌(Extremehalophiles) 人们发现在高浓度盐环境中,存在许多抗高渗压的微生物。我国从新疆和内蒙古的盐碱湖中分离出了一些极端耐盐菌。它们竟能在含015%NaCl的环境中生长。有些菌株可以在含5%25%NaCl范围中生长。极端嗜盐微生物中唯一的真细菌是光合微生物的外硫红螺菌属; 唯一的真核嗜盐微生物是杜氏藻类。微生物学家琼纳斯克(H, Jannasch)在含盐量高达36% 盐液中发现一种微生物,命名为Halophiles;微生物学家斯多肯尼亚斯(W , Stoeckenius)在嗜盐中发现了一种呈四方形的古细菌。繁殖时,先

23、向一方延长,然后分裂成两个四方形菌;再一起向另一方延长,进而分裂成四个。极端嗜碱菌(Alkaliphiles) 嗜碱菌往往是嗜盐菌,多生活在盐碱湖和盐池中, 生活环境pH 值可达11.5 以上,最适pH 值810,但在中性环境如pH 值6.5 以下,不能生长或生长非常缓慢。北京微生物研究所的徐毅分离到Natronorubrum gennov 的两个种。我国科学工作者从内蒙古碱湖中分离出一株嗜碱菌No.101,其生长pH 值为813,最适pH 值为1011。好气,杆状,能运动。极端嗜压菌(Barophiles) 一般生活在最深的海底。美国海洋学家亚扬诺斯(A , Yayanos)发现一些耐压种,

24、适于在0.70.8MPa 的环境生长,低于0.40.5MPa 则不能生长。有的竟能在1.31.4MPa环境生长。日本科学家也在300600 米深的深海鱼类肠道内发现了极端嗜压菌。4.1.3极端微生物的应用极端嗜热菌利用菌体产生的酶,进行废物处理降解纤维素。用菌体发酵生产乙醇。利用其产物在高温下生产生物表面活性剂。极端嗜酸菌用于冶金提取矿物;用于煤和石油脱硫处理含硫废气;生产肥料, 改良土壤。如可利用氧化硫硫杆菌分解磷矿粉,提高磷矿粉的速效性,以便提高农作物的产量。极端嗜盐菌用于生产食用蛋白、食品添加剂,酶的保护剂和稳定剂;除去工业废水中的磷酸盐, 开发盐碱盐, 开发能源。在基因工程中,大肠杆菌

25、产生嗜盐性芽孢杆菌的胞外木聚糖酶已获成功。极端嗜碱菌用作洗涤剂的添加剂,粘度调节剂。用于基因工程。已有人将嗜碱菌的纤维素酶,木聚糖木酶、淀粉酶、环状糊精葡萄糖转移酶等在中性菌中加以克隆和表达。极端嗜压菌其应用方面报道较少,只在高压生物反应器和基因工程研究中有所应用1。4.2.酸性环境微生物4.2.1概述 自然界大多数环境的pH值为59，它适合多数微生物生长。酸性环境微生物是一种能在低pH条件下生长和繁殖的极端环境微生物，包括嗜酸菌和耐酸菌。嗜酸菌通常在pH25生长很好，pH5.5以上生长不好1,7,9,13。有些嗜酸菌在中性pH条件下根本不生长，如氧化硫硫杆菌(Thiobacillus thi

26、ooaidans)，酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)，酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)等，最佳生长pH是2.03.0，这些都是专性嗜酸菌。一些真菌也能在pH5.0或更低条件下生长，实际上是耐酸菌9。一般来说，将最适生长pH3的微生物称为嗜酸微生物，且种类丰富，在三域生命中均有嗜酸类群，在某些酸性环境中真核生物比原核生物具有更高的多样性7。极端嗜酸菌(Acidophiles)能生活在pH 值1 以下的环境，有些甚至可以生活在pH低于0的环境中。而耐酸菌在中性环境也可以生长。酸性环境微生物广泛的分布在酸性矿山废水、生物沥滤堆以及含硫温

27、泉和土壤，火山区域含硫量极为丰富的地区10。4.2.2酸性环境微生物的分类和主要特征根据不同分类的标准可将酸性环境微生物分为不同的类群。以最适生长温度为标准，可分为中温菌、中度嗜热菌和极度嗜热菌；若以碳源为标准，则可分为化能自养菌和化能异养菌。4.2.3酸性环境微生物在自然界的行为及酸性环境的产生 此类微生物存在于酸性环境中，而自然界的酸性环境又主要是由酸性环境微生物氧化元素硫或者金属硫化物产生的。元素硫主要存在于地热区域，由高浓度的二氧化硫和硫化氢反应形成：SO2+2H2S= 2H2O+3S。自养嗜酸菌和异养嗜酸菌均可以氧化硫形成硫酸。这时如果没有碳酸盐和其他岩石矿物中和，就会形成大范围的酸

28、性环境。但自然界的决大多数的酸性环境还是酸性环境微生物氧化硫化矿物形成的。有些硫化矿是酸溶性的，比如说闪锌矿：有些矿物是酸不溶性的，比如黄铁矿和砷黄铁矿。所以，酸性环境微生物利用两种不同生物氧化机制分解它们。酸溶性的矿物很容易被酸性环境微生物分解，它们可以被酸溶解，形成金属离子和硫化氢。硫化氢接着被嗜酸菌氧化形成硫酸。酸溶性的矿石还可以被Fe3+氧化，形成Fe2+和多硫化物；后者继续被Fe3+成元素硫，接着被氧化成硫酸，所形成的硫酸又可溶解硫化矿物。4.2.4酸性环境微生物的适应机制有关酸性环境微生物细胞内维持中性、适应外酸性环境机制的解释主要有三种。其一，“泵说” ，就是米切尔(Mitche

29、ll)化学渗透说，认为膜内质子通过呼吸链“泵”到膜外，膜运载蛋白与H+结合，利用质子动力将结合的基质运送到细胞内，从而使膜内保持一定H+浓度；其二，屏蔽说 (barrier)，认为细胞质膜是两种环境的渗透屏蔽物。使外部H+或OH-都不能进人细胞内；其三，道南(Donnan)平衡说，认为细胞质膜存在高分子电解质，产生的大离子不能透过膜。所构成的道南电位使小离子向膜两侧扩散达到平衡致使膜外过量的H+不能进人膜内，致使膜内维持中性状态9。酸性环境微生物生长在酸性环境中，细胞膜是它惟一可以抵御外界H+的物理屏障。所以，细胞膜对H+的低渗透性可能是它保持细胞内部pH 的主要途径。近几年的研究表明，细胞膜

30、上的脂类物质在这方面发挥着重要的作用。Vossenberg等研究Picrophilus oshimae时发现，提取自这种酸性环境微生物细胞膜上的脂质体在pH 7.0时不能形成有规则的囊泡结构，而在pH 3.0和4.0时则可以则的囊泡结构，而在pH 3.0和4.0时则可以形成这种有规则的结构，而且这种结构对H+的渗透性极低。但是，这种结构的脂质体在pH 7.0时又会变得有漏洞。因此，酸性环境微生物不但很好地适应了酸性环境，而且还需要酸性环境来保证其细胞膜的稳定性和细胞的完整性16。4.2.5酸性环境微生物的耐重金属机制酸性环境微生物之所以能耐受如此高的重金属浓度，是因为体内存在一系列的抗重金属机制16。主要有5种机制在发挥着作用： 将有毒金属排出细胞，例如通过ArsB蛋白将As3+排出细