海洋真菌HN164A菌株次级代谢产物的研究.docx

1、海洋真菌HN164A菌株次级代谢产物的研究摘要海洋微生物是一种产生药用活性代谢产物非常重要的资源，海洋真菌作为海洋微生物的一个重要成员，有着巨大的潜力开发。海洋真菌已显示出能够产生多种多样的新颖的活性代谢产物的能力。因此，进行这方面的研究具有广阔的前景。由于海洋环境的特殊性，赋予生活在海洋中的真菌在生理性状和遗传背景上以特殊性，因此海洋真菌必定能产生结构新颖的代谢物质。随着从海洋真菌代谢产物中发现大量结构独特、骨架新颖、活性显著的化合物，海洋真菌次级代谢产物的研究已成为国内外研究的热点。本论文阐述了海洋真菌的研究背景和意义，介绍了海洋真菌代谢产物及其活性的研究进展，主要为近十年文献报道的来源于

2、海洋真菌的新化合物以及相关的生物活性。对海洋真菌HN16-4A次级代谢产物进行初步的研究。通过人工发酵培养，运用色谱方法从其代谢产物中分离得到了大量的麦角甾醇化合物。关键词：海洋真菌，次级代谢产物，结构鉴定，生物活性AbstractMarine microorganisms have become an important source of pharmacologically active metabolite. Marine-derived fungus was one of the important members, and it was value to exploit potenc

3、e. Marine-derived fungus could produce numerous novel and bioactive compounds, so it has an expansive foreground to study.Because of the particularity of marine environment, the physical properties of fungal and genetic background of marine-derived fungus. To be special, fungus can produce new super

4、session material. Numerous unique and novel compounds were isolated from marine-derived fungi, and the studies of secondary metabolites from marine-derived fungi became popular in the world in recent years.The background and significance of the studies on marine fungi, and the study process of the b

5、ioactivity metabolites from marine fungi in the past decade were described in this dissertation. Study on the secondary metabolites of the marine fungus HN16-4A collected from the South China Sea was carried out. Compound ergosterol was isolated from the culture of the fungus through chromatographic

6、 separation.Key words: marine-derived fungus, secondary metabolite, structural elucidation目录1 绪论 11.1 海洋微生物研究的背景及意义 11.2 海洋真菌次级代谢产物研究进展 21.2.1 海洋真菌 21.2.2 海洋真菌次级代谢产物研究 41.3 海洋真菌次级代谢产物化学成分研究 51.3.1 醌类化合物 51.3.2 生物碱类化合物 61.3.3 萜类化合物 71.3.4 肽类化合物 81.3.5 酮类化合物 81.3.6 甾体类化合物 91.3.7 内酯类化合物 91.3.8 其他化合物 10

7、1.4 海洋真菌次级代谢产物生物活性研究 101.4.1 抗菌作用 101.4.2 抗肿瘤作用 111.4.3 酶抑制剂 121.4.4 其他活性作用 132 海洋真菌HN16-4A次级代谢产物进行初步的研究 142.1 研究简介 142.2 试剂与实验仪器 142.2.1 试剂 142.2.2 实验仪器 152.3 菌种与菌种保存 152.4 菌株的培养 152.5 提取与分离 162.4 化合物麦角甾醇的分离与纯化 163 实验结果与讨论 18参考文献 20致谢 221 绪论1.1 海洋微生物研究的背景及意义天然产物由于其结构的多样性和生物活性的多样性，在新药和先导化合物的发现中起着非常重

8、要的作用。据报道，在19812002年间注册的877种小分子新化学实体药物中，来源于天然产物的占6l。其中6直接来源于天然产物，27为天然产物的衍生物，5来源于天然产物药效团的合成物，23是根据天然产物结构进行模拟设计的合成物1 。人类对天然产物药物的研究一直集中在陆生生物资源，现有的天然产物药物大多数来自于陆生生物。目前对陆生生物的研究已经取得了丰硕的成果，至少有数百种具有抗菌性、抗肿瘤性、作用于心脏和作用于神经活动的临床上有效的药物是从陆生生物代谢产物中分离得到或和其密切相关的。而以青霉素的发现为代表的辉煌的抗生素时代的到来，更让整个世界把目光集中到陆地微生物上，人们期望能从中发现更多更好

9、的特效药或专属性药物。然而，由于对陆生生物资源的长期研究开发，从中发现结构新颖、功能独特的活性代谢产物的几率越来越低，因此人们开始从海洋生物中寻找新的活性代谢产物。海洋微生物是海洋生态系统中的重要组成部分，它们在海洋生境中所处的独特地位，以及具有可通过发酵进行大量生产等优点使得它们的次级代谢产物成为天然产物研究中一个引人注目的焦点。海洋是生命的起源地，占地球表面积的70，生物量约为地球生物总量的87，生物种类20多万种，是地球上最大的资源能源宝库。海洋环境具有高压、低营养、低温(特别是深海)、无光照以及局部高温、高盐等所谓生命极限环境。海底特别是深海海底是一个特殊的世界，这里有极高的静压力(每

10、增加10米深度，静压力约增加1个大气压)，多数地方极冷(13)，在少数热涌泉处却极(200400)，还有高盐、高pH值和高浓度重金属离子区域存在。陆地所不具有的极端海洋环境，使适应了这种环境的海洋微生物产生陆生微生物所不具有的代谢机制，从而产生了很多结构新颖的代谢产物。新颖的代谢产物。这些产物从结构上可分为萜类、甾醇类、生物碱类、苷类、多糖、肽类、核酸、蛋白质、酶类等，几乎涵盖了各大类化合物;海洋环境的多样性造成了海洋微生物在物种、基因组成和生态功能上的呈现较高的多样性。这种生态多样性和物种多样性正是形成天然药物资源化学多样性的基础。目前，国内外寻找海洋药物的研究对象主要是海藻和海洋动物。据报

11、道，到目前为止己成功地分离到3000多种具有生物活性的海洋天然产物，但由于其含量较低，生物量有限，分离提取的生产成本较高，使得许多研究成果的应用推广受到限制。因此，目前人们把注意力转向海洋微生物的培养与发酵及其代谢产物的研究上。利用海洋动植物的共附生微生物来获得从这些海洋动植物中分离的活性物质，可以解决海洋动植物原料短缺的限制。因为海洋微生物具有微生物本身的特点，容易培养，生长周期短，易于通过育种提高目的物的产量，所以可用发酵的方式进行大规模培养附生微生物，工业化生产海洋生物活代谢产物。因此开发海洋微生物对生态环境保护和经济可持续发展都十分重要，是一个尚待深入开发的巨大药物资源。1.2 海洋真

12、菌次级代谢产物研究进展1.2.1 海洋真菌海洋真菌2的定义在不同的文献报道中有所不同，而被广泛接受的定义是Kohlmeyer提出的。该学者把海洋真菌分为专性海洋真菌和兼性海洋真菌，专性海洋真菌是指那些只能在海洋或河口地区生长和产孢的真菌；兼性海洋真菌是指那些来自淡水或陆地环境，也能在海洋环境中生长或产孢的真菌。因而，海洋真菌不是一个分类单位，而是根据生态和生理特性定义的一个类群。它们常常营腐生、共生或寄生生活。现已发现的海洋真菌中高等真菌主要包括担子菌纲(Basidiomycota)、子囊菌纲(Ascomycota)、半知菌类(Deuteromycetes)等，较低等真菌包括壶菌亚纲(Chyt

13、rldiomycot)和接合茵亚纲(Zygomycota)等。到2000年止，被描述过的高等海洋真菌有444种，其中177属360种为子囊菌，占高等海洋真菌总种数的81；7属10种为担子菌，51属74种为半知菌。海洋真菌的分布非常广泛，从潮间带高潮线或河口到深海，从浅海沙滩到深海沉积物中，均有其成员。海洋酵母菌和低等真菌附生于浮游生物和动物体上，因而在大洋中也有分布。高等海洋真菌的生长要求适宜的基物作为栖生场所，因此多集中分布在沿岸海域。由于海洋真菌营腐生或寄生生活，所以其地理分布的特点是取决于寄主的地理分布范围。但海水中溶解的氧的浓度和海水水温，也是影响海洋真菌存在和发展的重要因子。几乎所有

14、真菌都可在海水中氯化钠浓度的条件下生长，因此耐盐性不能作为区分海洋真菌与陆地真菌的标志。按照水深的不同，海洋真菌的分布从上到下可被分为几个垂直带：（1）由海面到 200m 深处为第一带，目前报道的真菌大多分离自这一带；（2）200m2000m 为第二带；（3）2000m4000m 为第三带；（4）4000m6000m 为第四带；（5）6000m 以下为第五带。根据海洋真菌的栖生习性可划分为如下几种生态类型。1、木生真菌海洋木生真菌是一类数量最多，分布最广的高等海洋真菌。它能强烈地分解木材和其他纤维物质。能腐烂港口设施防波堤及堰堤中的木质结构和其他纤维材料。它们在热带海域的分布较温带和极地广泛，

15、在浅海环境的分布较深海广泛。在已知的107种海洋木生真菌中，子囊菌类占76种，半知菌类占29种，担子菌类只有2种。2、寄生藻体真菌在海洋真菌中，约有13的种与藻类有联系，其中以子囊菌类居多。有腐生、寄生和共生等类型。不同海藻的分布可直接影响该类真菌的分布，如在北大西洋的马尾藻海中，真菌的种类和数量都很少，也极少发现被真菌侵染的海藻，这是由于马尾藻具有抗菌作用的单宁酸物质。一般说，腐烂海藻上酵母菌的数量要高于活藻体上和海水中的数量;附在红藻和绿藻上的酵母菌数量，要高于褐藻上的。因为褐藻分泌的酚类物质能抑制海洋真菌的生长。一些海洋真菌与特定海藻结合形成专性共生的结合体，即为海洋地衣。3、红树林真菌

16、外海水域营养缺乏(nutrienideficieni)，但是近岸水域尤其是红树林地区有充分的植物材料供真菌繁殖。红树是热带亚热带潮间带盐泽地的植物，红树林地区是典型的稍咸的(brackish)水域带，水的温度和盐度均变化较大。而外海盐度大约3.5，尤其是在季风季节，红树林地区的盐度能够低于0.5，真菌必须依靠降解有机物，浮游藻类和浮游生物作为它的营养。它需要特定的温度和盐度。红树林能够提供这些条件，因此是海洋真菌丰富的来源，栖生在红树林的海洋真菌多半是腐生菌。其中子囊菌和半知菌居大多数。浸在海水中的红树躯干、枝条和根部的表皮被穿孔的动物、风浪或人为损伤后，极易被真菌侵入而造成腐烂。但埋在泥中的

17、根部、则不易受真菌侵害。海洋真菌能分解红树叶片，为海洋提供大量的有机物碎屑。4、海草真菌海草真菌的数量较少，其中栖居叶部的真菌较栖根部者为多。海草根中含有单宁酸和其他抑制生物生长的物质，只有那些能抵御这类物质的海洋真菌才能在海草根上适应生长。据报道，这些也能引起海草的病害，如北大西洋、太平洋沿岸和欧洲的海草曾被网黏菌属真菌严重侵染。5、寄生动物体真菌在海洋生态系统中，微生物与其他生物之间也存在着抗生、互生、共生和寄生的各种复杂局面。海洋真菌是某些海洋动物的寄生菌。一般来说，海洋真菌只局限于寄生在外骨骼、壳等处。海洋真菌在分解动物体中的纤维素、甲壳素、蛋白质和碳酸钙等过程中起重要作用。低等海洋真

18、菌是引起海洋鱼类和无脊椎动物病害的重要致病菌。如美国牡砺生产区曾因真菌的侵害遭受严重损失。如镰刀菌能引起对虾的黑鳃病，链壶菌(Lagenidium)常侵入甲壳类动物的幼体进行寄生。 1.2.2 海洋真菌次级代谢产物研究概况海洋真菌是海洋微生物的重要组成类型，与细菌相比，真菌相对高等，代谢能力强，生命活动复杂，并且与海洋中动植物有着非常复杂的生态关系，因为其次级代谢产物量大、生物活性物质种类丰富尤为引人注目。早在1945年，Gzuseppe Brotzu从撤丁岛污水出口采集的海水样品中分离到一株真菌(头孢支顶孢属)具有抗菌活性，这一发现导致了头孢菌素C的诞生。1976年从颗粒霉素中分离出环孢霉素

19、A并在1983年用于临床免疫抑制，对真菌的研究才开始兴起，但是在19701990年，有关海洋真菌的研究报道很少，1990年以后，海洋真菌的研究才开始兴旺起来，每年有关报道呈指数增长3。与细菌相比真菌相对高等，代谢能力强，生命活动更复杂，孕育着无穷无尽的新型代谢产物。海洋真菌代表了海洋中数量极其庞大的一类生物，由于不含叶绿素，不能像高等植物那样进行光合作用，能本身合成营养物质。也不像动物具有吞噬食物的器官，而是通过特异性的胞外酶将海洋中的有机底物分解为较小的分子，这些底物包括纤维素、木质和海藻等，同时其本身也是别的海洋生物的食物，因此海洋真菌对海洋中的物质和能量循环贡献极大。为了在充满竞争的海洋

20、环境中生存下去，海洋真菌不得不依靠其产生的次级代谢产物为竞争的武器，与其他海洋生物与其他海洋生物的次级代谢产物相比，很多已知的海洋真菌次级代谢产物的分子结构相对较小，且多具有抗细菌、抗真菌和细胞毒性，这些化合物的性质非常典型地代表了海洋微生物的化学防御机制。目前，已从各种海洋生物中分离到15,000多种海洋天然产物，新发现的化合物以平均每4年增加50的速度递增；在已发现的化合物中，近12具有各种生物活性；结构新颖独特，活性显著的化合物超过0.1，主要包括萜类、生物碱、聚酮化合物、小分子多肽、莽草酸衍生物、多糖、类固醇等；主要药理作用包括抗肿瘤、防治心脑血管疾病、抗艾滋病、抗菌、抗病毒、延缓衰老

21、及免疫调节功能等。除了头孢菌素作为抗菌药、阿糖胞苷作为抗癌药、vidarabine作为抗病毒药已经上市外，目前处于临床研究和临床前研究阶段的海洋天然产物多为抗癌药物。到2000年，从海洋微生物分离出来并鉴定的物质有258种，79种(31)有一定的生物活性，其中有47种具生物活性的物质是由海洋细菌产生的，有32种生物活性物质来自海洋真菌，对于海洋真菌来说有62活性物质分离自海绵真菌，22分离自海藻真菌。16分离白海泥真菌 。而到2002年从海洋微生物中分离出来的生物活性物质至少有129种 。随着新菌体的发现和描述，数量在不断增大。不少科研结果统计证明：从海洋真菌分离出的次级代谢产物7080具有生

22、物活性4。1.3 海洋真菌次级代谢产物化学成分研究1.3.1 醌类化合物5醌类化合物是指分子内具有不饱和环二酮结构或容易转变成这样结构的天然有机化合物，天然酮类化合物主要有苯醌、萘醌、菲醌和蒽醌。海洋来源的酮醌化合物大多有抗癌活性。GBringmann等人研究了从意大利厄尔巴岛海绵Haliclona valliculata中分离出来的真菌Emericella variecolor(1)，采用 ASW 液体培养基培养2周，用乙酸乙酯萃取发酵液。萃取物经高效液相(C18柱，水：乙腈2560梯度洗脱)，得到一个新的蒽醌evariquinone，重结晶为橙色针状晶体。该化合物也可从陆生真菌中获得，在浓

23、度为3.16 mg.mL-1时对口腔表皮样癌细胞KB和肺癌细胞NCL-H460均有抑制活性，抑制率分别为60、69。HWei等人从来自日本三重县Gokasyo海海底沉积物的真菌Emericella variecolor GFl0的发酵液中，分离得到新化合物6-epi-ophiobolin N(2)。该化合物显示出对成神经细胞瘤细胞株Neuro 2A的细胞毒性。 1 2化合物(34)是从海洋来源的真菌penicillilum terrestre代谢产物中分离得到的新的苯醌衍生物，对P388和A-549细胞株具有细胞毒活性。对P388细胞株的IC50值分别为15.7和10.5M，对A-549的IC

24、50值分别为5.3和7.6M。从香港内生真菌Halorosellinia sp.的培养液里分离出两个蒽醌类化合物（56）。 3 4 5 61.3.2 生物碱类化合物6Citrinadin A(7)和citrinadin B(8)是从来自海洋红藻Actlnotrichia fragilis的真菌Penicillium citrinum中分离到的两个五环吲哚生物碱，它们在C-7位具有罕见的吲哚环。Citrinadln B对鼠白血病L1210细胞有细胞毒活性，IC50为10gmL。 7 8从中国青岛胶州湾的真菌Penicillium aurantiogriseum的培养液中分离出生物碱auranti

25、omidesA-C（910），对肿瘤细胞有中等程度的毒性。 9 101.3.3 萜类化合物7Oh等将1mL的海洋细菌CNJ-328培养物加入到培养3d的海洋真菌CNL-523培养基中，继续培养不到24 h，通过LCMS检测发现培养物中出现4个新峰，经化学分离和结构鉴定，这4个新峰为新的二萜类化合物libertellenone A(11)，libertellenone B(12)，libertellenone C(13)和libenellenone D(14)。Libertellenone D具有强的细胞毒活性，对癌细胞株HCT-116的IC50为0.76M；libertellenones A-

26、C具有较弱的细胞毒活性，IC50分别为15M，15M和53M。 11 12 13 14海洋真菌Drechslera dematioidea来自海洋红藻Liagora，从其固体代谢产物中分离得到10个新倍半萜化合物。其中DrechsIerine D(15)和DrechsIerine F(16)能抑Plasmodium flaciparum的生长，IC505.1gmL。 15 161.3.4 肽类化合物8Trichodermamide B(17)是从海洋绿藻Halimeda的真菌Trichoderma virens(CNK266)中分离得到的二肽，具有显著的细胞毒作用，对HCT-116的IC50为

27、0.32gmL，同时还有一定的抗菌活性。从Mechercharimyces asporrophorigenens的菌丝体的培养液中分离得到了ukthapelstatin A（18），一种新的含硫环肽化合物。活性测试证明它对肿瘤细胞，尤其是肺癌和卵巢癌细胞有着很强的抑制活性。 17 18从菌种Microsporum cf.gypseum的培养液里分离出两个环四肽Microsporins A （19）和 B（20），它们对HDAC有很强的抑制作用，对HCT-116细胞和NCI 60癌细胞有细胞毒性。 19 201.3.5 酮类化合物9Bugni等从海藻Dictyosphaeria versluyi

28、i中分离到一株真菌Penicillium sp. ，从其代谢产物中分离到两个新的聚酮类化合物dictyosphaenc acid A（21）和dictyosphaeric acid B（22），这两个化合物具有罕见的十元环内酯结构，目前仅有两个具有相同碳骨架的化合物见报道。其中dlctyosphaeric acid A具有抗革兰氏阳性菌活性。当以50g孔试验时，对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌和耐万古霉素粪肠球菌的抑菌圈分别为11 mm和7mm。 21 222001年，Lin等从红树林真菌Xylaria sp. 的代谢产物中得到5个结构独特的新聚酮类化合物xyIoketals A-E，xyloke

29、tals A-D（2326）在体外对Ach E活性均有不同程度的抑制作用。 23 24 25 26 1.3.6 甾体类化合物10从非洲西太平洋巴布亚岛的Axinella sp. 中分离到真菌Penicillium citrinum，以盐水作培养液进行发酵，其提取物分离到三个甾体化合物isocyclocitrinol A（27），22-acetylisoeycloeitrinol（28）。从日本（Osaka Bay）的菌种Gymnacella dankaliensis分离出甾醇类化合物dankasterone B，gymnasterones C 和 D（2930），所有的这些化合物对P388有重

30、要的抑制作用。 27 28 29 301.3.7 内酯类化合物11Isaka等对红树林真菌Aigialus parvus BCC 5311进行了研究，从中得到5个新间二羟苯基大环内酯Aigialomycins A-E和一个已知化合物hypothemycin，其中hypothemycin（31）和aigialomycin D（32）表现出体外抗疟疾活性，对Plasmodium flaciparum K1的IC50分别为2.2mL和6.6mL。从来自褐藻Sargassum ringgoldianum的真菌Penicillium waksmanii中分离到两个新内酯pyrenocine D(33)和

31、pyrenocine E(34)。 31 32 33 341.3.7 其他化合物12-13Tropolaetones A-D是从夏威夷海洋真菌Aspergillus sp. CNK-371代谢产物中分离到的混源萜类化合物，Tropolaetones A-C对人体克隆腺癌细胞HCT-16有微弱的细胞毒性，其IC50 值分别为13.2、10.9和13.9gmL。日本海湾沉淀物曲霉菌Aspergillus candidus的培养液里分离出三种三联苯曲霉素（3536），它们对人类的表皮癌细胞KB(KB3-1)有细胞毒性。从大西洋东赤道真菌Marinobacter sp.的培养液中分离出Marinoba

32、ctin F 40（37），它的结构非常特殊。 35 36 37Dehydroxychlorofusarielin B 是从海洋真菌Aspergillus sp. 发酵液中分离到的具有抗菌活性的新含氧聚乙烯十氢化萘衍生物。对金黄色葡萄球菌及其耐青霉素和具有多重耐药性的菌株均有抑制生长的活性，其MIC值都为62.5gmL。1.4 海洋真菌次级代谢产物的生物活性研究1.4.1 抗菌作用14目前已发现的具有产生理活性物质的海洋真菌有曲霉(Aspergillus)、青霉(Penicillium)、海壳霉(Corollospora)、长蠕孢属(Helminthosporium)、茎点霉(Phoma)、光黑壳属(P