樟树籽油亚急性毒理学实验及其降血脂作用研究老师改.docx

1、樟树籽油亚急性毒理学实验及其降血脂作用研究老师改樟树籽油亚急性毒理学实验及其降血脂作用研究摘 要：以成熟樟树籽为实验材料，研究了樟树籽含油体率与含油量相关性,进行了SD大鼠亚急性毒理实验以考查樟树籽油的食用安全性,并研究了樟树籽油降血脂功能。结果表明，樟树籽子叶贮藏细胞内的油体分布较为均匀，子叶中细胞的含油体率最低为37.41%，最高可达42.69%，平均含油体率为40.72%；在亚急性毒理性实验中，实验组大鼠各项血液学指标(红细胞计数、白细胞计数、血红蛋白含量?等)与对照无显著差异(P0.05)；在降血脂功能研究中，樟树籽油能够降低大鼠体内TC的含量，增加血清中TAG的含量，延缓肝脏向脂肪肝

2、转化。关键词：樟树籽油；组织切片；亚急性毒理学；降血脂功能Study on the subacute toxicology research and the role in lowering blood pressure of the oil of camphor seed Abstract: In this experiment, with camphor seed oil as the raw material, we studied the relationship between the oil body percentage and oil content of camphor se

3、eds. Food safety analysis of camphor oil was estimated by the subacute toxicological test for SD rats. Analysis on effect of lowering bloody fat for camphor seed oil was also carried out. The results showed that oil bodies were distributed uniformly in storage cells of camphor seed cotyledon, with l

4、owest eleoplast rate 37.41% and highest rate42.69% and average rate 40.72% in cotyledon cells. In the subacute toxicological test, no significant difference was observed between the tested group and the control group in hematology indexes, (red blood cell count, white blood cell count, hemoglobin co

5、ntent et al.) (P 0.05). The study on blood lipid-lowering effect suggested thatcamphor oil could reduce total cholesterol (TC) content of rats, increase serum triacylglycerol (TAG_ level and slow the transformation of fatty liver.Key words：camphor seed oil；tissue slice；subacute toxicological test；Bl

6、ood Lipid-lowering function樟树（Cinnamomum camphora）为樟科樟属中经济价值最大的树种之一，主要分布在我国长江以南地区1。现亚洲东部地区、太平洋部分岛屿和大洋洲地区也均有分布，其多生长在沟谷中或者山坡上2。樟树不仅树型美观，还能吸收有害气体并吸附灰尘，抗逆性和抗病虫害能力强3，且极适合作为木材使用4。现对其研究多集中在其生态学、药用价值以及工业价值等方面。樟树籽富含油脂，含油量可达40%。目前，对樟树籽的研究主要集中在其脂肪酸组成分析，经GC-MS进行定性和定量分析，脂肪酸组成以C10、C12 这两种中链脂肪酸为主，两者总含量可达90%以上，同时C1

7、0和C12这两种脂肪酸构成的甘油三酯含量占总甘油三酯含量的60%以上。中链甘油三酯（MCT）仅由饱和脂肪酸构成，凝固点低，室温下为液体，粘度小。与大豆油比较，完全是无臭、无色的透明液体。与普通的油脂和氢化油脂相比，中链甘油三酯不饱和脂肪酸的含量极低，氧化稳定性非常好，其碘值不超过 . 。MCT 在高温和低温下特别稳定。在食品添加剂工业中，中链甘油三酯可以作为食用香精和色素的溶剂和载体；在焙烤食品加工中，中链甘油三酯常和便宜的植物油搭配在一起，用作防粘剂，防止烘焙食品粘在锅上或模子上；纯的中链甘油三酯或同植物油的混合油也常用作香肠压模的润滑剂和脱模剂；中链甘油三酯还能用于处理各种脂溶性维生素、颜

8、料和抗氧化剂，当加入少量的中链甘油三酯，高粘度脂肪物质的粘性就会大大减少；在食品加工工业中还用中链甘油三酯来代替易氧化的乳脂，用来制作牛乳甜酒和奶酪仿制品；如果和水溶性胶体结合使用，中链甘油三酯还能作饮料的浑浊剂。另外，中链甘油三酯还能代替矿物油用作食品加工机械的润滑油。病人食品中链甘油三酯（MCT)通常可作为手术后、感染和皮肤烧伤病人的专用食品，还可用于那些患有脂肪吸收不良，艾滋病人和癌症病人、糖尿病人的食品，可用于治疗前列腺增生、消散胆石、降低胆固醇、防治高血脂症等。此外还可以帮助减肥，实践证明，食用中链脂肪酸酯MCT对人体的体重、腹部脂肪面积的减少、腰围的减少，均有明显的效果。饲料添加剂

9、中链甘油三酯（MCT)由于其高能、易吸收，在家禽、家畜饲养中有广泛应用。饲料中添加了中链甘油三酯，猪仔体重增加，母猪奶水稳定，母鸡产蛋提高。此外中链甘油三酯还有提高家禽家畜抗病能力等功效。提取樟树种子中油脂，分离准备的癸酸(C10)还可用于合成鱼腥草素之类的消炎药4，利用樟树油脂中富含的癸酸和月桂酸(C12)制备的中碳链甘油三酯可用于防治高脂血症，降低胆固醇，还可治疗脂肪代谢紊乱等病症5，同时还可用作乳化制剂和溶剂等医药品。 本实验采用冰冻切片、荧光染料尼罗红染色和激光扫描共聚焦显微镜观察相结合技术，建立了快速观察樟树籽油体的方法，研究结果可为樟树高油品系的选育提供理论依据。通过亚急性毒理性实

10、验研究，确认了樟树籽油的食用安全性，为其开发利用提供安全保障。通过研究樟树籽油对大鼠血脂相关各项生化指标、肝脏脂肪含量、肝脏细胞结构及主动脉结构的影响，探讨了樟树籽油的降血脂功能、预防和治疗脂肪肝及AS的作用，为利用樟树籽油生产健康的具有降血脂功能性油脂的开发提供理论依据。1材料与方法1.1实验材料 成熟樟树籽：10-11月份，采自南昌大学前湖校区，去果皮后于60烘箱中干燥，置于阴凉干燥处贮存备用。大豆油（精炼一级）：益海嘉里食品有限公司，生产日期为.；樟树籽油：自制，经热压榨法获得。基础饲料：购于南昌大学实验动物科学部。1.2实验动物雄性SD大鼠（动物合格证号96-021），体重(23020

11、)g，南昌大学实验动物科学部提供。1.3实验仪器冰冻切片机：Leica CA 1950；激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）：ZEISS LSM 710 ；SHB- A 循环水式多用真空泵：河南太康教材仪器厂；RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；TDL-5-A型低速台式离心机，厦门精艺兴业科技有限公司；血细胞分析仪（百特，41-2400型）； 台式高速冰冻离心机：德国Eppendorf公司； 756紫外分光光度计：上海精密；101-2型恒温干燥箱：上海市实验仪器厂；DK-S14型电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；LXJ-型离心机：上海医用分析仪器厂；CA 1950恒冷箱冰冻切片机

12、：德国Leica；Dm5000B正置自动显微镜：德国Leica；10ml 注射器，5ml 促凝管，2ml 抗凝管，解剖工具等。1.4实验方法1.4.1 樟树籽子叶贮藏细胞内油体的形态观察切片：在冰冻切片机冷箱温度-15，冷台温度-20下进行；染色：切片放入尼罗红染液中分别避光孵育15、20、25分钟，期间用移液器吸头吹打几次，促使染料与细胞内油脂充分结合6。切片厚度分别设定为 10、15、20m；制片：用0.1 M的PBS缓冲液漂洗3-4 次，然后用 Immersion oil封片；观察：在LSCM下使用 20倍和 40倍物镜扫描观察并拍照，激发波长为 483 nm，吸收波长为566-670

13、nm。1.4.2樟树籽油的制备将xx g 干燥种子炒热，以20kg/30min的速率压榨法得到的毛油，4000 r/min离心1h，收集油层，4%白土吸附20 min脱色，过滤，0.1 MPa的真空条件下，将油吸入脱臭锅，加热至160 ，从锅底部通入少量水蒸汽，持续升温至180 ，恒温脱臭4 h，停止加热，冷却降温至70 ，破真空，放出油脂，过滤，得精炼的樟树籽油7。1.4.3樟树籽油的亚急性毒理学实验雄性SD大鼠，随机分为3组，每组10只。实验组喂食樟树籽油，对照组喂食大豆油，最后一组仅喂食基础饲料。实验组与对照组中基础饲料中油脂含量为20%，实验期间动物自由饮水与摄食，连续35d观察大鼠的

14、毛发、行动、摄食及死亡等一般状况。35d后3-4ml 10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，测定测定红细胞计数(RBC)、白细胞计数(WBC)、血红蛋白(HGB)、血红蛋白含量(MCH)、血红蛋白浓度(MCHC)、淋巴细胞比率(P-LY)、红细胞平均体积(MCV)、中间细胞比率(P-Intermediate cells)、粒细胞比率(P-GY)、淋巴细胞(LY)、中间细胞(Intermediate cells)、粒细胞(GY)、红细胞压积(HCT)、红细胞分布宽度3D(RDW 3D)、红细胞分布宽度CV (RDW CV)、血小板总数(PLT)、血小板平均体积(MPV)、血小板大细胞比率(P-LCR

15、)、血小板压积(PCT)和血小板分布宽度(PDW)等血常规指标。1.4.4樟树籽油的降血脂功能研究1.4.4.1 喂养实验 雄性SD大鼠实验环境下适应性喂养5天，随机分为3组，。对照组喂食基础饲料，实验组喂食高脂饲料，加入的油脂为95%樟树籽油和5%大豆油，高脂对照组喂食高脂饲料，加入的油脂为大豆油，连续5周，实验期间动物自由饮水和摄食。喂养结束，空腹12h后，取3-4ml 10%水合氯醛对大鼠进行全身麻醉，经腹主动脉取血。血样于4，6000rpm离心20min分离血清后测定各项指标，同时，对应取大鼠肝脏及其主动脉，用0.9%生理盐水清洗后放入 -70冰箱中待用。1.4.4.2测定项目1.4.

16、4.2.1体重分组时称重一次，以后每周称重一次。1.4.4.2.2 TC：酶法测定测定原理：胆固醇酯酶可水解血清中的胆固醇酯，再用胆固醇氧化酶氧化胆固醇而产生H2O2，后者在过氧化物酶作用下，可使4-氨基安替比林和2,4-二氯酚缩合形成粉红色的醌亚胺。用分光光度法在500 nm处测定其OD值，根据OD值的变化，推算出胆固醇含量。1.4.4.2.3 TG：酶法测定测定原理：利用醌亚胺显色，比色推算甘油三酯含量。1.4.4.2.4 HDL-C：磷钨酸镁沉淀法结合酶法测定测定原理：用磷钨酸镁沉淀血清中低密度和极低密度脂蛋白，然后用酶法醌亚胺显色测定其上清液中的HDL-C。1.4.4.2.5 LDL-

17、C 根据Friedewald公式计算8。LDL-C (mmol/L)TC( TAG0.456+ HDL-C)1.4.4.2.6动脉硬化指数(Atherogenic index, AI) 以公式AI(TC-HDL-C)/ HDL-C计算。1.4.4.2.7 肝脏粗脂肪含量测定肝脏粗脂肪含量测定：肝脏烘干至恒重，充分研磨细碎，用滤纸包好，棉线扎牢精确称重，置于索氏抽提器中用60石油醚抽提2 hr，抽提后再将滤包烘干精确称重。式中：RF（Raw Fat）肝脏中粗脂肪的含量(%)；W1抽提前滤纸包重量（g）；W0抽提后滤纸包重量（g）；S肝脏样品干重（g）1.4.4.2.8 肝脏病理组织学检查9冰冻新

18、鲜肝脏 -4 解冻，在肝脏最大叶距边缘5 mm处切取1cm0.5 cm0.5 cm肝脏组织置于恒冷箱冰冻切片中，包埋剂包埋30 min后进行组织切片。将切片置于冷甲醛中固定1 h，同时对照组进入氯仿-甲醇（2:1）1 h室温；室温，在通风橱内，2.5 %溴液30 min；蒸馏水充分洗；70 %酒精洗；溴-苏丹黑染液15 min；70 %酒精分化，直到对照组无色；2 %卡红矾复染10 min；蒸馏水洗，甘油明胶封片，正置自动显微镜下观察。1.4.4.2.9 主动脉病理组织学检查 主动脉 -4 解冻，切取0.5 cm长的主动脉至于恒冷箱冰冻切片中，包埋剂包埋30 min后进行组织切片。以下步骤同肝

19、脏病理组织学检查。3结果与分析3.1 樟树籽子叶贮藏细胞内油体的形态观察 从图1可以观察到，樟树籽子叶贮藏细胞形状多为多边形，少数为椭圆形。细胞内的油体分散较为均匀，部分油体为椭圆形或不规则形状，少部分为球形，且子叶贮藏细胞内油体间排列紧密，几乎不存在空隙。经过多次随机选择和计算，子叶中细胞的含油体率最低为37.41 %，最高可达42.69 %，种子含油量与含油体率成正相关，平均含油体率为40.72 %。 图 1 樟树成熟种子子叶贮藏细胞内油体的LSCM观察（Bar=10m）Fig 1 Observation of oil bodies in the cotyledon storage cel

20、ls of mature seeds from Cinnamomum camphora. with LSCM（Bar=10m）3.2樟树籽油的亚急性毒理学实验 Table 1 Hematology results of rats in subacute toxicity test (S)表1 大鼠亚急性毒理性实验血液学检查结果 (S)血常规指标实验组对照组参考值白细胞（109/L）11.34.5614.6911.3810.1-15.2红细胞计数（109/L）7.830.426.882.566.56-9.83中性粒细胞计数（109/L）1.601.392.662.370.79-1.44淋巴细胞计

21、数（109/L）8.652.9310.277.556.66-12.87单核细胞计数（109/L）0.930.511.491.310.84-1.36嗜酸性粒细胞计数（109/L）0.050.050.110.110.03-0.85嗜碱性粒细胞计数（109/L）0.060.060.130.170.03-0.1中性粒细胞百分率（%）12.816.1916.754.316.3-24.8淋巴细胞百分率（%）78.287.4271.54.9165.1-82.9单核细胞百分率（%）8.001.779.902.016.5-11.8嗜酸性粒细胞百分率（%）0.410.290.900.660.6-1.3嗜碱性粒细胞

22、百分率（%）0.500.230.950.770.3-1.0血红蛋白（g/L）136.286.77119.2443.98130.6-172.3红细胞体积分布宽度（%）11.540.4411.610.6810.2-10.7红细胞压积（%）44.842.2538.7714.4740.6-50.2红细胞平均体积（fl）57.32.0456.311.7655.8-61.9红细胞平均血红蛋白含量（pg）17.410.4915.116.1317.5-19.9平均血红蛋白浓度（g/L）304.113.26243.50121.02306-322血小板计数（109/L）724.62269.71606.50373.

23、26636-948血小板平均体积（fl）6.990.357.210.356.7-7.3血小板压积（%）0.500.180.430.270.47-0.61整个试验过程中，SD大鼠无一例死亡，其毛发光泽，摄食正常，无任何异常行为表现。表2中，大鼠各项血液学分析检验均在正常范围（白细胞、红细胞计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、单核细胞计数、嗜酸性粒细胞计数、嗜碱性粒细胞计数、中性粒细胞百分率、淋巴细胞百分率、单核细胞百分率、嗜酸性粒细胞百分率、嗜碱性粒细胞计数、血红蛋白、红细胞体积分布宽度、红细胞压积、红细胞平均体积、单个红细胞平均血红蛋白含量、平均血红蛋白浓度、血小板计数、血小板平均体积、血小板

24、压积）10，实验组、对照组和高脂对照组三组之间均无显著性差异（P0.05）。血液学中，红细胞为血液中数量最多的一种血细胞，它含有的血红蛋白能够使其可以在血液中输送氧等物质，红细胞平均体积和红细胞体积分布宽度可结合分析大鼠的贫血状况。实验结果显示，经樟树籽油饲喂的大鼠造血功能良好，无贫血情况。3.3 大鼠体重变化 SD大鼠适应性喂养5天后，每周称重，连续5周，大鼠体重增长见表3.2。实验组和高脂对照组中，喂养基础饲料中2%胆固醇和0.5%胆酸进行建模，饲料中原有脂肪酸含量改变，脂含量比重增加导致凝结度降低，同时口感、气味、形状等均与基础饲料有差异，在实验过程中，前期体重增加均低于对照组，可能原因

25、是大鼠前期需要对新的食物进行适应性进食一段时间，从而导致体重增加较慢。表2樟树籽油对大鼠体重的影响(S, g)Table 2 Effect of camphor seed oil on the body weight of rats (S, g) 组别 Group第0周第1周第2周第3周第4周第5周对照组234.2713.89311.8210.62363.6015.12421.8217.12456.4519.36492.0027.05实验组234.209.63278.9518.55308.3027.95349.8539.08374.8539.07432.4438.09高脂对照组236.909.

26、19294.1512.16323.2013.57387.3023.49411.2035.13454.7835.62第1周三组体重增加情况为：对照组体重高脂对照组实验组，第2周对照组体重增加量最大，实验组和高脂对照组相差不大，而从第3周至第5周3组体重变化情况为：高脂对照组对照组实验组，大鼠长期食用樟树籽油会使其体重降低。随着时间的推移，实验组大鼠的体重增加量逐渐减少，实验证明，长期食用樟树籽油有利于保持体重或使体重降低，而短期实验不能有效证明其减肥效果。同时观察到：前期三组大鼠表现均活跃，皮毛光滑、洁白，取食积极，到实验后期，实验组和高脂对照组与对照组有些许差异，实验组大鼠皮毛明显发黄，但不凌

27、乱，精神有些许萎靡，高脂对照组大鼠毛皮凌乱，精神萎靡。 对照组 实验组 高脂对照组Control group Experimental group High High lipidic group图2三组大鼠外观（解剖前）Fig2 The appearance of rats of three groups（before being dissected） 3.4樟树籽油降血脂作用研究 表3中显示，大鼠喂养5周后，与对照组比，实验组大鼠胆固醇（TC）水平差异显著上升（P0.05），高脂对照组大鼠TC水平差异极显著（P0.01），实验组TC水平低于高脂对照组，但差异不显著。高脂对照组中TAG水平与对

28、照组相比具有显著性差异（P0.05），和实验组相比也具有显著性差异（P0.05），但是实验组与对照组相比差异不显著。结果表明樟树籽油能够有效改善大鼠血清中TAG水平。三组高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）之间差异不显著，但检测低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）时，结果显示，实验组与对照组相比差显著（P0.05），而高脂对照组与之相比极显著（P0.01）。表3 SD大鼠血清生化指标检查结果及AI值 (S，mmol/L)Table 3.3 Biochemical indicator in blood serum of SD rats and AI (S, mmol/L)分组TCTAGHDL-CLDL-

29、CAI实验组1.850.27a0.940.49c0.650.140.820.16 a1.850.93高脂对照组1.960.36b0.380.16 a0.610.120.910.18 b2.210.35对照组1.310.261.190.660.470.110.560.111.790.36a：P0.05，b：P0.01与对照组比较，c：P0.05与高脂对照组比较。TC、TAG含量是高脂血症的重要指标，血清中TC，TG，LDL-C均是AS形成的促进因子，LDL-C升高是心肌梗塞的危险因子，而HDL-C能转运胆固醇，其中载脂蛋白又能激活卵磷脂胆固醇转脂酰基酶，催化卵磷脂分子中-脂肪酰基与胆固醇作用生成

30、胆固醇酯，使TC与TG含量降低，所以HDL-C是高脂血症的辅助标志11，由于其可将外周血中多余的胆固醇带回肝脏代谢生成胆汁酸，因此HDL-C升高也是抗心肌梗塞的安全因子。这些结果表明,樟树籽油对脂质代谢失调有明显改善作用。3.5 大鼠肝脏肉眼观察和粗脂肪含量的测定 解剖后肉眼观察发现（图3），各组大鼠肝脏体积有些许差异，对照组为鲜红色，实验组大鼠肝脏为黄色，较对照组油腻，高脂对照组形成脂肪肝，但高脂对照组的肝脏在表面出现黄色斑点，切面较油腻，烘干至恒重后仍较软。实验组和高脂对照组的肝脏研磨后呈现明显的油浸状，色较深，尤其是高脂对照组更为明显，对照肝较硬，研磨后的粉未呈干粉状，色较浅。采用索氏抽提法测定各组粗脂肪含量，结果见表4。表4 肝脏粗脂肪含量(s，%) Tab3.4 The content of raw fat in the liver (s，% )组 别粗脂肪/肝湿重抑制率（%）高脂对照组26.254.21-实验组18.494.5829.56对照组8.152.4768.95 从图表可知，本实验所用高脂饲料可致大鼠形成脂肪肝，对照组和实验组肝脏粗脂肪含量极显