多肽类药物含量效价测定方法及其应用精.docx

1、多肽类药物含量效价测定方法及其应用精综述与专论2011年第35卷第12期第536页5362011，Vol35，No12Progress in Pharmaceutical Sciences 26Nomura Tetsuya ，Abe Yasuhiro ，Kamada Haruhiko ，et alNovel protein engineering strategy for creating highly re-ceptor-selective mutant TNFs J Biochem Biophys Res Commun ，2009，388（4）：667-671.27Shi C ，Lu X

2、，Ma C ，et alEnhancing the thermostability ofa novel -agarase AgaB through directed evolution J Appl Biochem Biotechnol ，2008，151（1）：51-59.28Craveiro K I ，JniorJ E G ，Silva M C M ，et alVariantCry1Ia toxins generated by DNA shuffling are active against sugarcane giant borer J J Biotechnol ，2010，145（3）

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4、hogonal tRNA-aminoacyl-tRNA syn-thetase from Archaea to function in mammalian cells J PLoS ONE ，2010，5（6）：e11263.32Ye S ，Ann Berger A ，Petzold D ，et alChemical aminoacy-lation of tRNAs with fluorinated amino acids for in vitro protein mutagenesis J Beilstein J Org Chem ，2010，6（40）：1-6.33Ugwumba I N

5、，Ozawa K ，de la Cruz L ，et al Using agenetically encoded fluorescent amino acid as a site-spe-cific probe to detect binding of low-molecular-weight com-pounds J Assay Drug Dev Technol ，2011，9（1）：50-57. 34陈莉，金由辛，王德宝tRNA 介导蛋白质工程J 生物工程进展，2001，21（1）：11-14. 接受日期2011-04-27项目资助中国药科大学大学生实践创新训练计划项目（2010年）*通讯

6、作者：胡育筑，教授；研究方向：现代仪器分析；Tel ：025-*；E-mail ：njhuyuzu126. com多肽类药物含量（效价）测定方法及其应用窦晓睿，艾小霞，高荧，潘春燕，张文婷，胡育筑*（中国药科大学分析化学教研室，江苏南京210009）摘要多肽类药物常因给药量小，浓度低且测定中易水解失活而难以准确定量，故建立灵敏、专一和准确的测定方法尤为重要。综述近年来多肽类药物含量（效价）的测定方法，包括经典化学方法、高效液相色谱法、电泳法、生物检定法及免疫标记法等在肽类物质研究中的最新应用进展。关键词多肽类药物；含量测定；效价测定中图分类号TQ 460. 72文献标志码A文章编号100150

7、94（2011）12053607The Determination Method of Content /Potencyfor PolypeptideDrugs and Their ApplicationDOU Xiao-rui，AI Xiao-xia，GAO Ying，PAN Chun-yan，ZHANG Wen-ting，HU Yu-zhu(Department of Analytical Chemistry，ChinaPharmaceutical University，Nanjing210009，ChinaAbstractThe features of polypeptide drugs

8、 which are in small dose and low concentrations and easilybecome hydrolyzed make the accurate quantification of target molecules become very difficult，thusit is important to establish a sensitive，specificand accurate determination method. The content (or potency2011，Vol35，No12537Progress in Pharmace

9、uticalSciences综述与专论2011年第35卷第12期第537页 determination methods for polypeptide drugs in recent years，includingclassical chemical method，high-performance liquid chromatography，capillaryelectrophoresis，bioassayand immunoassay were reviewed. Keywordspolypeptide drugs; content determination; potency determ

10、ination多肽类药物生物活性强，具有多种代谢和生理调节功能，且易被消化吸收，在医药领域中有着广泛的应用1。近年来，多种具有免疫调节、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压和降血脂功能的多肽类药物相继进入临床。与传统化学药物相比，多肽类药物结构特殊，且相对分子质量较大2，而且，还具有以下特点，导致在其含量的测定上存在困难：1）给药剂量小，血药浓度低，对检测方法的灵敏度和准确度要求较高；2）在酸、碱、高温条件下以及有机溶剂中易变性失活，故在进行体内药物分析时对其样品的前处理条件苛刻。本文对目前多肽类药物的含量（效价）测定方法及其应用作一综述，为多肽类药物含量测定分析方法的建立和改进提供参考。1经典化学

11、方法多肽类药物含量测定方法与某些蛋白质含量测定方法类似，目前常用的4种经典含量测定方法有定氮法、双缩脲法、福林酚试剂法和紫外分光光度法，考马斯亮蓝法则是近10年才普遍使用的新的含量测定方法。这些方法虽灵敏度不高，干扰因素多，但有一定的通用性和经济性，至今仍被用于蛋白质和多肽类药物的含量测定。1. 1凯氏定氮法凯氏定氮法是目前含氮化合物含量测定最常用的方法，其原理为：在硫酸铜的催化下，将样品用氧化性试剂消化分解而转化为硫酸铵，然后将硫酸铵溶液置蒸馏瓶中，在碱性条件下将其转化为氨，并随水蒸气馏出，用过量标准硼酸溶液吸收后，再以标准盐酸或硫酸溶液滴定，以甲基红为指示剂，根据标准酸消耗量计算出多肽的含

12、量。该法所用仪器简单，测试结果准确，重复性好，但操作费时，试剂消耗量大，含氮的非肽类物质为主要干扰杂质。1. 2双缩脲法双缩脲法的原理是利用蛋白质和多肽分子中含有肽键（CO NH ），具有双缩脲反应的特性，即在碱性溶液中，蛋白质或多肽可与Cu 2+形成在540nm 波长处有最大吸收的紫色或蓝色络合物，其颜色的深浅与蛋白质或多肽浓度成正比，从而利用比色法特异性测定蛋白质和肽类物质的含量。在样品测定时，需预先用蛋白质标准溶液制作一个标准校正曲线，通常是将牛血清蛋白水溶液作为蛋白质标准溶液。该法虽精密度好，干扰物质少，但线性范围窄，准确性和灵敏度不高，一般测试质量浓度介于1 10g L 1之间，故常

13、被用于对精确度要求不高的快速含量测定。王丹玺等3采用总蛋白试剂盒（TP ）双缩脲比色法，在540nm 波长处测定兔脑垂体注射液中多肽的含量，并做回收率对照试验，结果测得平均回收率为97. 5%（RSD =1. 6%，n =6）。1. 3福林酚试剂法福林酚试剂法是在双缩脲法的基础上发展起来的多肽含量测定方法，即在双缩脲反应体系中另加入福林酚试剂（即磷钼酸磷钨酸试剂），该试剂在碱性条件下，易被多肽中酪氨酸的酚基还原呈蓝色，显色量较双缩脲法增加，从而提高了检测的灵敏度，灵敏度为双缩脲法的100倍。福林酚试剂法的蛋白质定量范围为25 250g ，测得结果准确、可靠，易操作，较凯氏定氮法、双缩脲法和考马

14、斯亮蓝法更适用于寡肽的含量测定4-5。张海松等6在研究一种国家一类新药注射用心肌肽的含量测定方法时发现，双缩脲法和凯氏定氮法均存在灵敏度、重复性不理想，而且测定所需时间过长不利于投料生产等问题；而福林酚试剂法则具有快速、灵敏度高、测定供试品量较多等优点，在实际生产中特别是在配料后测定含量以确定分装体积时更具优势。福林酚试剂法的缺点是易受多肽特异性的影响，即不同多肽类药物因酪氨酸和色氨酸含量的不同而使显色强度稍有不同，标准曲线也不是严格的直线形式。Peterson 法则对该法进行了改良，进一步提高了检测的灵敏度。孙雪奇等7采用Peterson 法测定了视明注射液中微量多肽的含量，结果显示多肽含量

15、在0. 98 15. 68g 内呈良好线性关系（r =0. 9997），表明该法适于微量蛋白质或多肽的含量测定。综述与专论2011年第35卷第12期第538页5382011，Vol35，No12Progress in Pharmaceutical Sciences 1. 4紫外分光光度法紫外分光光度法适用于分子中含有芳香族氨基酸（如苯丙氨酸、酪氨酸和组氨酸等）的多肽的定量分析，对不含芳香族氨基酸的肽的测定则灵敏度较低，原因在于前者在280nm 处有最大吸收峰，且在此波长处的吸光值与蛋白浓度成正比。该法操作简便、迅速，样品可回收，但因所用有机溶剂（如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类化合物及过氧化物

16、等）易与多肽类药物产生相互作用，使药物共轭体系发生变化，从而影响其最大吸收峰，对测定造成干扰。尹翠娟等8采用紫外分光光度法对谷胱甘肽（GSH ）片的含量进行测定，检测波长为230nm ，经多次试验证实，GSH 在不同的溶剂和pH 溶液中产生的最大吸收峰不同，当溶剂为0. 1mol L 1NaOH 溶液时，能消除某些干扰，得到稳定的结果，且回收率较好，平均回收率为100. 5%（RSD =1. 18%，n =5）。1. 5考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法由Bradford 于1976年首次提出，其用于多肽含量测定具有以下优点：1）灵敏度高，定量限为1g 左右；2）测定快速、简便，只需加一种试剂，5min

17、 左右即可完成一个样品的测定；3）干扰物质少。该法可用于含碱性氨基酸的肽的含量测定，如付英杰等9采用该法测定阿胶低肽含量，准确度高（RSD =0. 57%，n =5）、重复性好（RSD =0. 61%，n =5）。但因考马斯亮蓝G-250不与单体精氨酸、赖氨酸以及相对分子质量小于3000的多肽结合，故并不能适用于所有肽类物质的定量测定。2色谱分析方法多肽类物质不具有挥发性，且受热后空间结构易发生变化，生物活性也因而受到影响，故其含量测定不宜采用气相色谱法。由于多肽类物质极性较大，在用经典液相色谱法测定其含量时，易出现拖尾，且保留时间过长，因此，若采用色谱方法测定多肽类药物含量，多以反相高效液相

18、色谱法（RP-HPLC ）为主。另外，电泳法也能被用于多肽类药物的含量测定。2. 1反相高效液相色谱法RP-HPLC 法是多肽类药物含量测定中应用最为广泛的分析技术，表1中列举了几个实例。用RP-HPLC 法测定多肽类物质含量时的常用检测器有紫外（UV ）检测器、蒸发光散射检测器（ELSD ）和质谱（MS ）检测器等。表1反相高效液相色谱法测定多肽类药物含量Table 1RP-HPLC method for determining the content of the polypeptide drugs药物名称待测物质色谱柱流动相流速/mLmin 1检测波长/nm参考文献普罗瑞林拟甲状腺素OD

19、S 柱（250mm 4. 0mm ，5m ）A ：乙腈四乙铵溶液（5 95）；B ：乙腈四乙铵溶液（15 85），梯度洗脱a1. 021010胸腺肽1胸腺肽1Agilent 1100C 18柱（150mm 4. 6mm ，5m ）A ：乙腈水（10 90）；B ：乙腈水（50 50），梯度洗脱b1. 021011酪丝亮肽PLA/PLGA 微球酪丝亮肽Diamonsil C 18柱（250mm 4. 6mm ，5m ）0. 02mol L 1磷酸二氢钾甲醇乙腈（75 15 10）1. 022012依替巴肽注射液依替巴肽AichromBond-AQ C 18柱（250mm 4. 6mm ，5m ）

20、A ：乙腈；B ：水（含0. 13%三氟乙酸），梯度洗脱c1. 022013聚普瑞锌颗粒L-肌肽ODS 柱（250mm 4. 6mm ，5m ）硫代硫酸钠缓冲液乙腈（77 23，磷酸调节pH 至3. 0）1. 021514LHRH 拮抗剂-CMC 复合物复合物中的多肽Venusil ASB-C 18柱（250mm 4. 6mm ，5m ）0. 5%磷酸二氢钠乙腈（67 33，含0. 5%三乙胺，0. 1%三氟乙酸，磷酸调节pH 至4. 0）1. 021415a ：0 30min ，流动相A 74%41%；30 35min ，流动相A 41%74%；35 50min ，流动相A 维持74%。b

21、：0 18min ，流动相A 98%92%。c ：0 15min ，流动相A 15%25%；15 15. 1min ，流动相A 25%15%；15. 1 25min ，流动相A 维持15%。UV 检测器对样品的挥发性和热稳定性没有太大限制，是检测多肽类物质最常用的检测器，但由于其对温度和流动相流量波动不敏感，故常需采用梯度洗脱，且需保证流动相预处理和梯度的恰当，避免2011，Vol35，No12539Progress in PharmaceuticalSciences综述与专论2011年第35卷第12期第539页 出现基线漂移和杂质峰，方能获得更好的分离效果16。在用UV 检测器进行测定时，流

22、动相在相关检测波长下必须无紫外吸收，这一特性在一定程度上限制了某些溶剂的使用。HPLC-ELSD 法具有通用性、响应因子的一致性以及与梯度洗脱的良好相容性等优点，在药物分析中得到广泛的应用17。林志兴等18在采用HPLC-ELSD 法测定GSH 含量时发现，GSH 浓度的自然对数与峰面积的自然对数呈良好的线性关系（R 2=0. 9995），精密度为2. 15%，最低检测限达30. 73mg L 1，表明该法可快速、简便、准确地从复杂体系中检测出GSH 含量，且无使用UV 检测器时易受其他杂质干扰而不能快速、准确测定的问题。然而，ELSD 检测限多在纳克级，其灵敏度仍不够理想，不能用于痕量物质的

23、检测，且在数据处理上也存在一些问题。HPLC-MS 联用可体现色谱与MS 的优势互补，即将HPLC 对复杂样品的高分离能力与MS 高选择性和高灵敏度相结合，近年来已被广泛用于肽类物质的含量测定。例如，周天洋等19采用HPLC-MS 法检测兔眼晶状体内肌肽浓度，色谱柱为WatersXterraMS C 18柱（310mm 150mm ，315m ），流动相为0. 2%甲酸溶液（甲酸、乙腈及水的体积比为0. 2 9 100）-乙腈（65 35），流速为0. 2mL min 1，柱温为25 ，进样量为2L 。结果显示：肌肽在2. 8min 内出峰，其线性范围为0. 0407 9. 9mg L 1，方

24、法回收率为80% 120%。该法专属性强、准确度高、重复性好，可快速准确地测定晶状体中肌肽浓度。此外，还有人将氨基酸分析法与RP-HPLC 法合用于多肽类药物的含量测定，即先将多肽类药物水解成单个氨基酸，再通过柱前衍生化生成氨基酸衍生物，经RP-HPLC 分离后采用紫外或荧光检测器测定氨基酸含量。如邓峰等20采用Waters AccQ-Tag 氨基酸衍生试剂对脑蛋白水解物注射液样品进行柱前衍生化，然后使用Krom asil 100-5C 18柱（250mm 4. 6mm ，5m ）进行液相色谱分析，测定其肽含量。其间，以内标法计算各氨基酸含量的总和，将水解后游离氨基酸总量扣除水解前氨基酸总量即

25、得肽含量。结果显示：氨基酸标准品溶液浓度与峰面积呈良好线性关系（r =0. 9997 0. 9999，n =6），样品中肽的平均回收率为101. 0%（n =9）。此法可排除多肽类药物中氨基酸的干扰，使药品中肽含量测定结果更为准确。2. 2毛细管电泳法毛细管电泳（CE ）法是分离分析多肽类药物的重要方法21，具有快速、高效、分辨率高、重复性好和可自动化等优点，常被作为HPLC 法的补充，用于处理进样量较少的样品。CE 法的常用检测器包括UV 检测器、电化学检测器、荧光检测器和MS 检测器。UV-可见分光光度法是CE 法中应用最广泛的一种检测方法，缺点主要是因光程短所致灵敏度低（通常为105 1

26、06mol L 1）。多肽类药物在一定的化学环境下具有电化学活性，故可采用电化学检测法对其进行含量测定。用电化学检测可避免使用光学类检测器存在的光程短的问题，对电化学活性组分具有检测灵敏度高、线性范围宽、选择性好及费用低廉等特点。黄颖等22建立了CE-安培检测法，测定盐酸去氧肾上腺素、重酒石酸羟胺和盐酸异丙肾上腺素等3种拟肾上腺素药物的含量，结果显示：该法对各药物的检测限分别为0. 8、0. 8和1. 0mol L 1，并能在18min 内达到基线分离，药物浓度在2 100mol L 1范围内与峰面积呈良好的线性关系（r 0. 9991）。荧光检测是CE 法中常见的“在柱”检测方法，灵敏度高，

27、特别是在采用激光诱导荧光（LIF ）检测技术时，灵敏度可达10121016mol L 1，是目前CE 法中灵敏度最高的23，可用于检测DNA （检测限低至20pg ）24、氨基酸等生物样品，在测定多肽类药物含量时也有很大优势。然而，荧光检测器的价格较高，且只能用于有天然荧光或易于用荧光试剂标记或染色的物质的检测，因此有一定的局限性，只有当找出能使多数测定物质被标记或染色的荧光试剂后，其应用范围才能进一步扩大。CE-MS 联用技术集CE 的高效分离能力、广泛的样品适应性与MS 的高灵敏度、可提供结构信息等特性为一体，已发展成为一种重要的分离分析手段，并成功应用于肽链测序及蛋白结构和相对分子质量的

28、测定25。近年来，将样品进样、分离、检测等过程合为一体的集成毛细管电泳芯片技术也蓬勃发展，与传统的CE 法相比，其优势在于具有良好的散热性能和设计多样性。综述与专论2011年第35卷第12期第540页5402011，Vol35，No12Progress in Pharmaceutical Sciences 3生物分析方法多肽类药物对热、酸、碱、重金属以及pH 值的变化均较敏感，各种理化环境因素的变化易对其生物活性产生影响。因此，除了用仪器和化学的方法对多肽进行含量测定外，还可根据药物的特殊生理效应或专一的生化反应拟定其专属的生物效价测定方法，以表征其所含生物活性成分的含量。常用的多肽类药物效价

29、测定方法有生物检定法和免疫标记法。3. 1生物检定法用生物检定法对多肽进行定量是利用被测多肽类药物的某种特异生物反应，通过剂量（或浓度）效应曲线判定样品中多肽的含量（结果的单位以效价计）。多肽类药物效价的测定分为体内和体外测定法。体内法是测定多肽类药物在整体动物中引起的特异生物学反应的强度，而体外法则是测定多肽类药物在离体组织中引起的生物学反应强度，如催产素效价的体外测定是通过测定样品所造成大鼠离体子宫收缩的强度来判定。张海涛等26通过建立去垂体大鼠动物模型，采用经典体内生物检定法体重法和胫骨法，测定了重组人生长激素（rhGH ）的生物效价。其间，共设rhGH 国际标准品高、低浓度组，国家标准

30、品高、低浓度组及供试品高、低浓度组（高、低浓度分别为0. 2和0. 05IUmL 1）；给每组供试大鼠连续6d 颈部皮下注射相应的rhGH 溶液，每次0. 5mL （bid ），于最后1次给药后16h 处死大鼠，计算大鼠自给药起体重的增长值W ；并用硝酸银染色法测量胫骨髓软骨带宽度，以W 及软骨带宽度为反应值，按平行线原理计算国家标准品和供试品的效价、平均可信限率（ARFL ）及精密度指数（）。结果显示：体重法测得rhGH 国家标准品和供试品的效价分别为每安瓿2. 8453和4. 1567IU ，ARFL 分别为48. 18%和42. 36%，分别为0. 2028和0. 1802；胫骨法测得rhGH 国家标准品和供试品效价分别为每安瓿2. 8596和4. 3015IU ，ARFL 分别为45. 17%和40. 78%，分别为0. 1918和0. 1738。取和ARFL 值较小的为最后结果，可见生物检定法中胫骨法较体重法更灵敏、准确。黄新刚等27采用体内法测定了低分子甲壳铵修饰胰岛素的生物效价，结果显示：该胰岛素质量浓度在0. 31 3. 0gL 1范围内与峰面积线性关系良好（=0. 9999），可信限率（F