生工发酵工程实验.docx

1、生工发酵工程实验实验一 酸奶的制作与乳酸菌的活菌计数（5学时）实验类型：综合性实验目的：1、学习并掌握酸奶制作的基本原理与方法。2、了解市售酸奶的生产工艺。3、掌握乳酸菌活菌计数方法与操作。实验原理：乳酸菌在乳中生长繁殖，发酵分解乳糖产生乳酸等有机酸，导致乳的pH值下降，使乳酪蛋白在其等电点附近发生凝集。乳酸菌属于兼性厌氧微生物，其在无氧条件下生长繁殖较好，实验室条件下利用混菌培养的方法，尽可能让乳酸菌在无氧条件下生长，每个单菌落代表一个微生物细胞。实验内容：（一）酸奶制作1、10%脱脂奶粉溶解于热水（80左右）中，充分搅拌均匀，配成调制乳；2、添加蔗糖：为了缓和酸奶的酸味，改善酸奶的口味，在

2、调制乳中加人4-8的蔗糖。3、灭菌：将乳加热至90，保温5min；4、接种：往冷却到43-45灭过菌的乳中加入乳酸菌，接种量为2%-5%。5、发酵：发酵的温度保持在40，发酵时间为4h。6、冷却：发酵结束，将酸奶从发酵室取出，用冷风迅速将其冷印到10以下，一般2 h，使酸奶中的乳酸菌停止生长，防止酸奶酸度过高而影响口感。8、冷藏和后熟：经冷却处理的酸奶，贮藏在4的冷藏室中保存。9、感官指标（二）乳酸菌活菌检测、检测培养基：蛋白胨15g，牛肉膏5g，葡萄糖20g，氯化钠5g，碳酸钙10g，琼脂粉10g，水1000ml，115121灭菌20min，灭菌后放置水浴52保温备用。 、稀释：取10克样品

3、放入添加90ml无菌水的带玻璃珠的250ml三角瓶中，摇床180rpm震荡30min，即为101样品溶液；再从中取1ml至添加90ml无菌生理盐水的三角瓶中，稀释至102，以此类推稀释至106。、倒制培养平板，从上述已稀释了的乳酸菌悬液中取1ml，在无菌操作台上注入90cm培养皿中，再将已经灭了菌的保持在52水浴锅中的呈溶解状态的培养基，倒入15毫升左右于培养皿中，全部浸到培养皿，与菌悬液充分混合均匀（倒入培养基后，马上用手转动培养皿，转动几下，让其混合均匀），然后等其凝固再移入培养箱中培养，注意最后一步倒平皿必须在超净台无菌操作，以免杂菌污染。每次稀释均要换灭好菌的移液管。、培养条件：37恒

4、温培养箱培养48h、培养完毕后，取出进行计数实验器材及试剂：菌种：市售酸奶试剂：白糖 奶粉 培养基各成分器材：培养箱、电炉、铝锅5L，培养皿酸奶发酵瓶： 自带实验结果：1.详细描述自己制作的酸奶结果。 1）色泽：色泽均匀一致，呈乳白色。 2）组织状态：有少量小气泡，上层有少量乳清析出,粘度下降。 3）气味、味道：酸味足，香味不够，不够细腻，无酒精发酵味，无霉味和其他外来不良气味。2.乳酸菌测定结果乳酸菌稀释培养后，在10、107、108条件下发现都没有乳酸菌生长，原因可能是打开瓶盖时间过久，有氧条件对乳酸菌有抑制作用或导致死亡；培养的乳酸菌活菌数少，稀释倍数过大3.思考题：乳酸菌的保藏通常为低

5、温条件，这给运输带来很大的成本，请问可采用什么方法使乳酸菌在常温条件下有很高的存活率以减少运输成本？答：在基因水平上对乳酸菌进行基因重组，从而获得耐高温乳酸菌。在基因库里筛选抗高温的基因并利用基因重组技术将其重组在乳酸菌基因上，对乳酸菌的基因进行修饰使其表达，以此来获得耐高温菌株。 实验二 枯草芽孢杆菌固态发酵及活菌数测定（5学时）实验类型：综合性实验目的：1、学习了解固态发酵原理；2、以枯草芽孢杆菌为对象，了解固态发酵的控制技术；3、掌握枯草芽孢杆菌活菌计数方法与操作。实验原理：作为抗生素的替代品，益生菌和酶制剂等的研究与开发近几年成为绿色饲料添加剂的热点，其中益生菌倍受关注。作为益生菌的一

6、种，芽孢杆菌制剂在动物生产中的研究和应用一直都是畜牧业科研和生产人员关注的焦点。目前芽孢杆菌多采用液体深层发酵技术，再经喷雾干燥进行生产，对设备要求高，生产工艺复杂；而固体发酵采用的原料一般是廉价的农副产品(如草粉、麸皮等)，采用的设备也较液体发酵简单，生产成本大大低于液体发酵。所以近年来各生产厂家都在积极探索芽孢杆菌的固体发酵技术，以求简化生产工艺，提高产量，降低生产成本。固态发酵定义：指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水不溶性固态基质中，培养一种或多种微生物的生物反应过程，其是以气相为连续相的生物反应过程。枯草芽孢杆菌属于好氧微生物，实验室条件下利用稀释涂布培养的方法，让菌在有氧

7、条件下生长，每个单菌落代表一个微生物细胞。实验内容：1、液体种子培养基配制：葡萄糖0.2%，NaCl 0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，pH 7.0。2、液体种子培养：每300 mL三角瓶装量50 mL液体种子培养基，在115条件下灭菌30 min。降温后从斜面接一环菌苔至种子培养基。置37控温摇床培养。转速200 rmin-1，至芽孢率达90%以上时停止，约需24 h。3、固体发酵培养基：麸皮60%，稻壳10%，玉米粉5%，豆粕25%，硫酸镁0.05%，硫酸铵0.5%，料水比为1:1.1。4、三角瓶固体发酵培养：每250 mL三角瓶装量20g（湿重），固体发酵培养基原料试剂混合料，加水，

8、料水比为1:1.1，搅拌均匀，培养基经121灭菌30 min，降温后接种量为2%(V/M：V液体菌种体积数，M固体发酵培养基的质量)，然后置37培养箱中静止培养，间时拍打，使其均匀生长。至脱落芽孢率为80%以上时，停止发酵，约需48 h。然后于60烘干、粉碎、计活菌数。（二）枯草芽孢菌活菌检测、检测培养基：葡萄糖0.2%，NaCl 0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，琼脂粉2%，pH 7.0。115灭菌20min，灭菌后放置水浴52保温备用。 、稀释：取10克样品放入添加90ml无菌水的带玻璃珠的250ml三角瓶中，摇床180rpm震荡30min，即为101样品溶液；再从中取1ml至添加90

9、ml无菌生理盐水的三角瓶中，稀释至102，以此类推稀释至108，即稀释了1亿倍;、倒制培养平板，将已经灭了菌的保持在52水浴锅中的呈溶解状态的培养基，倒入15毫升左右于培养皿中，全部浸到培养皿，待培养基凝固；从上述已稀释了1亿倍的菌悬液中取0.2ml于已凝固的培养基表面，用玻璃刮铲涂布均匀，静止10min，然后再移入培养箱中培养。、培养条件：37恒温培养箱培养2448h；、培养完毕后，取出进行计数，因为是稀释了5亿倍，所以一个透明圈菌落代表5亿/克，如果有200个透明圈，则是1000亿/克。实验器材及试剂：菌种：枯草芽孢杆菌试剂：培养基成分器材：培养箱、灭菌锅，培养皿实验结果： 1、详细描述枯

10、草芽孢杆菌固态培养物（外观、气味、培养物状态等）：答：枯草芽孢杆菌淡黄色，中间色深，表面较平整，无光泽，边缘不整齐，形成的菌落为圆形。培养基中的枯草芽孢杆菌有腥臭味，长势良好，观察培养基，无明显染菌现象。2、记录个人活菌测定中各平行数据，计算最终平均值。答：平行试验中，其他几个由于菌落连成一片，无法计数。只有如图一个平板中大约有120个透明圈，因为是稀释了5亿倍，所以600亿克。思考题：在枯草芽孢杆菌固态培养过程中，为了防止霉菌与酵母的污染，可采用什么方法？答：可以加入抗真菌制剂。 实验三、 淀粉糖化与酒精发酵（5学时）实验类型：综合性实验目的：1了解酒精发酵的主要类型、工艺原理及其控制条件2

11、熟悉酒精生产的工艺流程、掌握酒精发酵的操作方法 3. 掌握用酶法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法4. 掌握在实验室中模拟酒精发酵的工艺流程实验原理玉米粉、大米粉中可供发酵的物质主要是淀粉，而酿酒酵母由于缺乏相应的酶，所以不能直接利用淀粉进行酒精发酵，因此必须对原料进行预处理，包括蒸煮（液化）、糖化等，蒸煮可使淀粉糊化，并破坏细胞，形成均一的醪液，能更好的接受糖化酶的作用，并转化为可发酵性糖，以便酵母进行酒精发酵。在无氧条件下酵母菌利用可发酵性糖转化为酒精和二氧化碳的作用，称为酒精发酵，是生产酒精及各种酒类的基础，可通过测定发酵过程中产生CO2的量和最终产物酒精的量得知酵母的发酵能力。实验内容

12、1、原料的粉碎将玉米、大米用粉碎机粉碎到一定程度，玉米淀粉含量为70%，大米淀粉含量为75%。2、蒸煮糊化称取一定量的粉碎后淀粉质原料，按照一定的料水比（100g：200ml），调制淀粉乳，90-100条件下恒温水浴加热，淀粉乳受热后，在一定温度范围内，淀粉粒开始破坏，晶体结构消失，体积膨大，粘度急剧上升，呈粘稠的糊状，即成为非结晶性的淀粉。3、糖化经蒸煮糊化后的醪液，经过淀粉酶的糖化作用，将原料中的淀粉转化为可发酵性糖，供酵母利用。为加快糖化速度，可以提高酶用量，缩短糖化时间，但酶用量太高，反而使复合反应严重，最终导致葡萄糖值降低，在实际生产中，应充分利用糖化罐的容量，尽量延长糖化时间，减少

13、糖化酶用量。酶参考用量：淀粉乳33%，60，ph4.5，酶240U/g绝干淀粉，糖化时间16h。糊化醪液调整pH4.5，往其中加入一定量的淀粉酶（120U/g）、糖化酶（120U/g），60恒温下不断搅拌，直至粘度下降到一定程度，淀粉完全糖化4、发酵（1）干酵母活化将干酵母按1:20的比例投放于37的温水中复水20min。目的：恢复酵母细胞的正常功能。（2）淀粉醪液糖化后，取400ml上清液于洁净的大可乐瓶中，加相同体积的水稀释，加入活化好的酵母种液5ml，混匀，28度培养箱中静止培养36h左右。5、二氧化碳生成的检验（1）观察三角瓶中的发酵液有无气泡溢出；（2）滴入10%氢氧化钠1ml于发酵

14、液试管中，观察，如气体逐渐消失，则说明有二氧化碳的存在；6、二氧化碳生产量的测定（1）接种完，擦干瓶外壁，于天平上称量，记为W1;（2）实验结束，取出瓶轻轻摇动，使二氧化碳尽量溢出，在同一天平上称量，记为W2；（3）二氧化碳生成量= W1-W27、酒精生成的检验（1）打开瓶塞，嗅闻有无酒精气味；（2）取发酵液5ml，加10%硫酸2ml；（3）再加入1% K2Cr2O7溶液10-20滴，如颜色由黄色变为黄绿色，则说明有酒精产生。K2Cr2O7+H2SO4+CH3CH2OHCH3COOH+K2SO4+Cr2（SO4）3实验器材及试剂：菌种：活性干酵母试剂：培养基各成分、大米粉、活性干酵母、淀粉酶、

15、糖化酶、大可乐瓶（学生自备）溶液：10% H2SO4、1%K2Cr2O7、10%NaOH器材：试管、培养箱、灭菌锅、三角瓶、水浴锅、粉碎机、离心机1、 详细记录实验过程中各参数及数据。结果记录如表：淀粉淀粉酶CaCl2糖化酶100g10.522g0.17g1.17g糖化后，加入可乐瓶中的上清：400ml, 活化的酵母种液：10ml ，置于28的培养箱中静置培养36h左右。2、 对实验结果的判断与分析。实验结果检验：二氧化碳生成的检验 培养约48h后，观察瓶中混合液，淀粉大部分沉降在瓶底，上清浓度较稀，靠瓶壁边缘有一连串微小气泡 酒精生成的检验 打开瓶塞，闻到有浓重酒精气味。取发酵液5ml, 加

16、10%硫酸2ml,加1%K2Cr2O7溶液10-20滴，颜色由黄色变为黄绿色，稍加热后现象产生更快，更明显。 图示：酒精生成的检验结果 左侧：蒸馏水5ml,颜色偏黄，透明度高 右侧：发酵液5ml,黄绿色，与对照管有明显差异1、思考题：现有3株不同来源的酒精酵母，请设计实验判断哪株酵母发酵酒精能力最强？ 实验四 米曲霉固体发酵生产纤维素酶及酶解底物反应（5学时）实验类型：综合性实验目的：1、了解米曲霉固体发酵产酶情况2、掌握微生物固体发酵操作技术3、了解纤维素酶提取方法及酶活性定性测定方法实验原理纤维素酶是降解纤维素的一组酶的总称，是起协同作用的多组分酶系，属于诱导酶，其产生需要纤维素类物质的诱

17、导。实验中以米曲霉为发酵菌株，稻草作为产酶诱导物。实验内容1、米曲霉菌种活化（1）配制PDA培养基：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g葡萄糖和20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml（视试管大小而定），15磅蒸气（121）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。（2）在无菌超净台上接种保藏的米曲霉于PDA斜面，28培养5-7天，斜面上长满孢子。2、配制发酵培养基：15g麸皮+10g稻草粉，0.5%KH2PO4，0.5% (NH4)2SO4，加15ml水（加水量40%60%），拌匀，装瓶；3、灭菌：121 灭菌

18、30min，冷却至室温。 4、米曲霉孢子悬浮液制备已培养好的米曲霉孢子斜面一支，加入约10ml无菌水，洗下孢子，制成孢子悬液。 5、接种：用移液管在无菌条件下吸取一定量的悬液，移入灭菌好的固体培养基中，于30度条件下培养96h，期间每隔12h摇动三角瓶一次。6、提取粗酶液：向瓶中加入无菌水约50ml，浸泡固体曲30min-1h；过滤得粗酶液。 7、酶活性测定（1）配制1%CMC底物平板：配方：1g羧甲基纤维素钠，1.8g琼脂， 100ml，琼脂完全溶解后，加入0.03g曲利本蓝，倒平板，每皿约15ml。（2）打孔：打孔器经酒精燃烧灭菌后，每平板打4孔，并在酒精灯火焰上稍稍加热打孔处，使孔周围的

19、培养基微融，然后平放冷却。 （3）加样：往孔内加入粗酶液适量（约100ul），同时需设对照。 （4）培养（反应）：将加样后的平板小心平端放入30培养箱，放置20小时左右。 （5）观察结果：可直接观察透明圈有无、测定透明圈直径。实验器材及试剂：菌种：米曲霉试剂：土豆、稻草、麸皮、硫酸铵、羧甲基纤维素钠（CMC）器材：培养箱、灭菌锅、三角瓶、摇床、离心机、天平、三角瓶实验结果：1、仔细观察固体培养基发酵前后的状态，并描述； 固体培养基发酵前：培养基颜色较浅，各成分（麸皮、稻草）新鲜，粘度大成团状固体培养基发酵后：培养基中产生较多黑色孢子及菌体，培养基营养成分被利用，体积缩小。2、仔细观察底物平板酶

20、解前后的现象，并测量水解圈大小。答：每个平板设置四个不同酶液加入量梯度：0ml、50ml、75ml、100ml，并依次加入所打孔中，酶解后孔的四周均出现不同大小水解圈。加入酶液体积/ml05075100水解圈直径/mm08915 误差分析：打孔时孔径及深度太小，酶液加入过多后有部分流出，导致孔周围的水解圈不规则，且大小不能如实反映加入的酶液的活性。思考题：纤维素是自然界最丰富的资源，从理论角度分析如何最大限度地通过酶法利用该资源？而现实存在什么问题？实验五 甘露聚糖酶液体发酵及酶解反应（6 学时）实验类型：综合性实验目的：1. 了解并掌握液体发酵产酶操作及酶反应条件的控制2. 与固体发酵产酶进

21、行比较分析实验原理甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分，其主链是由吡喃甘露糖残基以1,4-D糖苷键连接而成。当主链的某些残基被葡萄糖取代，或半乳糖通过1,6-糖苷键与甘露糖残基相连形成分枝，则称之为异甘露聚糖，主要有半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖。甘露聚糖是半纤维素的第二大组分，在自然界中分布广泛，且多以异甘露聚糖的形式存在，同型甘露聚糖十分少见。-甘露聚糖酶以内切方式降解甘露聚糖主链产生不同聚合度的甘露寡糖和少量甘露糖，是甘露聚糖降解酶中最关键的酶。甘露聚糖酶可广泛应用于食品、造纸、纺织印染等行业。利用-甘露聚糖酶可以制取有特殊保健作用的甘露寡糖。在纸浆制造业，可用于代替碱法进行脱

22、色、漂白。在纺织印染方面，利用-甘露聚糖酶与其它酶联合作用，能有效去除产品上粘附的多余染料，降低能耗和对环境的污染等。甘露聚糖酶的工业化生产将在许多行业产生很大的经济和社会效益。因此，近年来甘露聚糖酶逐渐成为国内外关注和研究的热点之一。甘露聚糖酶是一种半纤维素酶，其产生需要一定的诱导物存在。本实验以枯草芽孢杆菌为菌株，以魔芋粉为诱导物。实验内容1. 菌种活化（1）配制LB固体培养基：蛋白胨10g/L， 酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂 20g/L，待琼脂充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml（视试管大小而定），15磅蒸气（121）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却

23、后贮存备用。（2）在无菌超净台上接种保藏的枯草芽孢杆菌于PDA斜面，28培养2天。2. 配制产酶培养基：蛋白胨10g/L， 酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，魔芋粉 30g/L，3. 以10%的体积量分装于三角瓶中（25ml液体培养基/250ml三角瓶），121灭菌20分钟；4. 菌悬液的制备已培养好的枯草杆菌斜面一支，加入约10ml无菌水，洗下菌体，制成菌悬液。 5. 接种用移液管在无菌条件下吸取一定量的悬液，移入灭菌好的固体培养基中，于37度200rpm条件下培养72h。6. 粗酶液提取3000rpm离心收集得到粗酶液7. 酶解底物分析准备两三角瓶，分别加入50ml自来水，46度水浴保

24、温8. 往两三角瓶中各加入1g魔芋粉，然后其中一个加入粗酶液1ml，另一个加入1ml蒸馏水（做空白对照）。以后每隔5-10min往两三角瓶中各加入1g魔芋粉，前后共加5g9. 酶解反应30-60min，期间观察反应现象。实验器材及试剂：菌种：枯草芽孢杆菌试剂：蛋白胨、酵母粉、氯化钠、魔芋粉器材：培养箱、灭菌锅、三角瓶、摇床、离心机、天平、三角瓶实验结果：1、仔细观察液体培养基发酵前后的状态，并描述；发酵之前的液体培养基的状态：在配制产酶培养基时，魔芋粉难溶解，依旧是固体颗粒。等完全灭完菌后，放正在实验台上，等冷却后，状态比较像固体培养基，但魔芋粉依旧不溶解，其颗粒均匀地分布于培养基中。经过三天

25、的培养之后，产酶培养基被液化，得到的是含有粗酶液的液体培养基，完全呈黄褐色的液体状。2、仔细观察底物水解前后的现象。答：对照组：魔芋粉结成团，透明，具有弹性，黏度很大，无法搅拌，实验难以继续。 实验组：魔芋粉已被完全酶解，三角瓶中完全是液体状的酶解产物，溶液呈透明状。实验分析：（1）魔芋粉的主要成分是葡甘露聚糖，吸水性好，膨胀率高，可被-甘露聚糖酶分解从而降低黏性。（2）实验组中加入了含有-甘露聚糖酶的粗酶液，其可分解魔芋粉，使得三角瓶液体的黏度降低。（3）对照组不含有-甘露聚糖酶，所以随着魔芋粉的添加，黏度不断增大。实验六 从土壤中分离筛选产抗生素放线菌及抗菌谱分析（6学时）实验类型：设计性

26、实验目的：1、从土壤中初步筛选分离产抗生素的放线菌。2、利用高氏一号培养基分离纯化放线菌。3、熟悉整个操作过程的各项实验技能。实验原理：放线菌是一类呈菌丝状生长，主要以孢子繁殖。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约80%是各种放线菌所产生的。 许多临床应用的抗生素均由土壤中分离的放线菌产生。采用选择培养基可分离土壤中的放线菌。产抗生素的放线菌经液体培养后，其分泌的抗生素存在于离心所得的上清液中，可采用微生物的抑菌试验进行检测，从而筛选到所需的抗生素产生菌，并对其进一步培养，繁殖，发酵，最终提取我们所需的抗生素。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120热处理1h），或加

27、入某种抑制剂（如加150mg/L的重铬酸钾等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。放线菌可以产生抗生素，抑制其他菌种的生长，故可用枯草芽孢杆菌（G+）和大肠杆菌（G-）作指示菌鉴别放线菌。高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基。实验器材：1、在沙湖边取得的土壤2、培养基：高氏一号培养基、LB培养基3、其他：重铬酸钾、培养皿、牛津杯、接种环、酒精灯，无菌涂棒、三角锥瓶、高压蒸汽灭菌锅、天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、试管、牛皮纸、线绳等。实验内容：1

28、、土壤放线菌株的采集 采集样品：选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取210cm处的土壤。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等。 样品（土壤）处理：室温风干2、高氏一号合成培养基的制备依次在三角瓶中加入K2HPO4 3H2O 0.125g，可溶性淀粉5g，硝酸钾0.25, MgSO47H2O0.125g， FeSO47H2O 0.025g，氯化钠0.125g，重铬酸钾0.0375g,水250ml溶解，调节pH7.4，再加入琼脂不断搅拌震荡至溶化后， 121灭菌20分钟。将6套平皿、12只试管也同时灭菌。

29、灭完菌后，待高氏一号培养基冷却到60，后倒平板，进行冷却，待用于涂布。3、土壤悬液梯度稀释 将5.0g土壤加入到50ml灭菌的蒸馏水中，震荡20min制备土壤悬液。 用无菌吸管吸取1ml土壤悬液，加入到9ml灭菌的蒸馏水中10倍稀释。 按1：:1稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，将3块灭菌平板分别依次标记 ，稀释过程应在无菌条件下进行。 涂布培养 用枪头约取1ml稀释液加入平板中，用涂布棒进行涂布。接种完毕，将平皿和试管放入28恒温箱培养7天，观察平皿上放线菌（主要是链霉菌）菌落。4、 菌种转接：挑取培养7天后培养基上的类似放线菌的细菌进行转接，注意要挑取培养基。5、 拮抗实验 长出菌落后，要判断是否已分离到了纯菌种。 配置LB培养基，倒平板，再分别接种大肠杆菌与枯草芽孢杆菌。 标号 枯草芽孢杆菌和大肠杆菌培养基各两个，在平板上标注均匀间隔的2个区域。 挑菌落 在纯培养的平板上切取生长较好的放线菌落依次放入标注区域中（在火焰旁切取），置于28恒温箱培养1天后，若观察到有抑菌圈生成，就得到了纯的放线菌。6、 制作高氏一号培养基斜面试管，再将已确定的放线菌菌种，在无菌操作的条件下进行划线接种。