弹性纤维染色方法.docx

1、弹性纤维染色方法改良Masson 三色染色法在胶原纤维中的应用中华首席医学网 2006 年05月24日11:05:41 Wednesday648作者：王珏，朱礼国， 唐幕湘，张健郧阳医学院学报2006年2月25卷1期实验技术I里加入收藏夹【关键词】 胶原纤维关键词改良；Masson三色染色法；胶原纤维目前，Masson三色染色法仍是胶原纤维染色的主要方法之一。它在临床外检和科研教学等方面有着重要的意义。在实际工作中，我们认为传统的 Masson三色染色法1操作程序多，染色效果欠佳，且不太稳定，对其做了改进，现将做法介绍如下。1方法1.1染液的配制Harris苏木素、1%盐酸酒精、丽春红酸性品红

2、、 1%磷钼酸、2%苯胺蓝.1.2染色方法石蜡切片34 gm 脱蜡至水Harris苏木素染3 min流水冲洗,1%的盐酸酒精分化35 s流水冲洗,温水返蓝1 min流水冲洗，丽春红酸性品红加温染 3 min，蒸馏水冲洗,1%磷钼酸分化1 min，不洗，擦净载玻片上的磷钼酸残液，2%苯胺蓝复染1 min，95%的酒精冲洗，95%酒精及无水酒精脱水，冷风吹干，中性树胶封片。2 结果胶原纤维呈蓝色，肌纤维胞质呈红色，细胞核呈蓝褐色。3 讨论通过长期实践探索，我们摸索出一种程序更简洁、组织着色效果更好，且性能稳定的改良 Masson 三 色染色法。其原理是利用苏木素，酸性品红和苯胺蓝对结缔组织和神经嗜

3、银颗粒、胶原纤维等组织染色， 使时间缩短，步骤简便。改进后的方法，将传统的 Masson 三色染色法作了如下调整和改动： Bowin 氏液 由 10% 中性固定液 2 代替，省略了 0.5% 碘酒精作用 10 min ，5% 硫代硫酸钠作用 5 min 和 1% 冰醋 酸处理 1min 及地衣红染 3060 min 等过程，然后将原丽春红酸性品红， 1% 磷钼酸， 2% 苯胺蓝的染 色时间分别由 15 min ， 5 min,5 min, 缩短为加热 3min,1 min,1 min. 通过对以上各步的调整和改进， 使染色时间由原来的近 3 h ，缩短为 30 min 左右，且颜色对比度好，层

4、次清楚，胞核胞浆着色均匀。值 得注意的是：在经过 1% 磷钼酸分化后的几步禁止用水冲洗，直接用 95% 酒精洗，然后脱水，透明封片， 这样可防止切片脱色，染出的组织切片效果更好。 参 考 文 献1 凌启波 . 实用病理特殊染色和组织化学 M. 广东高等教育出版社 .1989,7.2 龚志锦 ,詹洲.病理组织制片和染色技术 M. 上海: 上海科学技术出版 ,1994,10.郧阳医学院形态学实验室 ; 郧阳医学院附属太和医院病理科 ,湖北 十堰 442000 )网状纤维 网状纤维是一种纤细的纤维。 它沿着网状细胞和突起分支， 并互相交织成网， 因而被称为网 状纤维，又因这种纤维对银的浸染着色特别显

5、著。故又称为嗜银纤维。它主要由 III 型胶原 蛋白构成，也具有 642nm 周期性横纹 1 。它主要分布于骨髓、脾、淋巴结、肝和肺等脏器。 癌组织中间未见有网状纤维， 但在其边缘可见有大量的网状纤维， 但在其边缘可见有大量的 网状纤维围绕，俗称癌巢。一、网状纤维的形成 它的形成主要是在纤维母细胞的粗面内浆网中，合成可溶性胶原。在醛糖、类脂的作用下， 形成可溶性胶原， 随后它被分泌到细胞外， 在基质中 (或在细胞的表面) 通过原胶原蛋白分 子间的交联，聚合成为不溶性的胶原原纤维即网状纤维。二、网状纤维在组织化学上的反应 网状纤维的主要成分是网硬蛋白， 在组织化学上， 网状纤维和胶原纤维是容易区

6、别的。 网状 纤维是分支纤细的纤维。 Van Gieson 氏染色不显色或微红色。 PAS 反应呈现红紫色，银浸 染为黑色。胶原纤维用 Van Gieson氏染色为红色，PAS反应呈微粉红色。银浸染为黄 *色或棕黄 *色。三、 网状纤维的显示 1染色染料技术：从网状纤维的显示，区别和效果等方面，这种技术被认为是不可靠的， 其原因是它只能跟胶原纤维区别开来。2金属浸染技术：这种技术对于显示网状纤维被认为是十分可靠和广泛使用的方法，它不 但能够区别网状纤维和胶原纤维，而且可显示纤细的网状纤维。嗜银反应 (Argyrophil reaction )嗜银细胞与亲银细胞所不同的是需要一种附加的还原剂来还

7、 原，它们比亲银细胞数量多。必须注意：亲银反应中将找不到任何的嗜银细胞。亲银反应( Argentaffin reation ) 亲银细胞有能力，直接地，不靠外加试剂，将银液中的银还 原为一种不溶性的黑色金属银沉淀的细胞称为亲银细胞。 (Cells that have the ability to directlyreduce silver solution producing an insoluble black metallic silver precipitate are termed-angentaffin cells )。四、 网状纤维的显示方法有 Gomoris 法、Godon an

8、d sweets法、Wilders 法、Foots 法(一) Gomoris 法1、试剂的配制：取 10%硝酸银 3 份，加入 10%的氢氧化钾 1 份，混合后产生大量的黑色沉淀物，倒去表面 的液体，保留下沉淀物，加入 10-20 倍或更多的蒸馏水进行冲洗，连续冲洗 3 次。待沉淀物 清晰则可。 用浓氨水逐滴加到溶液中。 使沉淀物逐步溶解。 待见沉淀物剩少数几颗时， 再取 10%的硝酸银液加入数滴，至溶液再现浑浊为止。再用氨水将其溶解，然后稀释 10-15 倍。即可使用。平时保存于 4 C冰箱中。2、操作步骤：(1)、切片脱蜡至水，蒸馏水洗，(2)、用 0.5%高锰酸钾氧化 5min，(3)、

9、自来水洗，继用蒸馏水洗，(4)、用 2%草酸漂白切片 2min，(5)、自来水洗，蒸馏水洗，(6)、 2%硫酸铁铵媒染 5min，(7)、水洗，蒸馏水洗，(8)、滴入 氨性银 溶液浸染 3-5min，(9)、蒸馏水洗数次，(10)、10% 甲醛液还原 5-10min，(11)、水洗 2min ，(12)、用核固红 染色 10-15min，(13)、水洗10min，各级酒精脱水，(14)、常规透明，中性树胶封固。结果 ：网状纤维黑色，核红色，胶原纤维黄棕色。( 二 ).Gordon 和 sweets 氏法试剂的配制：取 10%硝酸银水溶液 5ml, 逐滴加入浓氨水，至形成沉淀物，再逐滴加氨水，将

10、初次形成的 沉淀物溶解。注意氨水不能加入过多。取 3%过氧化钠 5ml 加入，即可能产生沉淀，再逐滴加入氨水至沉淀再度被溶解。 加入数滴 10%硝酸银， 加入蒸馏水制成 50ml 溶液， 即可使用， 贮藏于4 C冰箱中。1 、切片脱蜡至水。2、 1% 高锰酸钾氧化 5 分钟。3、 水洗。4、 2%草酸漂白 1-2 分钟。5、 水洗。6、 2%硫酸铁铵媒染切片 10 分钟。7、 蒸馏水洗。8、 氨银溶液浸染 2 分钟。9、 蒸馏水冲洗数次。10、 10% 福尔马林还原 2 分钟。11、 自来水洗。12、 5% 偏重亚硫酸钠处理 3 分钟。13、 自来水洗。14、 0.2% 氯化金调色 3 分钟。

11、15、 自来水洗。16、 如果有要求，可做对比染色，如用核固红染核。17、脱水，透明，封固。 结果：网状纤维显示黑色，如有对比染色，细胞核显示红色，胶原纤维不着色。(三) Wilder 氏法。1 、切片脱蜡至水。2、 1% 高锰酸钾氧化 5 分钟。3、 流水洗。4、 2%草酸处理 1-2 分钟。5、 流水洗。6、 1%硝酸铀 10 秒钟。7、 蒸馏水洗。8、 氨银溶液浸染 1 分钟。9、 95% 酒精速洗。10、 于显影液内显色 1 分钟。11、 蒸馏水洗。12、 0.2%氯化金调色 1 分钟。13、蒸馏水洗。14、 5%亚硫酸钠处理 1-2 分钟。15、水洗。16、如有需要，可作对比染色。1

12、7、常规脱水，透明，封固。 结果：网状纤维：黑色，其余着对比染色，胶原纤维不着色。（四 ）.Foot 氏法1、切片脱蜡至水。2、1% 高锰酸钾氧化 5 分钟。3、自来水洗。4、2% 草酸处理 1-2 分钟。5、自来水洗，蒸馏水洗。6、 于碳酸氨银液中，在 56C烤箱内浸染40-60分钟。至切片呈黄棕色。7、 速洗蒸馏水。8、 20% 福尔马林还原 5 分钟。9 、水洗。10、 0.2%氯化金水溶液调色 1-2 分钟。11 自来水洗。12、 、 5% 硫酸钠固定切片 1-2 分钟。13、 如果需要，可作对比染色。14、 脱水，透明，封固。 结果：网状纤维显示黑色，其它着染对比染色，胶原纤维不着色

13、。五、 银染注意事项：1、 所使用的玻璃仪器，须用清洁液处理。2、 配制氨银溶液时，氨水加入的量不能过多或不足，过多感应下降，会使液体过碱，滴染 时，切片容易脱落，过少则感应上升，浸染效果不佳，不好掌握。3、 配制氨银液时，有可能用玻璃蒸馏水。4、 使用的化学试剂应尽量用分析纯以上。5 、切片氧化漂白应彻底，不能使残存的福尔马林留于片上，否则将导致过早还原而使浸染 不均匀。6、 如果有某种原因而导致切片脱落时，应使用涂胶的载片，以增加附贴性，7、 如有可能，氨银溶液以新配为佳，但也可保存于 4C冰箱中达一个月左右，这种液体易 挥发，用后即须盖紧，当沉淀物出现时，该溶液应抛弃，8、 20% 福尔

14、马林还原 5 分钟。9、 应秀氯化金调色时，可将胶原纤维着染的黄棕色去除掉。10、 上述四种方法，根据各单位个人的需要或爱好选择，没有什么区别。六、 临床应用1、 可用于区别癌和肉瘤的诊断，例如：网织细胞肉瘤和转移于淋巴结内的未分化癌，这两者在 HE 的染色切片都较难区别，前者可产生网状纤维，后者不产生网状纤维。鼻咽部活柱，应将网染作为常规，给予使用， 可增加诊断的准确性。2、 可用于区别血管内皮瘤（肉瘤）和血管外皮瘤（肉瘤） ，它的瘤细胞在网状纤维膜内，而 血管外皮瘤则在网状纤维膜外，血管内皮肉瘤的瘤细胞呈泡巢状，周围多被网状纤维包绕；而血管外皮肉瘤的瘤细胞可见较多的网状纤维。3、可用于神经

15、系统方面肿瘤的区别， 如：交感神经母细胞，脑的髓母细胞瘤，这些肿瘤的形态有时象肉瘤，但银染时，神经系统 的网染为阴性，不过脑的原发性肉瘤有较多的网状纤维。4、可用于观察癌组织的发生发展过程。 如：原位癌，可见有完整的基底膜，而浸润性癌则可见到被破坏的基底膜。5、可用于区别淋巴系统方面的肿瘤，如：淋巴肉瘤和网织细胞肉瘤， 前者瘤细胞间的网状纤维比正常稍减少， 后者则比正常时增 多。6、可用于急性骨髓纤维化的鉴别诊断， 该病的网状纤维增多， 纤维可以是致密和融合性的。 胶原纤维染色通常呈阴性，尽管偶尔有的病例可能显示胶原纤维化。弹性纤维弹性纤维主要由弹性蛋白 (一种黄 *色硬蛋白， 它是黄 *色弹

16、性纤维组织的主要成分， 干燥时 易脆，而湿润时呈弯曲并富弹性)构成。它广泛分布于全身的各个部位，尤以循环系统，呼 吸系统和皮肤系统为甚。新鲜时它呈黄 *色，固又称为黄 * 色纤维。弹性纤维较细，直径0.2-1.0um ，有分支，不成束。但可交织成网。它富有弹性，容易拉长，但不能拉到超过它 的极限，外力除去后又恢复原状。弹性纤维与胶原纤维交织在一起，在 HE 染色的标本上， 含量少时不易与胶原纤维区别， 含量多时呈折光性强的淡粉红色。 由弹性蛋白构成弹性纤维 的鞘， 并非完全的密封， 在其周围有许多微细孔， 这些微细孔可作为营养物及排除废物的场 所。弹性纤维主要来源于带有平滑肌特征的间胚叶细胞，

17、 少量可由脉管的内皮细胞产生， 先形成 前 弹性蛋白(pro-elastin),这时在电镜下可见到直径为 200nm的电子密度微纤维，在成熟的弹性纤维蛋白，电密度减少或丧失，较为均匀一致。 弹性纤维与胶原纤维,网状纤维不同,它极难容于有机或无机的溶液里。一、弹性纤维的变形和病理变化弹性纤维过度随着年龄的增长, 特别是到了老年的时候, 弹性纤维可发生生理性的变化, 这时可观察到弹 性纤维的纵行分裂, 断成碎片, 最后成为颗粒, 这些变化同时也伴有化学变化, 氨基酸和钙 的含量有所增加, 这些变化在皮肤是最明显的。 当有病变的时候, 我们便可在切片观察到有 的弹性纤维增生,有的被破坏,断裂、崩解,

18、失去弹性。如主动脉瘤,就可见到瘤壁上的弹 性纤维已经失去了弹性。 这是由于主动脉壁的弹性纤维受到内压的不断冲击, 牵拉，超过它的极期，再也恢复不了原状，因此在切片标本上（特殊染色）只能见到其痕迹 或反应物。二、弹性纤维的染色方法（一 ）.Weigert 氏雷锁辛品红法（ 1898）（ Weigerts resorcin-fuchsin method）试剂的配制：Wergert 氏雷锁辛品红液：碱性品红 2g雷锁辛 4g蒸馏水 200ml30% 三氯化铁 25ml取 500ml 的烧瓶加入蒸馏水和雷锁辛，用玻棒搅拌均匀，加热直至沸腾，持续 1-2min ，再 加入 30%的三氯化铁水溶液继续搅拌

19、直至煮沸 2-3min 后，此时溶液的颜色变为紫罗蓝色，冷却后过滤。倒去滤液，将滤纸和沉淀物一起放入烤箱中一起烤干。取 200ml95% 酒精，将 滤纸与沉淀物一起放入加热溶解，除去滤纸，冷却后过滤，用 95% 酒精凑足 200ml ，再加入4mlHCL。即可使用，保存于 4C冰箱，可长期使用。操作方法：1、切片脱蜡至水，2、 0.5%高锰酸钾水溶液氧化 5min，3、 水洗，4 、2%草酸漂白 1-2min ，5、水洗，6、入 95%酒精，7、入 Weigert 氏雷锁辛液，室温染 1-2h，8、95%酒精分化至背景清晰为止，9、 Van Giesson 氏液或核固红作对比染色，10、脱水透

20、明，封固。结果： 弹性纤维：深蓝或深黑色，其余成分视用何种对比染色而定。特点：1、可将微细弹性纤维显示出来。2、方法可靠，颜色鲜红色，切片可保存。3、配制好的染液可使用较长时间。注意事项 ：1 1908 年 Hart 应用该法，将 1%HCl 酒精稀释了 Weigert 氏原液。即原液 5-20ml 。酸酒精30-40ml 。结果弹性纤维显示蓝色 黑色。2、1929 年 French 改良了这种方法，用 Weigert 氏原液中的 2g 品红，改为 1g 结晶紫。结果 弹性纤维显示深蓝 绿色。3、 1929年Sheridan改良了该法， Weigert氏原液中的2g品红改用为2g结晶紫。结果弹

21、性 纤维显示为绿色。4、 在溶化沉淀物时，应隔水溶化，不要直接于明火上加热熔解。5、 配制后的染液用小磨口瓶装，以防溶液挥发，影响染色效果。6、 该溶液虽可保存较长时间，但仍以新鲜配制为好。7、 切片在透明时，有人提出切片不要经过苯酚二甲苯。其原因之一是对已染色的切片有影 响。（二） Gomoris 醛品红法（ 1950）（ Gomrori s aldehyd-efuchsin method） 试剂的配制：碱性品红 1g70%酒精 98ml三聚乙醛 1ml浓盐酸 1ml将品红溶于酒精里， 再加入 HCl 和三聚乙醛， 混合后于室温放置 2-3 天后即可成熟， 保存于 4C冰箱内，使用期1-2个

22、月。操作方法：1 、切片脱蜡至水，2、 0.5%高锰酸钾水溶液氧化 5min， 3 、水洗，4、2%草酸漂白 1-2min ，5、水洗，6、入 70%酒精稍浸泡 1min ，7、入染液中浸染 10-15min ，8、70%酒精分化，至无余色脱下为止，9、0.5% 橙黄 G 做对比染色， 20-30s，10、脱水，透明，封固。结果： 弹性纤维深蓝色，背景不同程度的黄 * 色。特点：1、可把较细的弹性纤维给予显示出来。2、它不但染弹性纤维，也可染胰腺的 B 细胞，肥大细胞，神经细胞的尼氏小体，表面肝炎抗原( HBsAg )粘蛋白等。3、方法可靠安全，操作得当，可获满意结果。4、颜色鲜艳，利于摄影。

23、注意事项：1、醛品红液在成熟之后方可使用，染色最佳时间一般在 7-10 天，2、分化时应随时观察切片，防止褪色过度，可改用 95% 酒精为分化剂。(三 ).地衣红技术( orcein techique)( Unna.1891)染液配制：地衣红 1g70%酒精 99ml浓 HCL 1ml将地衣红溶于酒精中，也可以用水浴锅加热以助其溶解，冷却过滤后加入 HCL 于室温放置 1-2 天。操作方法：1、切片脱蜡至 70%酒精， 2、入上述染液中浸染 3h (室温)或1-2h (37C)3、70%酒精分化，4、脱水，透明，封固。结果：弹性纤维棕红色或深棕色。（四 ）.Verhoff 氏酒精苏木素技术（

24、1908）（ Verhoffs alcoholic hematoxylin ted ） 染液的配制：A.5% 酒精苏木素 .B.10%三氯化铁水溶液.C.lugols 碘 .溶2g碘片于少数的蒸馏水中，再溶 1g的碘化钾，两者总量为 100ml。操作方法：1 、切片脱蜡至水，2、 用上述染液（ A.2 分， B.4 分， C.4 分）染色 10-15min，3、 水洗， 2%的三氯化铁分化至弹性纤维清晰为止，4、 水洗， 95%酒精除去沉淀于切片的碘，5、 水洗，用 Van Giesson 或中性红作对比染色，6、 脱水，透明，封固。结果： 弹性纤维黑色，背景据不同的对比染色而定。特点：1 、

25、操作简单，易掌握。2、 染色的时间短，适宜于临床活检。注意事项：1、苏木素为储存液，但每次以新配为佳，2、混合后的染液须当次用完，不能保存，3、 分化时应于镜下控制，以免过染或淡染。如动脉粥样硬化时三、弹性纤维染色的临床应用1.用于区别正常的动脉和静脉以及观察动脉有病变时血管壁各层的情况， 的各类变化。2.用于区别观察各种疾病对弹性纤维的影响及变化， 如原发性或继发性高血压可见主动脉弹力纤维增生， 老年弹力纤维增多症。 心内膜弹力纤维增生症常都可见到弹力纤维断裂， 梅毒 性主动脉炎和皮肤的环状肉芽肿，动脉粥样硬化均可见到裂解，崩解的弹力纤维。3.用于弹力纤维性假黄瘤的诊断。 该病镜下见真皮中下

26、部结缔组织变性， 呈团块状或条索状， 弱嗜碱性用弹力纤维染色法可以 鉴别。四、对染好弹力纤维的总结和体会1.这种方法对固定液没有特殊要求，一般福尔马林固定液即可，但时间不宜过长，过长可影 响染色。另外，不要用含有铬酸盐如 Zonker 氏固定液固定。2.认真配制好各种试剂。试剂配制的好坏， 直接关系到染色的成败， 因此要获得好的染色结果， 就必须先配制好试剂， 每一种试剂都必须认真仔细操作。 在这些方法中， 有的可配为储存液， 有的则应在临用前配 制。应注意的是，在配制 Weigert 氏雷琐辛品红时，可产生大量的气体，因此要用较大的容 器来配制。3.切片的氧化，漂白。上述的四种方法， 作者都作了大量的对照。 取同一病例， 分为甲乙两组， 甲组的切片的颜色 比乙组的鲜艳， 这是为什么呢？ 我们都知道， 所有的组织经甲醛固定后， 都形成了醛键， 这 些醛键的存在，影响了组织跟染液发色基团的更好结合。 为了使组织能更有效的显示出来， 利用某些试剂进行氧化， 把这些醛键打开， 然后再对切片进行漂白， 使切片不含有其它的杂 质，着色更纯正，实验证明效果很好。