微生物的检测资料.docx

1、微生物的检测资料柯赫法则：1、 在每一相同病例中都出现这种微生物；2 、要从寄主分离出这样的微生物并在培养基中培养出来；3、用这种微生物的纯培养接种健康而敏感的寄主，同样的疾病会重复发生；4 、从试验发病的寄主中能再度分离培养出这种微生物 金黄色葡萄球菌引起急性肠胃炎；沙门氏菌引起伤寒、霍乱；溶血性链球菌引起猩红热；志贺氏菌引起菌痢。肉毒梭菌致死率可达30%60%，产生的毒素是自然界毒性最强的蛋白质，也可用来治疗障碍性疾病微生物检测：就是应用微生物学的理论、方法和技术，对食品或药品在研制、生产、保藏过程中进行质量检测和安全性评价的专业技术学科。主要研究外界环境和食品或药品中微生物的种类、数量、

2、性质、活动规律及其对人和动物健康的影响。微生物检验意义是衡量食品和药品卫生质量的重要指标之一，是判定被检食品或药品能否食用或药用的科学依据之一。是判断食品和药品加工原料、生产环境卫生情况及对成品被污染的程度作出正确的评价，为卫生管理工作提供科学依据。微生物检验贯彻“预防为主”的卫生方针，有效的防止或减少食物中、药品毒害、人兽共患病的发生。保障人民身体健康。提高产品质量，避免经济损失。微生物检测对象 (1)食品(2)化妆品(3)药品(4)一次性用品及其他生活用品(5)应施检疫的出口动物产品(6)环境(7)有关国际条约或其他法律、法规规定的强制性卫生检验的进出口商品二、微生物检测技术的发展迫切需求

3、灵敏度更高、特异性更强、简便快捷的微生物检测技术和方法，建立和完善适应国际贸易的各类产品微生物检测技术和体系迫在眉睫。传统检验技术显微技术，实验室中常用的有普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。利用血细胞计数器在显微镜下直接计数是一种常见的微生物计总数的方法。革兰氏染色技术：是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。培养计数法：平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后,其中的微生物充分分散成单个细胞,取一定量的稀释样液涂在平板上,经过培养,由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落,即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样

4、品中的含菌数。现代微生物检测技术现状趋势：都致力于快速、简便、特异、敏感、低耗且实用的检测技术和方法的研究研究的技术手段产生了很大的变革：已由培养水平逐步向分子水平迈进；近年来兴起的基因芯片技术及自动微生物检测系统，将从根本上改变微生物的检测方法；气相色谱法、气质联用等现代仪器分析法也应用于微生物检测中。微生物检验的质量控制措施：(1)应严格按照国家规定对试验仪器、设设备、器具进行定期的检定、维护和保养。(2)严格控制培养基、试剂、染色及诊断血清的质量(3)确保菌株的良好保存 ，标准菌株和从样品中分离出的菌株，其保存方法有多种，最理想的为真空冷冻干燥法，但这种方法的操作技术难度大，花费高，需特

5、殊设备，一般单位不易做到。常规琼脂斜面保存法常因传代次数多，易污染，易变异。近年来卵黄液普通安瓿熔封法超低温保存菌种（4）检验方法的选择，检验方法是微生物实验室质量保证的重要步骤,必须统一、准确可靠。优先采用国家规定的标准检验方法或国际标准、行业标准、地方标准规定的检验方法,无上述标准时，经协商也可采用企业标准。确定试验和实验室标准，用阴性、阳性标准菌株做确证试验，特别在做微生物生化试验和免疫试验时一定要设立阴性、阳性对照组。（5）建立实验室工作失败报告、内审制度，记录整个试验过程中的错误信息，通过管理评审，制定整改措施，及时整改；定期参加质控评比，不断提高试验技术水平；及时更新程序性文件，完

6、善实验室质量保证体系。(6)检验报告和原始记录的质量控制检验报告书是检测的最终产品，经单位技术负责人签发即产生法律效力。检验报告、检验原始记录都应规范填写，认真审核。收样人、检测人、复核、审查、签发人应人人把关，各负其责，保证质量体系的有效运行。第2章 微生物检验的基本程序一、检验前准备1. 准备好所需的各种仪器2. 准备好所需的各种玻璃器皿3. 准备好所需的各种试剂、药品、培养基4. 无菌室灭菌5. 检验人员的工作衣、帽、鞋、口罩等灭菌后备用二、样品的采集 在产品的检验中，样品的采集和处理是任何检验工作中最重要的组成部分。 关系到结果的准确性和检验机关决策的正确性。 采集的样品必须具有代表性

7、，即所取的样品能够代表产品的所有成分。 样品的种类：大样：一整批样品，中样：从样品各部分取得的混合样小样（检样）:分析用的样品。微生物限度检验对象的特性：不确定性；分布的不均匀性；活体特征抽样量：指从全批产品（或全过程） 抽取的单位包装。检验量：是指检验用量，是抽样量各包装的混合样品的一部分。检验量与抽样量是两种不同的范畴的量，抽样量大于检验量。国际食品卫生规范委员会 ICMSF二级抽样（病原体）：由n、c和m组成 n是从一批被检查食品中抽取样品的数量，取样数；c是样品检测值超过指标值m的最大可接受抽样单位数，如果超过该值，则拒绝接受该批产品；m是每克样品中相关细菌的合格菌数限量，即指标值三级

8、抽样（指示菌）有一个额外的参数，附加指标值M，用于区分可接受的临界值和不可接受的值在任何一个样品中，大于或等于M的值都是不可接受的根据被检测到的微生物的浓度，三级抽样方案将食品分成三级若计数小于m，则可接受；若计数大于m，小于M ，则处于可接受的临界处若计数大于M ，则不可接受三、样品的送检（1）采集好的样品送检要及时，一般不应超过3h，否则应保持在1-5的环境中。（2）不得加入防腐剂（3）对于易死亡病原菌的样品，可采用运送培养基，如：小肠结肠炎耶氏菌、空肠弯曲菌可用Cary-Blair运送培养基（4）送检时，必须认真填写申请单，注明特殊要求以供检验人员参考。四、样品的处理 1、基本要求（1）

9、需将供试品制备成供试溶液或悬浮液。供试液的制备不得改变污染微生物的数量和种类。 （2）做多项检验（微生物、化学、药理）时：首先取出规定量的供试品供微生物学检验，其余部分做其他检验。（3）供试品收检后，应及时检验，否则，应存放在规定的储存条件下。（4）在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。（5）供试品的取样必须在净化条件下，无菌操作。（6）含有抑菌成分的供试品，消除抑菌成分的干扰。供试液制备的一般方法-液体样品：直接用吸管吸取准确用量，制成1：10的稀释液。含CO2的液体，覆盖灭菌纱布轻轻摇荡，待全部逸出后检验酸性液体用灭菌的碳酸钠调至中性后再检验有抑菌成分的样品的处理离心沉淀集菌法、树脂吸附

10、法、加入灭活剂、薄膜过滤法 第三章 各类微生物检样的制备各种蛋制品沙门氏菌增菌培养：无菌操作称取检样，接种于亚硒酸盐煌绿或煌绿肉汤增菌培养基中（有玻璃珠），摇匀后，在37温箱中培养20h。水产品采样： 现场采取水产样品时，按检验目的和水产品的种类确定采样量。别大型鱼类和海兽只能割取其局部作为样品，一般都采完整的个体，待检验时再按要求在一定部位采取检样。当对一批水产品作质量判断时，仍须采取多个个体作多件检样以反映全面质量；抑菌性供试品抑菌性药物的判定处理原则（1）对具有抑菌作用但在试验条件下不影响待检菌检出的药物，不需特殊处理（2）对具有强抗菌作用的抗生素类药品，暂不做微生物限度检查（3）对一般

11、性抑菌性供试品，在检查条件下对待检菌的检出或菌数计数产生干扰者，要消除抑菌作用。如何判定待检药物具有抑菌性？判定：国外药典一般以加有供试液和不含供试液的检样中加入定量的已知菌（50-200个/mL），经培养检查后，加入的对照菌能正常检出，加有供试液的菌落数和未加供试液的菌落数比较，后者不应超过前者的5倍及10倍，否则表明该供试品具有抑菌作用。抑菌性药物供试液的制备方法：（1）稀释法：增加稀释倍数（2）沉降法：当抑菌性成分溶解度小时（3）离心沉淀法：差速离心法（4）薄膜过滤法：5）中和法：（6）吸附法:第四章 卫生细菌学检验一、菌落总数(Total colony count) 是指1mL或1g样

12、品中所含的细菌数，主要是作为判定样品被污染程度的标志，为被检样品的卫生学评价提供依据。 我国规定：在营养琼脂培养基上，经35-37恒温培养24小时所测得的菌落个数。(colony forming units, CFU)菌落总数的多少直接反映着食品、药品和水的卫生质量。如果食品中的菌落总数多于10万个，就足以引起细菌性食物中毒；如果人的感官能察觉食品发生变质时，细菌数已达到106-107个/g（mL或cm2）。 注意事项：无菌操作、培养基的温度、梯度稀释要换管、混合均匀、计数准确（从卫生观点来看，菌落总数越多，产品质量越差，病原菌污染的可能性越大；但对于发酵制品，不能单凭菌落总数一个指标来评定产

13、品的卫生质量。） 嗜热菌计数：(引起罐装食品变质。)将检样25g加入225mL无菌水的三角瓶中，溶液或悬浮液迅速煮沸5min，将烧瓶浸于冷水内冷却。 乳酸菌、乳链球菌、双歧杆菌：(酸奶及保健制品，评价产品质量)吸取检样液体稀释液1mL于培养皿中，注入已熔化并冷却至45的溴甲酚（BCP）培养基、或改良的LAB培养基、豆芽汁培养基、改良MRS琼脂、心脑培养基等，轻轻摇匀，静置，冷凝后，35-37倒置培养72h，计数。BCP用于乳酸菌、乳链球菌， MRS琼脂用于乳酸菌，豆芽汁用于链球菌，心脑培养基用于双歧杆菌，LAB用于三种菌二、大肠菌群 (coliform group)在37度生长，能发酵乳糖，在

14、24小时内产酸产气的需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 大肠菌群作为水质粪便污染的指示菌已有90多年的历史了。适用于各种类型水的分析,当肠道病原体存在的同时大肠菌群也存在,大肠菌群比最难对付的肠道病原体存活时间更长，对外环境的抵抗力大于等于致病菌,进入水中不再繁殖。检验方法具有很强的特异性和高度敏感性。简便，易于操作、检出和计数。对人类无害，指示菌的水平与被粪便污染程度有某些直接的联系，国际上如瑞士、瑞典等国以大肠菌群作为药品、食品、饮水等的卫生指示菌。 以100mL水检样内允许含有的大肠菌群的实际数值，以最大机率数MPN来表示。1、薄膜集菌法+再做乳糖发酵试验2、多管发酵法3、COLI

15、ID检测法含有两种显色物质，可以直接识别大肠菌（coliforms）群和鉴定大肠杆菌（Escherichia coli）,而不需附加任何试剂。抑制了革兰氏阳性菌和酵母菌，菌落颜色变化的敏感性完全适合食品微生物检验。红色菌落为大肠杆菌。蓝色菌落为其它大肠菌群 菌落颜色 玫瑰红 蓝色 透明 -葡萄糖苷酶 + - - -半乳糖苷酶 + + - 大肠杆菌 其它大肠菌群 其它革兰氏阴性菌 如果大肠菌群和耐热大肠菌群均高，多为近期污染；如果大肠菌群数高，而耐热大肠菌群低，则多为远期污染。三、致病菌：对不同的产品和不同的产地，选择的参考菌群不同。食品检验时，海产品以副溶血性弧菌作为参考菌群，蛋与蛋制品以沙门

16、氏菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌等作为参考菌群，米、面以蜡样芽孢杆菌、变形杆菌、霉菌作为参考菌群，罐头食品以耐热芽孢菌作为参考菌群。药品检验时，口服药品1g或mL 不得检出大肠埃希氏菌、沙门菌；外用药品1g或mL不得检出铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌；深部组织、创伤、溃疡用药不得检出破伤风梭菌；口服药品不得检出活螨。4、霉菌及其毒素：主要对产毒霉菌进行检验。如黄曲霉、寄生曲霉等，青霉属的桔青霉五、其它指标：病毒：肝炎病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、狂犬病病毒等。 寄生虫：旋毛虫、囊尾蚴、蛔虫、肝吸虫、弓形体等。昆虫：螨、蝇、蛆、甲虫类等，携带病菌和病毒。第五章 病原菌的检验（主要的食物导致的疾病）疾病

17、致病菌潜伏期和特征相关食品沙门氏菌病鼠伤寒沙门菌（S.typhimurium）猪霍乱沙门菌（S.enteritidis）8-48h;肠毒素和细胞毒素肉类，家禽，鱼，蛋，乳制品弓形菌腹泻布氏弓形菌（Arcobacter butzleri）严重腹泻，反复抽筋肉制品,尤其是家禽弯曲杆菌病空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）2-10d, 毒素热不稳定牛奶，猪肉，家禽，水李斯特菌病单核细胞增生李斯特菌与脑膜炎和畸型有关肉制品，尤其是猪肉和牛奶大肠杆菌腹泻和结肠炎大肠杆菌24-72 h夹生的碎牛肉，生牛奶痢疾宋内志贺氏菌（Shigella sonnei）福氏志贺氏菌（S. flexne

18、ri）24-72 h蛋类，布丁耶尔森菌病小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)16-48 h,一些热稳定的毒素牛奶，肉制品贺邻单胞菌病类志贺邻单胞菌（Plesiononas shigelloides）1-2 h生的软体动物和外国旅行食品副溶血弧菌胃肠炎副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)16-48 h海鲜，贝壳类重点： 大肠埃希菌(Escherichia coli) 大肠埃希菌是肠杆菌科细菌中，从各种温血动物的肠道中检出率最高的菌种。从新生儿开始就终生存在，与人体是共栖关系，人体供给它生长条件，而这类菌的代谢产物能抑制肠道内其它分解蛋白质的细菌的生长

19、，减少蛋白质分解产物对人体的危害，并能合成VB,VK,供人体吸收利用。 是一种条件致病菌。当机体免疫力降低时，或侵入肠外组织，可引起肠道外感染，如肾炎、胆囊炎、胆结石、膀胱炎、肺炎、败血症等。 有些菌株致病性强，能直接导致肠道感染。药品、食品中有无大肠埃希菌及数量多少，可判断药品、食品是否被粪便污染及污染的程度。如果检出该菌，表明被粪便污染，且有可能污染伤寒、痢疾或其他肠道致病菌生物特性-形态与染色：是两端钝圆的革兰氏阴性短小杆菌，有时近球形无芽孢，以周身边毛运动或不运动，某些菌株具有荚膜。培养特性：最适温度37 ，可在15-46 生长，最适pH7.4-7.6。需氧或兼性厌氧。在EMB平板上，

20、典型菌落呈紫黑色，有金属光泽；在药品中分离到的菌株也有菌落呈粉色，无金属光泽，中心紫色，扁平，低度突起，光滑湿润。致病菌的菌落无色，透明或半透明。但由于药物的影响，有可能改变，应挑取多种菌落进行鉴定。生化特性：能迅速分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇等多种糖类，产酸产气。产生的丙酮酸可分解为乳酸、乙酸、甲酸。甲酸又被分解为二氧化碳和氢气。不分解尿素IMViC 反应+-4.抗原结构 菌体抗原（O抗原）：是细胞壁成分。耐热、121 不破坏，有171种血清型。 表面抗原（K抗原）：是存在于荚膜、被膜体表部分的抗原。不能被O血清所凝集，具有O不凝集性。 鞭毛抗原（H抗原）：由不耐热的蛋白质组成，60 被

21、破坏。共有56个血清型。 抗原式为：O111K58H12抵抗力：对热的抵抗力较强；在自然界中可存活数周至数月；对磺胺类、四环类等抗生素敏感对煌绿染料比沙门氏菌敏感；耐胆盐；对漂白粉、酚、醛等敏感致病力：侵袭力:K抗原、菌毛；内毒素：类脂A肠毒素：肠产毒型大肠杆菌类似于霍乱弧菌。产生两类肠毒素。均在质粒中编码。毒素类型热不稳定性肠毒素（heat-labile toxin, LT）热稳定性肠毒素（heat-stable toxin, ST）分子量30001500-5000耐热性65 30min破坏100 10-20min不破坏免疫原性有无B亚单位受体肠粘膜GM1神经节苷酯肠粘膜GM1神经节苷酯致病

22、机理刺激小肠上皮细胞的腺苷环化酶，使ATP转化成cAMP，促进肠粘膜细胞分泌，肠液大量分泌引起腹泻刺激小肠上皮细胞的鸟苷环化酶，使cGMP水平升高，促进肠粘膜细胞分泌亢进，引起腹泻兔毛细血管通透性增加无改变乳鼠灌胃试验不敏感敏感编码基因质粒质粒致病性大肠埃希菌主要分为五类： 肠产毒型（ETEC）类霍乱腹泻，但不严重 肠致病型 (EPEC)婴儿腹泻，呕吐 肠侵袭型 (EIEC)细胞-细胞间传播，类似于痢疾 肠出血型 (EHEC)：又称Vero毒素大肠埃希菌（VTEC ），O157：H 带血腹泻，出血性结肠炎，进而发生溶血性尿毒综合征（HUS），并形成血栓，血小板减少性紫癜 肠粘附型(EAEC)：

23、肠聚集型 腹泻，一些菌株会引发溶血性尿毒综合征大肠杆菌O157（COLI ID中绿色菌落为O157） 1982年在美国的一次汉堡包食物中毒事件中首次被发现。 96年在日本流行。 寄生在牛、羊等动物的肠道内以及土壤和污水中，中毒者往往都伴有剧烈的腹痛、高烧和血痢，病情严重者会危及生命。 美国威斯康星大学绘制出其完整基因组图谱。发现了1387个特有的新基因。具有一些被称为“DNA岛”的特殊片断，像岛屿一样分散在整个基因组中。其中一些“DNA岛”里包含有与致病过程有关的基因，能够控制产生毒素，或帮助O157更牢固地附着在肠胃中。2、大肠埃希菌检查法1、IMViC I靛基质试验(indol test)

24、 M甲基红试验(methyl red test)Vi乙酰甲基甲醇生成试验；C柠檬酸盐利用试验 2、硫化氢试验3、血清学试验3、MUG-Indole检查法 四、肠毒素检验：产毒培养，ELLISA第6章 GMP 中的微生物检验 GMP （good manufacturing practice ）：生产质量管理规范 空气中有大量微生物存在，种类多，分布不均匀，通常宿舍空气中含20000个/m3，街道5000个/m3 ，是传播疾病的主要媒介之一。室内空气的卫生标准夏季菌落总数小于1500个/m3 ，冬季少于4500个/m3 。溶血性链球菌和绿色链球菌夏季少于26 /m3 ，冬季少于36 /m3 。目前

25、洁净厂房已成为食品和药品生产的基本要求，测定它们的物理和微生物环境条件，已成为质量控制的组成因素。微生物常常是黏附在1020微米粒子上。因此，洁净厂房的微生物学评估是对生产环境监控的不可缺少的指标，它涉及到洁净状况，灭菌消毒状况的有效性。2、洁净环境中微生物学警告水平和行动水平的建立：许多制药厂对洁净环境微生物污染监督参数使用两个水平：一个是警告水平，一个是行动水平。两个水平是依据经验资料积累形成的。 以这两个水平条件下进行无菌生产的药品，其微生物学质量不会有任何问题，如果超过这两个规定的水平，就要判定会造成什么影响。三、模拟生产操作步骤微生物学评估 模拟生产操作步骤微生物学评估可采用培养基灌

26、封试验。必须在无菌生产批结束时立即进行，以证明批生产中无菌保证条件的状况。 培养基灌封试验经过3次模拟运转合格，该洁净室或控制环境的生产线微生物状况就算合格。一般采用大豆消化酪素肉汤培养基进行灌封试验。在20-25及30-35 ，各培养7天。洁净室最重要的污染源是人员，污染率取决于无菌操作区操作者的操作活动四、空气洁净度的检测方法1、制定采样计划和采样位置的关键因素可能与产品接触的空气和表面区域,关键区域要比非产品接触区域有较严格监督；高数量人员活动处有较严格监督,非肠道使用药瓶装置运作区域，如瓶塞碗中瓶塞的装置，药瓶灌注线上瓶子的补充，人员常规操作涉及的瓶子的消毒,建立定期的微生物学监督程序

27、：工作人员接触产品可能性大的区域，无菌产品的无菌操作过程，终端灭菌产品的定期监督2、采样频率3 洁净室采样点布置：力求均匀，避免采样点在某局部区域过于稀疏。可在关键设备或关键工作活动范围处增加测点。4设备：5、测定方法（1）浮游菌测数： 采用计数浓度法，通过收集悬浮在空气中的生物性粒子于专门的培养基经规定时间的培养，在适宜生长条件下让其繁殖到可见菌落时计数，从而判定洁净环境内单位体积空气中的活微生物数。 被测洁净室的各项状态指标必须在规定值内，且已消过毒。 无论静态和动态测试，都必须符合生产要求。(2)沉降菌测试在灵敏度方面，采用14cm直径平板达到的净化度较高。C=（D 602）/（A T）

28、C：控制区空气中细菌浓度D：沉降细菌4个平板平均数A：平板面积（cm2）1只，14cm平板=154 cm2T：平板暴露时间（小时）降低微生物的污染率 屏障：保持物料不暴露在周围环境中。吹/灌/封一体装置体系：隔离装置：防止微生物污染，保护操作人员七章快速检测技术传统计数改良法：1、螺旋平板计数法：螺旋接种仪菌落计数2、滤膜法：常用于一些可过滤样品的检测。3、纸片法：培养基固体在载体上。省去制做培养基的时间。主要用于细菌总数检测。4、其它：如Simplate即用胶,改良MPN产品。快速检测微生物数量的新方法：1、ATP法：目前产品较多，如CHARM，Biotrace, .等。2、电化学法：Sy-Lab公司Bactrac 4300，Tempo,3、颜色变化：如梅里埃的Bact/Alert和Foss的MicroFoss。4、流式细胞技术及激光扫描技术5、其它：热量法，放射测量法常见微生物检测项目：常规微生物项目：细菌总数、大肠菌群、大肠杆菌、酵母总数、霉菌总数致病微生物项目：沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7、弯曲杆菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、假单胞菌等