0420 纤维素和半纤维素酶活性质的研究.docx

1、0420 纤维素和半纤维素酶活性质的研究纤维素和半纤维素酶活性质的研究学院名称： 化学与生物工程学院 专业名称： 生物工程 年 级： 2012级 姓 名： 田传玲 指导教师： 王瑞君 副教授 2016年5月纤维素和半纤维素酶活性质的研究摘 要:微生物产生的纤维素酶和半纤维素酶在降解纤维素方面具有广泛的应用前景。本研究通过提取从泥土和烂白菜心中富集分离能够降解纤维素微生物细菌的粗酶液，分别研究不同pH、金属离子种类和浓度、底物和温度条件下的酶活性变化规律，从而确定纤维素酶和半纤维素酶的酶活性质。结果表明，本研究条件下，粗酶液酶活性最适pH为5.0，pH在5.06.0范围内酶活稳定性较高，耐受范围

2、相对较窄；不同底物对酶活性的影响不同，其中以羧甲基纤维素钠效果最好；金属离子Fe2+、Mn2+、Cu2+和Mg2+及其不同浓度条件下，纤维素酶活性的变化不同。Fe2+、Mn2+和Mg2+可以提高酶活性，其中Mn2+的激活效果最好，其最适浓度为4.0 mmol/L；而Cu2+对酶活具有抑制作用。不同温度条件下粗酶液活性不同， 4560 温度范围内活性较高，最适温度为55 ，温度耐受范围较大。本研究可以为纤维素和半纤维素降解菌产纤维素酶及其酶促反应条件的优化提供理论依据。关键词: 纤维素; 半纤维素; 纤维素酶; 酶活性质The culture medium optimization of hem

3、icellulose degradation bacteriaAbstract: Cellulose and hemicellulose is the abundant renewable resources in nature, the cellulase and hemicellulase produced by microorganism has extensive application prospect. In this study, We have screened through the cellulolytic strains form the mud and rotten c

4、abbage heart screening, and measured cellulose enzyme activity under the condition of different pH, temperature, substrate and metal ions, respectively. The results indicated that: the crude enzyme liquid enzyme activity optimum pH 5.0, pH in the range of 5.0-6.0 stability of enzyme activity was hig

5、her, and the tolerance range was relatively narrow. The influences of four substrates on the enzyme activity were different, and the sodium carboxymethyl cellulose was the best. Fe2+, Mn2+ and Fe2+ had a promoting effect on the enzyme activity, Mn2+ was the best choice as metal ion and the optimal c

6、oncentration was 4.0 mmol/L. But Cu2+ had the inhibitory effect on the enzyme activity. The activity of crude enzyme fluid in 45-60 was higher and the optimal temperature was 55 , the temperature of the tolerance range is relative widely. These results could provide the new insight in the study of h

7、emicellulose degradation bacteria applying in the cellulase production.Keywords: Cellulose; Hemicellulose; Cellulose; Enzyme properties前 言我国是农业种植大国，农产品如小麦、水稻、玉米等废弃物中含有大量的纤维素和半纤维素。据统计，每年植物通过光合作用产生的纤维素就有1700亿吨之多。作为植物细胞壁的重要组成部分，经纤维素酶水解后的纤维素可用作生物质资源被循环利用，具有重大的经济和生态意义。纤维素外层包被高结晶结构的木质素，不容易降解为葡萄糖，因此这些资源在动物

8、饲料和造纸行业都没有得到充分利用1。在自然界中，半纤维素是仅次于纤维素的可再生资源，其结构和组成比纤维素更为复杂。作为植物细胞壁的重要构成成分，半纤维素主要分布于植物的初级细胞壁和次级细胞壁中，在植物组织中的占的比例大约为15-30%，主要被微生物分泌的半纤维素酶水解为木糖和其他单糖2。半纤维素主要包括己糖和戊糖，如木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖和甘露聚糖等，属于异质多糖。其中，木聚糖和甘露聚糖可以用于食品、饲料和造纸行业等3。研究表明，木聚糖酶作为饲料添加剂可以分解饲料原料中的纤维素为木聚糖，促进饲料转化，调节动物肠道菌群，提高消化能力。木聚糖酶通过分解果汁中的木聚糖以提升果汁

9、浓缩速率，提高产品质量。此外，木聚糖酶还可以提升面包口感、增加葡萄酒、白酒生产过程中酒精的产出率4。天然植物纤维具有生物可降解性和再生性，且资源丰富、价格便宜，可大量应用于造纸、纺织、农业等领域。因此，研究微生物分泌的纤维素酶和半纤维素酶酶活性质，对农业废弃物纤维素和半纤维素的循环利用具有重要的生态和经济意义。自然界中存在大量的微生物都可以通过分泌纤维素酶用来分解纤维素，其中以真菌类型的霉菌最多，例如木霉菌、曲霉菌和青霉菌等。纤维素酶是一类复合型化学酶系，主要有外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、葡萄糖苷酶等5-6。大量研究表明，纤维素被纤维素酶催化分解的酶促反应过程受到许多因素的影响，如酶数量、底物

10、种类和浓度、木质素结构、金属离子种类和浓度、温度和pH等7-9。为了提高纤维素酶的酶解速度，集中研究酶解过程的条件优化。（1）底物。不同的底物浓度显著影响纤维素酶的催化效率，浓度过低则水解效率较低，一定程度内增加底物可以提高反应速度和产物生成率；但是底物浓度过高又会抑制酶反应体系，降低反应速度。（2）木质素结构。木质素组织结构非常坚实，其会通过阻碍纤维素酶和纤维素的结合，从而对酶促反应的进行到不良的干扰作用。因此，某种意义上来说，去除木质素除可以促进纤维素的水解。（3）纤维素酶。增加反应体系中的酶含量，可以显著提高纤维素分解速度，但成本也相应升高。在酶促反应中添加一些表面活性剂如Fe离子、镁离

11、子等，可以显著纤维素酶活力10-13。（4）反应条件。纤维素酶种类的不同，会影响其对温度和pH等反应条件产生不同的耐受性，如温度和pH过高或者过低均会影响酶活力。一般而言，酶的最适温度为40-60 ，pH为4.5-5.5。（5）终产物。纤维素的水解产物会影响酶活力，其中，纤维二糖和葡萄糖具有抑制作用，通过增加提高酶含量或-葡萄糖苷酶都可以减弱终产物的抑制作用。（6）预处理。主要分为三种，第一、物理法，如机械破碎、蒸汽爆碎、高能辐射、微波处理等；第二、化学法，如酸碱试剂、有机溶剂等处理；第三、生物法，如微生物分解等。经过机械粉碎的纤维素，呈结构松散的粉状，酶水解效率显著得到提高。蒸汽爆碎效果较好

12、，但所需的高压设备成本较高14-16。纤维素酶在许多行业中均有较为良好的应用。（1）造纸工业。纤维素酶用于造纸和制浆过程，能够在短时间内降解纤维素材料发挥制浆的作用，提高造纸水平。（2）食品行业。纤维素酶可以破坏植物细胞壁，裂解植物原料，溶出与利用细胞内有效成分，提高原料提取与利用率。例如水解大豆细胞壁用于提取蛋白质，作为糖尿病人的葡萄糖替代物食品等。（3）制药工业。木聚糖酶添加可改善药物成分的释放，用于提取中草药有效成分。（4）酿酒行业。木聚糖酶能够通过增强淀粉酶活性用以提高发酵效率和酒精产出率。（5）饲料行业。纤维素酶等可以水解饲料中的纤维素成分，将其转化为可吸收的糖和菌体蛋白，提高饲料利

13、用率和消化率，促进动物生长；调节肠道菌群，提高动物消化能力17-18。微生物产生的纤维素酶、半纤维素酶具有良好的应用前景，但目前工业用酶普遍存在特异性差、生产效率低、成本高等缺点。因此，筛选获得特异性好、效率高的纤维素酶、半纤维素酶显得极其重要。本研究通过提取从泥土和烂白菜心中富集分离能够降解纤维素微生物细菌的粗酶液，分别研究不同pH、金属离子种类和浓度、底物和温度条件下的酶活性变化规律，从而确定纤维素酶性质。本研究可以为纤维素和半纤维素降解菌产纤维素酶及其酶促反应条件的优化提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 药品牛肉膏+蛋白胨、豆饼粉、酵母膏、滤纸、羧甲基纤维素钠、玉米芯、麸

14、皮、FeSO4、MnSO4、CuSO4、MgSO4、3,5-二硝基水杨酸、木聚糖等。1.1.2 主要仪器和设备JY1002电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、722100可见光分光光度计（上海天普分析仪器有限公司）、JYC-19T九阳电磁炉（丽水大明家电有限公司）、HH-W电热恒温水浴器（江苏省金坛市医疗仪器厂）、SW-CJ-2D双人单面超净工作台（郑州南北仪器设备有限公司）、ZHWY-2102C双层小容器全温度恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）、手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅（上海三申医疗器械有限公司）、TGL-16G台式离心机（冷冻超速离心机）（上海安亭科学仪器厂）、超低温冷

15、冻储存箱（中科美菱低温科技有限责任公司）、GZX-9070MBE数显鼓风干燥箱（上海博讯事业有限公司医疗器械厂）、SPX-250BS-II生化培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）。1.1.3 试剂配制（1）3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液称取DNS 6.5 g，加入100 mL蒸馏水充分溶解，再依次加入2 mol/L NaOH溶液325 mL、丙三醇45 g，混匀，冷却至室温后用蒸馏水定容至1 L，置于棕色瓶中室温避光保存7 d后使用。（2）1%木聚糖溶液利用电子天平称取1.0 g木聚糖，加入提前加热好的100 mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH7.0），待完全溶解后利用蒸馏水定容至

16、100 mL，保存于4备用。1.2 方法1.2.1 粗酶液的提取将采集到的泥土和烂白菜心放入装有无菌水的摇瓶中，37 、180 r/min振荡培养24 h，对样品进行富集。利用移液器吸取1 mL富集好的细菌培养液，置于5.0 mL试管中，试管中装有灭菌过的0.86%生理盐水。然后，按照一定的比例进行梯度稀释。取200 L稀释液，均匀涂布于LB（牛肉膏蛋白胨）培养基固体平板，37 生化培养箱中培养24 h。随机挑取单菌落，接种于LB液体培养基中，37 、180 r/min振荡过夜培养，5000 r/min离心机中离心10 min。用移液器吸取上清液，除去沉淀，所的上清液即为本研究所用粗酶液。粗酶

17、液分装于不同离心管中，保存于-20 备用，避免实验中反复冻融粗酶液造成酶活性降低或丧失。1.2.7 酶活力测定参照DNS法对酶活力进行测定19。DNS法是一种定量测定纤维素酶活性大小的常用方法，其检测原理主要是利用DNS与还原糖之间的氧化还原反应，其反应产物3,5-二硝基水杨酸可以在煮沸条件下显色，根据所呈现的颜色与还原糖含量之间的对应关系，从而测定出所用还原糖含量。取待检测的酶溶液1 mL和1%木聚糖溶液1 mL，置于25 mL的带塞试管中，混合完全后于50 水浴锅中反应10 min。然后加入事先配制好的2 mL DNS溶液，放于沸腾的水浴锅中进行5 min显色反应；反应完毕，将试管从水浴锅

18、中取出，置于流动水中进行自然冷却，温度冷却到室温后，用蒸馏水定容至25 mL，充分混合后利用分光光度计测定540 nm的吸光度（OD）。绘制木聚糖溶液标准曲线，然后按照下述公式计算酶活力：X = 1000 C V/V1 T其中，X: 样品酶活性（V/mL）；C: 测试液中木糖含量（mg/10 mL）；V: 定容体积（mL）；V1: 吸取酶液的体积（mL）；T: 水解时间（min）。在特定的条件下，1 min内水解木聚糖生成1 mol还原糖（木糖）所需要的酶含量，定义为一个酶活力单位。1.2.2 pH对酶活性的影响使用1 mol/L HCl溶液调节粗酶液pH分别为4.5、5.0、5.5、6.0和

19、6.5，振荡培养1 d后，利用DNS法测定溶液OD值，确定酶促反应的最适pH。1.2.3 金属离子对酶活性的影响在粗酶液中分别添加Fe2+、Mn2+、Cu2+和Mg2+的硫酸盐溶液，使其终浓度为0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L和4.0 mmol/L，利用DNS法测定溶液OD值，确定酶促反应的最适金属离子及其浓度。1.2.4 底物对酶活性的影响分别以滤纸、羧甲基纤维素钠、玉米芯和麸皮作为底物，制作牛肉膏蛋白胨液体培养基。取1 mL粗酶液和1 mL不同底物液体培养基于试管中，充分混匀，置于50 水浴锅中进行酶解反应，10 min后加入2 mL

20、DNS溶液沸水浴显色5 min，取出自然冷却后，定容25 mL，分光光度计540 nm处检测OD值。1.2.5 温度对酶活性的影响取1 mL粗酶液和1 mL相同底物于试管中混匀，分别置于40 、45 、50 、55 、60 和65 水浴锅中进行酶解反应，10 min后加入2 mL DNS溶液沸水浴显色5 min，取出自然冷却后，定容25 mL，分光光度计540 nm处检测OD值。2 结果和分析2.1 不同pH对酶活性的影响表1 不同pH对酶活性的影响因素pH酶活14.56.525.08.235.57.946.07.556.56.8图1 酶的pH稳定性由表1可知，不同pH条件对酶活性的影响不同。

21、pH为4.55.0时，纤维素酶活性随pH的升高而上升，pH 5.0时酶活性最高；pH为5.06.5时，纤维素酶活性随pH的升高而明显降低。由此可知，酶活性最适pH为5.0。粗酶液经不同pH缓冲液处理后，通过酶活测定得到其对pH的稳定性曲线见图1。纤维素酶在pH 5.0保温1 h后，剩余酶活力最高；pH在5.06.0范围内纤维素酶稳定性较高，耐受范围相对较窄。2.2 不同金属离子对酶活性的影响表2 不同金属离子对酶活性的影响浓度（mmol/L）酶活Fe2+Mn2+Cu2+Mg2+0.52.64.23.12.81.03.24.52.93.41.53.45.32.33.72.02.75.82.73.

22、24.02.46.32.22.5分别选取Fe2+、Mn2+、Cu2+和Mg2+作为待测金属离子，测定不同金属离子和浓度条件下纤维素酶活性的变化规律，结果如表2所示。4种金属离子（Fe2+、Mn2+、Cu2+和Mg2+）对纤维素酶活性都有显著的影响作用，金属离子种类及其浓度不同，酶活性发生的变化不同。（1）随着Fe2+浓度的升高，纤维素酶活显著上升，然后随Fe2+浓度的升高逐渐降低，其最适浓度为1.5 mmol/L。（2）纤维素酶活性随着Mn2+浓度的升高而逐渐升高，表明Mn2+对酶活有明显的促进作用，其最适浓度为4.0 mmol/L。（3）随Cu2+浓度的增加，酶活性逐渐降低，最适浓度为0.5

23、 mmol/L。（4）随着Mg2+离子浓度的升高，纤维素酶活性先上升后下降，表明低浓度的Mg2+具有促进酶活性的作用，其最适浓度为1.5 mmol/L。2.3 不同底物对酶活性的影响表3 不同底物对酶活性的影响底物酶活滤纸4.2羧甲基纤维素钠5.4玉米芯4.5麸皮4.9分别选取滤纸、羧甲基纤维素钠、玉米芯和麸皮作为纤维素酶酶促反应的底物，测定不同种类的反应底物条件下纤维素酶活性的变化规律，结果如表3所示。结果显示，4种底物对酶活性的影响不同。其中，羧甲基纤维素钠组的酶活性最高，其次为麸皮、玉米芯、滤纸。2.4 不同温度对酶活性的影响表4 不同温度对酶活性的影响温度（）酶活455.1505.95

24、56.3605.7655.2图2 酶的温度稳定性由表4可知，不同温度条件对酶活性的影响不同。在4555 温度范围内，随着温度的升高，纤维素酶活性显著上升；温度超过60 时，纤维素酶活性随温度的升高而明显降低。由此可知，纤维素酶不适合于高温下发挥重要作用，其酶活性最适温度为55 。不同温度条件下纤维素酶活的稳定性曲线见图2。纤维素酶在4560 范围内保持较高的活力，55 为其最耐受温度；温度超过55 时，酶活稳定性明显下降，表明纤维素酶对温度的耐受范围相对较宽。3 讨论纤维素和半纤维素酶在自然界中的物质来源广泛，微生物分泌是其主要来源之一。不同的微生物菌种，其所产生的纤维素酶的化学性质不同；同一

25、微生物菌种在不同的酶促反应条件下，如温度、pH、底物和金属离子等，所产生的纤维素酶的化学性质不同也不会完全一样。因此，纤维素和半纤维素酶的酶学性质的研究，有利于筛选适宜的酶应用于不同的科研生产环境中，为酶制剂的研发和推广提供理论参考20-24。研究表明，酶对底物的选择具有一定的特异性，包括绝对特异性和相对特异性，比如淀粉酶只能对淀粉起到水解作用。即使是同一底物原料，纤维素酶的酶解反应也会不同25-26。本研究中，滤纸、羧甲基纤维素钠、玉米芯和麸皮4种底物对纤维素酶活的影响作用不同，其中以羧甲基纤维素钠效果最好，其次为麸皮、玉米芯和滤纸。纤维素酶是诱导型酶，而麸皮作为价廉的纤维质，既能能够提高菌

26、体生长必需的营养，还能够诱导纤维素酶的产生，有利于将廉价农产品废弃物转化成高附加值产品，具有生态和经济效益27-28。羧甲基纤维素钠可溶于水，其结构和性质均与纤维素不同，易被纤维素酶水解。玉米芯营养丰富，含有较多的粗蛋白、粗脂肪和粗纤维，其可以生产大量羧甲基纤维素钠，制备过程大致为：首先制成纤维素，然后碱化为碱纤维素，再与氯乙酸反应生成氯乙酸钠，醚化即可得到羧甲基纤维素钠。据报道，每1.7吨玉米芯即可生产1吨羧甲基纤维素钠29。温度对纤维素酶活性与稳定性有显著影响。一般情况下，纤维素酶活性在特定的温度范围内会随着温度的升高逐渐升高，反应速率得到提高；当温度超出一定限度后，酶活性会随温度的升高而

27、显著下降乃至活性丧失，反应速率大幅度降低。酶的化学本质为蛋白质，温度较低时，蛋白质的构象和基团的解离状态及与底物的亲和力会随温度的升高而发生变化，活性在一定温度范围内逐渐升高。过高的温度会造成蛋白质结构不稳定，引起酶发生聚合或者变性现象，从而活性下降或丧失30-31。此外，温度对微生物生长的影响作用最为突出，其会对生物体内许多生化反应和酶反应产生影响。温度过低，菌体生长缓慢，世代传递变长，酶活性显著受到抑制；而温度过高，菌体生长变得旺盛，会加速菌株老化速度，纤维素酶产生量减少，酶活性也显著降低。因此，控制适应温度对纤维素酶活性具有重要意义32-33。本研究中，粗酶液温度为4560 时，纤维素酶

28、活性随温度的升高而上升，表明纤维素酶对温度的耐受范围相对较宽，而其最适温度为55 。酶促反应需要适宜的环境pH，酶的化学本质蛋白质对酸碱度相对比较敏感，其活性直接受溶液pH值的影响，pH过高或过低都会抑制酶活性，降低酶解反应速率，只有在适宜的pH值范围内才能发挥酶的最佳催化效果。此外，反应溶液的pH与纤维素酶的分子构象关系密切，且在酸性环境中纤维素酶不易失活，即使酶活变性，也为可逆转的。酶分子的变性过程较为缓慢程，蛋白质螺旋结构改变和氨基酸微环境极性改变，其所造成的氨基酸暴露均会导致蛋白质基团质子化或去质子化，从而引起蛋白质分子内部发生静电排斥，盐桥打开或孤立电荷暴露，从而最终引起酶变性或酶活

29、丧失34。因此，只有在最适pH范围内酶活才能表现出最佳活力。纤维素酶系中酶种类较多，其不同底物所需pH也不尽相同，大多数底物的最适pH主要在4.05.5之间，而酶促反应的最适pH值的相对集中却不统一，有的pH为4.6，也有4.5或4.4。鉴于生产中应用的大部分纤维素酶的pH在4.05.0之间，所以为了便于统一和相互比较，最适pH值在4.05.5之间的酶样品，一般都取4.6作为反应pH条件进行酶活测定。本研究中，粗酶液pH为4.55.0时，纤维素酶活性随pH的升高而上升；而pH为5.06.5时，酶活性随pH的升高而降低，粗酶液最适pH为5.0。此外，纤维素酶仅在pH5.06.5内的稳定性较高，表

30、明其pH耐受范围较小。金属离子是微生物生长所必须的营养之一，其在微生物生长、细胞结构组成、能量转移、酶类代谢、维持分子和细胞结构的稳定性，调节渗透压等过程中发挥重要作用。作为酶活性中心的重要构成部分，金属离子可以显著影响纤维素酶的活性，其影响作用主要体现在以下几个方面：（1）金属离子是纤维素酶活性中心的重要组成部分；（2）金属离子在纤维素酶与底物之间具有连接作用；（3）金属离子可以影响纤维素酶空间构象的稳定性；（4）金属离子在纤维素酶酶促反应中起到电子传递的作用35-36。本研究中，Fe2+、Mn2+和Mg2+能够明显促进纤维素酶活性，而Cu2+则主要起到抑制纤维素酶活性的作用。Mn2+能够与

31、酶连接，通过形成金属离子连接桥从而提高酶活性。因此，Mn2+可以作为纤维素酶的激活剂。潘乐毅等研究发现，Cu2+对纤维素酶的具有显著的抑制作用，其主要原因是因为Cu2+是重金属离子，其对蛋白质有毒害作用，且这种毒害作用随重金属浓度的升高而加重。低浓度条件下的Mg2+和Fe2+离子，其能够促进底物与纤维素酶活性中心结合，从而加快二者之间的吸附速度，从而显著提高酶活性；但离子浓度过高时，会改变酶分子和活性中心结构，从而降低酶活性。4 结论本研究通过从泥土和烂白菜心中筛选分解纤维素的菌株，分别从不同pH、温度、底物和金属离子条件下的纤维素酶活性进行了探讨，得到以下结论：（1）不同pH（4.5、5.0、5.5、6.0和6.5）条件下纤维素酶活性的变化不同，粗酶液最适pH为5.0。纤维素酶在pH 5.06.0范围内具有较高稳定性，表明其pH耐受范围相对较小。（2）4种底物中，羧甲基纤维素钠组的酶活性最高，其次为麸皮、玉米芯、滤纸。（3）4种金属离子Fe2+、Mn2+、Cu2+和Mg2+及其不同浓度条件下，纤维素酶活性的变化不同。Fe2+、Mn2+和Mg2+可以提高酶活性，其中Mn2+的激活效果最好，其最适浓度为4.0 mmol/L；而Cu2+对酶活具有抑制作用。（4）不同温度（40 、45 、50 、55 、60 和65 ）条件下，粗酶液