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1、细胞生物学第二章 细胞的统一性与多样性 本章要点: 1、掌握原核细胞与真核细胞的区别。 2、理解为什么支原体是最小的细胞。 3、了解病毒的生活史和进化地位。第一节 细胞的基本概念一、细胞是生命活动的基本单位 1.一切有机体都由细胞构成，细胞是构成有机体的基本单位2.细胞具有独立的、有序的自控代谢体系，细胞是代谢与功能的基本单位3.细胞是有机体生长与发育的基础4.细胞是遗传的基本单位，细胞具有遗传的全能性5.没有细胞就没有完整的生命 二、细胞概念的一些新思考细胞是多层次非线性的复杂结构体系 细胞具有高度复杂性和组织性细胞是物质（结构）、能量与信息过程精巧结合的综合体 细胞完成各种化学反应； 细胞

2、需要和利用能量； 细胞参与大量机械活动； 细胞对刺激作出反应；细胞是高度有序的，具有自组装能力与自组织体系。 细胞能进行自我调控； 繁殖和传留后代；三、细胞的基本共性1. 所有的细胞都有相似的化学组成。2. 所有的细胞表面均有由磷脂双分子层与镶嵌蛋白质构成的生物膜，即细胞膜。3. 所有的细胞都含有两种核酸：即DNA与RNA作为遗传信息复制与转录的载体。4. 作为蛋白质合成的机器核糖体，毫无例外地存在于一切细胞内。5. 所有细胞的增殖都以一分为二的方式进行分裂。第二节 原核细胞与真核细胞一、 原 核 细 胞基本特点：1、遗传的信息量小，一个环状DNA构成；2、细胞内没有分化为以膜为基础的具有专门

3、结构与功能的细胞器和细胞核膜。主要代表：1、支原体（mycoplast）最小最简单的细胞；2、细菌3、蓝藻又称蓝细菌（Cyanobacteria）1、支原体 支原体是目前发现的最简单、最小的原核细胞，也是惟一一种没有细胞壁的原核细胞。1、 大小：是原核细胞生物中最小的，一般0.10.3m；2、 结构：最外层为细胞膜，三层结构，内外层为蛋白质，中间层为脂质；少数有荚膜，有的有特殊的顶端结构；3、 增殖方式：以二分裂繁殖为主；4、 基因组：为一分子量小的环状双股DNA；5、 形态与染色：多形性，革兰染色阴性但不易着染。为什么说支原体是最小的细胞？1. 质膜、DNA、RNA、核糖体和某些必须的酶是一

4、个细胞生存与繁殖必须具备的物质基础。支原体均已具备。2. 从保证一个细胞生命活动运转所必须的条件来看，至少需要100种酶（占据空间约直径50nm）、数目不等的核糖体（1020nm/个）和核酸、质膜。这样，一个细胞的极限直径不能小于100nm。3. 目前发现的最小支原体直径已经接近这个极限。2、细菌（1）是在自然界分布最广、个体数量最多的有机体。（2）可分为：球菌、杆菌和螺旋菌（弧形菌）。（3）绝大多数细菌的直径在0.55m之间。 细菌的界膜， 由一层坚硬的细胞壁包裹起来，壁厚约15100 nm ，有些细菌的表面还有一层荚膜。荚膜：细菌最外表的一层多糖类物质，边界明显的称荚膜（capsule），

5、如肺炎球菌，边界不明显的称粘液层（slime layer），如葡萄球菌。功能：抵御不良环境；保护自身不受吞噬；选择性的粘附到特定细胞的表面上。 原核细胞的细胞质膜是多功能的， 其最重要的功能就是运输作用， 包括营养物质的吸收、废物的排除、能量代谢等。细菌的细胞质膜往往会内陷折皱形成中膜体(mesosome)， 具有类似线粒体的作用， 故称为拟线粒体。细菌质膜还参与遗传物质的复制和分配，因为细菌没有细胞核，所以细菌的DNA在复制时只能结合在质膜上，然后进行细胞的分裂。 细菌的核结构： 仅为DNA与少量RNA或蛋白质结合物， 也没有核仁和有丝分裂器。E.coli的DNA是环状的，长为4.2106k

6、b，约4000个基因。细菌除了具有染色体DNA外，还有核外DNA，即质粒DNA。质粒是比染色体小的遗传物质，为环状的双链DNA， 常常赋予细胞对抗生素的抗性。细菌体表还有菌毛和鞭毛。菌毛有两种，一种短而细，具有呼吸作用；另一种是数量少但细长的性纤毛，为雄性菌所特有。鞭毛是细菌的运动器官， 鞭毛蛋白的氨基酸组成与横纹肌中的肌动蛋白相似。 菌毛：细菌运动无关，分为普通菌毛和 鞭毛：是某些细菌的运动器官，由一性菌毛两类。前者与细菌吸附和侵染宿 种称为鞭毛蛋白的弹性蛋白构成，结主有关，后者为中空管子，与传递遗传 构上不同于真核生物的鞭毛。物质有关。3、蓝藻细胞1. 又称蓝细菌，是最简单的自养生物。它的

7、光合作用类似于高等植物 ，而不同于光合细菌。没有叶绿体，但有质膜内陷形成的捕光装置。2. DNA分子环状，但遗传信息量很大，可与高等植物相比。3. 体积比其它原核细胞大得多，直径约10m左右，甚至可达70m (颤藻)。4. 属单细胞生物，但有些蓝藻经常以丝状的细胞群体存在，如：属蓝藻门念珠藻类的发菜就是蓝藻的丝状体。二、古 细 菌（archaebacteria） 分布 进化地位及主要证据进化证据（1）细胞壁成分：（2）DNA与基因结构：重复序列、内含子。（3）有类核小体结构：（4）有类似真核细胞的核糖体：（5）5S rRNA分子进化分析： 除上述各点外，还有其他一些类似依据，说明古细菌与真核生

8、物在进化上的关系较真细菌类更为密切。三、真 核 生 物 真核细胞的基本结构体系 细胞的大小及其分析 原核细胞与真核细胞的比较1、 真核细胞的基本结构体系 以脂质及蛋白质成分为基础的生物膜结构系统； 以核酸（DNA或RNA）与蛋白质为主要成分的遗传信息表达系统； 由特异蛋白分子装配构成的细胞骨架系统。2、 细胞的大小分析各类细胞直径的比较细胞类型直径大小（um）最小的病毒0.02支原体细胞0.10.3细菌细胞12动植物细胞2030(1050)原生动物细胞数百至数千细胞体积为什么不能无限大？1.随着直径的增加，细胞体积与表面的增长速度不一样，从而限制体积的无限增大。2.更重要的是，胞内重要分子浓度

9、的维持是细胞生命活动的基础。体积太大会造成浓度的降低。真核细胞通过内膜系统造成细胞隔室，维持特定分子的浓度。四、原核细胞与真核细胞的比较原核细胞与真核细胞基本特征的比较原核细胞与真核细胞的遗传结构装置和基因表达的比较五、植物细胞与动物细胞的比较 细胞壁 液泡 叶绿体 第三节 病毒一、病毒的基本知识1.病毒（virus）核酸分子（DNA或RNA）与蛋白质构成的核酸-蛋白质复合体；根据病毒的核酸类型可以将其分为两大类： DNA病毒与RNA病毒 病毒的多样性2.类病毒（viroid）仅由感染性的RNA构成；3.朊病毒（prion） 仅由感染性的蛋白质亚基构成；二、病毒的生活史 侵入、感染细胞 核酸复

10、制、表达 病毒成熟、释放二、 病毒与细胞在起源与进化中的关系 病毒是非细胞形态的生命体，它的主要生命活动必须要在细胞内实现。病毒与细胞在起源上的关系，目前存在3种主要观点： 生物大分子病毒细胞 生物大分子：（1）病毒 （2）细胞 生物大分子细胞 病毒思考题1、为什么说支原体是最小的细胞？2、原核细胞和真核的主要区别？3、你认为病毒的进化地位如何？为什么？第三章 细胞生物学的研究方法1、了解细胞形态结构的观察方法；2、了解细胞组分的分析方法；3、了解细胞培养与细胞工程技术；4、分子生物学方法。第一节 显微镜技术一、显微镜与分辨率（1）、明视距离： 物体在人眼视网膜上成像的大小和物体与眼睛的距离有

11、关。物体离眼睛的距离越近，视网膜上的物像就大，但眼睛的曲光度就随之增大，眼部肌肉就越发疲劳。经测试在物体离人眼25cm时，看物体又清楚，眼肌也不疲劳，因此把人眼正常工作距离定为25cm，称之为明视距离。（2）、分辨力和光镜的分辨极限分辨力（Resolution）：又叫分辨本领，是指将邻近两点清晰区分辨认的能力。分辨极限（Limit of resolution）对可见光来说，能清楚分辨出相邻两点之间的最小间隔为0.2 m。R 0.61 / n .sin 0.610.5 m / 1.51 0.2 m二、光学显微镜技术1、普通光学显微镜技术显微镜结构： 机械部分：镜座、镜柱、镜臂 镜筒、调焦装置、

12、载物台（物镜转换器） 照明部分：反光镜、聚光镜 光学部分：目镜、物镜放大倍数：目镜的放大倍数物镜的放大倍数2、荧光显微镜技术(fluorescence microscopy)是以紫外线为光源来激发生物标本中的荧光物质，产生能观察到各种颜色荧光的一种光学显微镜。利用它可研究荧光物质在组织和细胞内的分布。荧光（Fluorescence）：细胞中的某些物质（如叶绿素）经紫外线照射后能发出可见光线，称为荧光。自发荧光：由细胞本身存在的物质经紫外线照射后发出的荧光。诱发荧光：一些细胞成分本身经紫外线照射后不发荧光，但用荧光染料（酸性品红、甲基绿、吖叮橙等荧光色素）进行活体染色或固定后切片染色，就能在荧光

13、镜下看见荧光，这种荧光叫诱发荧光。 用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。3、相差显微镜技术只有光线通过染色标本时其波长、振幅发生变化，人眼才能看见，但活细胞和未染色的标本由于光波长和振幅不发生变化，人眼看不到，但其相位有变化，因此利用光的干涉和衍射效应把透过标本不同区域的光波光程差转变成振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比。相差显微镜比普通光镜多了2个部件：1）在聚光器上增加一个环形光阑；2）在物镜后焦面增加一个相板，相板上有一个环形区，通过环形区的光比从其它区域透过的光超前或滞后14 ，这样就使通过标本不同区域光波的相位差转变为振幅差。 光通过标

14、本致密区时发生衍射，产生偏折光，相位和未受影响的直射光相比被推迟了14 。只有未发生偏折的的直射光可通过相位板的环形区，其它的偏折光在物镜的后焦面上产生了一个与通过相位板的环形区的光不同的1/4的光程差。两组光在平面上成像。如相板的环形区使直射光超前1/4，加上开始直射光超前的1/4，直射光共超前1/2，直射光和偏折光叠加形成的合成波振幅减少，产生暗反差。 如相板的环形区使直射光滞后1/4，加上开始直射光超前的1/4，两者相抵直射光不发生变化，直射光和偏折光无相位变化，形成的合成波振幅增加，产生明反差。结果未经染色的活细胞内的各种组织就可显现不同的明暗对比。相差显微镜可观察活细胞的各种活动，如

15、细胞迁移、分裂，运动等。3、 共焦激光扫描显微镜技术共焦激光扫描显微镜技术 是在荧光显微镜成像的基础上装有激光扫描装置，以单色激光作为光源，使样品被激发出荧光，利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。共焦显微镜利用激光扫描束经照明孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描，由于照明孔与检测孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明孔和检测孔，焦平面以外的点不会在检测孔处成像，这样就得到了标本清晰的光学切面图，克服了普通光镜图像模糊的缺点。在显微镜载物台上加一个微量步进马达，使载物台上下移动，改变焦平面，不同层次的光切面图像经计算机图像三维重组，就能获得样品的

16、立体结构图像。 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。 能显示细胞样品的立体结构。 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。三、 电子显微镜技术光镜分辩极限为0.2 m，小于0.2 m的微细结构的光波可产生衍射现象,这种光波经过物体时可绕过物体就象无物体经过一样,因此无法用光镜观察。这就需要一种更大分辫力的仪器来观察比0.2 m更小的物体的微细结构。 电子波长比光波短得多,用电子波代替光波可提高显微镜的分辩力。电镜就是根据这样的原理产生的。r=0.61/NA一、 透射电镜（TEM）1.原理 以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加

17、速电压(通常50120KV)的平方根成反比。 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。 用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2m、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构（submicroscopic structures）。1）、透射电镜标本制备过程:取材:尽可能保持生活状态,避免损伤必须耐真空。固定:常用戊二醛和四氧化锇固定戊二醛在蛋白质分子之间形成共价键,将它们交联在一起。脱水:电镜不能观察含水的生物标本，需经脱水处理。包埋:常用环氧树脂。切片:电子穿透力弱,需制成50100nm厚的薄片

18、。染色:常用的染色剂：醋酸铀、枸橼酸铅。2）、提高样品反差的方法负染法:将病毒、纤维、核糖体或分离的生物大分子样品放于覆有亲水性支持膜的载网上,滴加磷钨酸,样品干燥后重金属盐沉积于样品周围使样品和背景形成显著的明暗对比,这种染背景而不染样品的方法叫负染。冷冻蚀刻复型电镜技术亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。冷冻：制冷剂（一般为液态氮）快速冷冻，使样品固定。断裂：在低温真空中将样品劈开，断裂面上可见各种细胞内结构。蚀刻：升温使冰升华，细胞内外含水多的

19、地方因失水而下陷，膜和其它结构显露出来，增强了断面的浮雕效果。复型：以45喷铂金，90喷碳固定，显示立体结构。剥膜：将样品取出，浸泡于腐蚀夜中将生物组织腐蚀掉，只剩下铂碳复型膜，捞于载网上干燥后透射电镜观察。二、扫描电子显微镜20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。分辨力为610nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的

20、扫描图像。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。扫描电子显微镜原理三、扫描隧道显微镜原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。分辨率：横向为0.10.2nm，纵向可达0.001nm。用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。第二节 细胞组分的分离方法一、 细胞组分的分级分离原理：1）利用颗粒大小的不同: 差速离

21、心法 速度区带离心法 2）利用颗粒密度的不同: 等密度离心法1、差速离心法：用于分离大小、形状不同显著的组分，根据颗粒沉降速度不同得以分离2、速度区带离心法：用于分离密度相近而大小不一的组分3、等密度离心法：按细胞组分的浮力密度不同进行分离的方法。适用于大小、形态相似而密度不同的组分。常将样品通过高浓度的蔗糖或氯化铯的密度梯度沉降在达到与自身密度相等的位置就停滞不再向下沉降。此方法直接证明了DNA的不保留复制。二、 细胞化学技术主要是指利用某些显色剂与待检物质（蛋白质、核酸、多糖、脂质等大分子）中的某些特定基团特异性结合特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色深浅来判断待检物质在细胞中的分布与含量

22、。（一） 胞内特定蛋白质的显示与定位例如：酶细胞化学技术通过酶的特异生化反应来显示酶在细胞内的分布及酶活性强弱。水解酶细胞化学反应如：磷酸水解酶的定位（Pb2+）氧化还原酶细胞化学反应如：过氧化氢酶定位（DAB饿酸）又如：特异蛋白抗原免疫定位技术常用的标记方法：1)荧光标记：异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明2)酶标记：辣根过氧化物酶（HRP）3)铁蛋白标记：铁蛋白是含铁离子的蛋白质，在电镜下铁离子可显黑色4)胶体金标记：即金的水溶液，具有一般溶液的特性，用它与抗体标记后，经抗原抗体反应可定位抗原的存在。（二）特异核酸序列的定位与定性核酸分子杂交：按照碱基互补配对原则，将不同来源的序列互补单链

23、的DNA/DNA，RNA/RNA，RNA/DNA，互补配对成双链杂交分子，这一过程叫核酸分子杂交。 原位杂交：用核苷酸探针对特殊的核苷酸顺序在其原位进行杂交,叫原位杂交。可用于DNA、RNA定位研究。二、聚合酶链反应技术（polymerase chain reaction，PCR）又叫体外基因扩增技术。利用人工合成的一对引物，在被扩增DNA模板链的两端形成双链，由DNA聚合酶催化一对引物之间的聚合反应。 具体过程： 变性：将双链DNA加热（95）使之变性，DNA双链 变成单链 退火：降低温度至56使引物与模板DNA单链结合 延伸：将温度升至72，在DNA聚合酶作用下，在引物3端进行延伸，使原模

24、板DNA的一条链变成两条链。（三）、放射自显影术(autoradiography)放射性核素在蜕变过程中发出带电粒子可使感光材料感光。利用这样的特性，用放射性化合物脉冲标记活细胞,经固定、切片后在暗处把感光乳胶覆盖于切片上,在此期间,由于放射性同位素衰变使乳胶曝光,经显影、定影,根据银粒所在部位,就可知道细胞中放射性物质的分布。一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示DNA，用3H-UDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质；用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。（四）、流式细胞仪技术用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细

25、胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计。第三节 细胞培养、细胞工程技术一、动物细胞培养技术二、植物细胞培养技术三、细胞工程技术第四节 细胞生物学常用模式生物一、病毒：遗传学操作、生命物质自组装二、细菌：基因工程操作、基因表达调控研究三、酵母：细胞周期研究四、线虫：细胞凋亡研究五、果蝇：遗传学研究模式生物六、斑马鱼：胚胎发育研究七、小鼠：胚胎学、组织学、胚胎学第四章 细胞质膜知识要点： 1 、掌握几种膜分子结构模型学说

26、，并评价之。 2 、了解膜结构的组成成分和组成方式。 3 、理解质膜流动性和不对称性两大特点。 4、了解红细胞膜骨架的组成和功能。第一节 细胞膜结构模型与成分一、细胞膜结构膜(membrane)是细胞的重要结构， 包括细胞质膜 (plasma membrane)、内膜 (internal membrane)， 习惯上把细胞所有膜结构统称为生物膜(biomembrane)。虽然细胞很早就在光镜下被发现,但其是否有明确的边界结构,尚未可知,直到电镜发明发现质膜的超微结构,但人们并不惊奇,因为在此之前已侦知。1、关于膜的化学组成的早期研究:18世纪90年代，Overton 用植物的根毛作实验，发现脂

27、溶性物质很容易进入细胞，而水溶性的物质却不能。实际上他发现了亲脂性(lipophilic)物质与细胞的关系。根据这一研究结果，Overton认为在细胞的外被中有脂的存在， 他还进一步推测，细胞的外被中很可能有胆固醇和卵磷脂的存在， 这种推测后来被证明是完全正确的。2、脂单层(lipid monolayer)的发现：Irving Langmuir将红细胞的膜脂提取后铺展在水盘的水面上，研究了脂的展层行为，提出脂单层的设想3、脂双层(lipid bilayer)的发现：1925年，荷兰科学家E.Gorter和F.Grendel用丙酮抽提人红细胞膜按Langmuir的方法铺展在水相上，发现展层后脂单

28、层的面积和根据体积所推算的总面积（显微镜下红细胞为直径约为7m的扁平状, 据此推测红细胞的表面积约为100m2）之比为1.82.21 ，为了解释这一结果，他们提出红细胞膜的基本结构是脂双层。4、片层结构模型1935年James Daniellie和Hugh Davson发现质膜的表面张力比单纯油水界面的要低得多,而当时就已知若脂滴吸附有蛋白质会降低其表面张力, 从而提出“双分子片层”结构模型。该模型是第一次用分子术语描述的结构，并将膜结构同所观察到的生物学理化性质联系起来，对后来的研究有很大的启发。5、单位膜模型(unit membrane model)1959年，J.D.Robertson在

29、电子显微镜下发现细胞膜是类似铁轨结构，两条暗线被一条明亮的带隔开，显示暗明暗三层，总厚度为7.5nm，中间层为3.5nm，内外两层各为2nm。并推测:暗层是蛋白质，透明层是脂，并建议将这种结构称为单位膜。单位膜模型的评价单位膜模型与片层结构模型相似，但它认为膜脂两侧蛋白质为折叠片状, 另外, 还认为膜外侧表面蛋白是糖蛋白,且膜蛋白在两侧的分布是不对称的。这一模型能够解释细胞质膜的一些基本特性，例如质膜有很高的电阻，这是由于膜脂的非极性端的碳氢化合物是不良导体的缘故；再如由于膜脂的存在，使它对脂溶性强的非极性分子有较高的通透性，而脂溶性弱的小分子则不易透过膜。单位膜也有一些不足首先该模型把膜看成

30、是静止的,无法说明膜如何适应细胞生命活动的变化；其二，不同的膜其厚度不都是7.5 nm,一般在510 nm之间；其三，若蛋白质是伸展的, 则不能解释酶的活性同构型的关系。最后，该模型也不能解释为什么有的膜蛋白很容易被分离，有些则很难。6、流动镶嵌模型1972年Singer和Nicolson总结了当时有关膜结构模型及各种研究的新成就，提出了流动镶嵌模型。 这一模型强调了膜的流动性和不对称性，认为球形膜蛋白分子以各种镶嵌形式与脂双分子层相结合,且这些蛋白大多是功能蛋白。流动镶嵌模型的主要内容细胞膜由流动的双脂层和嵌在其中的蛋白质组成。磷脂分子以疏水性尾部相对，极性头部朝向水相组成膜骨架；蛋白质或嵌在双脂层表面，或嵌在其内部，或横跨整个双脂层，表现出分布的不对称性。流动镶嵌模型评价流动相嵌模型有两个主要特点。其一,蛋白质不是伸展的片层,而是以折叠的球形镶嵌在脂双层中,蛋白质与膜脂的结合程度取决于膜蛋白中氨基酸的性质。其二膜有一定的流动性,不再是封闭的片状结构,以适应细胞各种功能的需要。这一模型强调了膜的流动性和不对称性,较好地体现细胞的功能特点,被广泛接受,也得到许多实验的支持。7、脂筏（lipid raf