ATP荧光法在乳制品行业的应用研究报告.docx

1、ATP荧光法在乳制品行业的应用研究报告ATP荧光法在乳制品行业的应用研究报告摘 要 现如今，食品安全问题已经引起社会大众的广泛关注、.其中，特别是奶制品的食品安全现状令人堪忧、.纯牛奶中的各种营养物质含量丰富，适合微生物生长，故在牛奶生产中细菌学检验是确保食品安全的重要环节、.在社会节奏越来越快的今天，对于牛奶制品中的检测效率和要求也有所提升，而传统的平板菌落计数法虽然精确度较高，但是其存在操作繁琐且耗时较长等缺点，可能导致商品的上架时间延长，给企业带来一定的经济损失、.所以，寻求效率更高和精确度更好的检测方法成了当务之急、.ATP生物荧光法以其操作简便、灵敏度较高等优点从众多的快速检测方法中

2、脱颖而出、.ATP生物荧光法是以活细胞中的ATP总含量和活细胞数能成较好线性关系为原理进行的检测方法、. 本课题以ATP生物荧光检测仪对含菌量不同的奶样品进行ATP荧光计数检测并绘制相应曲线，由于荧光值大小和活菌总数成线性关系，说明ATP荧光法适用于不同含菌量的检测、.采用稀释等方法对液态牛奶进行预处理，用ATP生物荧光检测仪测出预处理后的样品不同稀释度的发光值，不同稀释度对应的样品用传统的平板菌落计数法做2-3个平行计数、.然后，作出菌数和荧光值的对应曲线作为牛奶样品微生物菌数检测的曲线，观察二者之间的相关性、.当相关系数达到0.98以上的时候，证明ATP荧光计数检测法可以代替传统平板菌落计

3、数法，应用于液态牛奶微生物活性快速检测切实可行，在工业上可直接应用，缩短牛奶制品的微生物检测周期、.关键词：ATP生物发光法 快速检测 平板菌落计数法 相关性摘要IAbstractII绪论51.研究思路62.研究方案62.1 牛奶原液总菌数的检测62.1.1 牛奶原液总菌数检测的目的62.1.2 牛奶原液总菌数检测的步骤62.1.3 结果分析82.2 牛奶原液加菌后总菌数的测定82.2.1 牛奶原液加菌后总菌数测定的目的82.2.2 牛奶原液加菌后总菌数测定的步骤82.2.3 结果分析92.3 ATP荧光法预处理方法的选择102.3.1 ATP荧光法预处理方法选择的目的102.3.2 ATP荧

4、光法预处理方法选择的步骤102.3.3 结果分析112.4 ATP荧光法稀释液的选择142.4.1 ATP荧光法稀释液选择的目的142.4.2 ATP荧光法稀释液选择的步骤142.4.3 结果分析152.5 ATP荧光法和平板菌落计数法之间的对应关系182.5.1 得到ATP荧光法和平板菌落计数法对应关系的目的192.5.2 得到ATP荧光法和平板菌落计数法对应关系的步骤192.5.3 结果分析202.6结论213.关于ATP荧光法在乳制品行业的应用展望22致谢24参考文献25附录一27附录二27附录三27绪 论 细菌总数作为判定食品被细菌污染程度的标记,具有重要的卫生学意义、.液态生物制品如

5、液态牛奶、低酒精度饮料酒等出厂前都需要经过食品卫生微生物学检验，达到相应的国标要求才能进入市场、.食品细菌学检验通常采用琼脂平板菌落计数法，该方法是根据每个活菌都可生长为一个菌落的原理设计，这种方法精度高，但是操作过程一般需要2-3的时间甚至更长，检验结果往往滞后、.众所周知，许多食品在生产当天就必须出售，因此急需即时性的细菌学检验方法、.近年来，国外普遍采用HACCP（食品制造过程中卫生管理认证）制度，更迫切需要在食品制造过程中能快速、简便检测食品生产环境清洁度和食品是否达到卫生标准的方法、.ATP生物荧光法作为一种简便、快速的微生物检验方法，近年来在国外备受瞩目，并得以广泛应用、. ATP

6、作为生物代谢的能量来源，是微生物不可缺少的物质、.如果捡样中污染了微生物，用有机溶剂等专用试剂破菌后，ATP就被释放出，利用ATP生物荧光法即可测出ATP的含量、.由于活的微生物体内的ATP浓度基本稳定，使得ATP浓度与活的微生物之间存在线性关系，故ATP含量可以成为活的微生物的检测指标、. 本课题以巴氏灭菌奶为检测对象，进行琼脂平板计数和ATP荧光法两种微生物检测方法，然后将两种方法的结果进行比较，得到二者之间的相关性，探索如何对牛奶进行预处理才可以使得ATP生物荧光法代替传统的平板菌落计数法进行牛奶中总菌数的测定、.由于捡样中游离ATP的存在，所以我们应该探索最优的预处理方法，尽量减少游离

7、ATP以及其他杂质对检测结果的干扰，然后得到传统平板菌落计数法和ATP生物荧光法的较高相关性，绘制标准曲线，可直接将ATP生物荧光法应用于牛奶中微生物活性的快速检测，缩短微生物的检测周期、.1.研究思路 将现有的牛奶样品浓度梯度稀释后采用传统的平板菌落计数法进行计数，并用ATP生物荧光检测仪测出不同浓度的牛奶样液的荧光值，即可做出活菌总数和荧光值的对应曲线，并将其作为ATP生物荧光检测仪检测牛奶中总菌数的标准曲线、. 我们在实验中使用的样品是光明优倍鲜牛奶（市面销售的巴氏灭菌奶），能在市面上出售的巴氏灭菌奶应为合格产品，那么，可能出现总菌数过少导致有传统法测出的菌落总数不准或者根本无法测出、.

8、为了避免这种情况的出现，我们在实验过程中，人为添加大肠杆菌，提高牛奶样液中的含菌量，再进行实验、. 纯牛奶中各类营养物质含量丰富，则有可能会影响ATP生物荧光检测仪的检测结果，需要我们对牛奶样液进行一定的预处理；但是，我们还不清楚牛奶中的营养物质会对检测造成何种影响、.所以，我们先暂定两种预处理方法：过滤和稀释、.若牛奶中的营养物质对荧光仪的检测影响较大，过滤可以除去牛奶中的大分子蛋白质，降低营养物质对检测的影响；若牛奶中的营养物质对荧光仪的检测影响不大，那么，采用稀释的方法，不需要复杂的预处理，简便省时、.确定了预处理方案后，稀释液的选择也需要谨慎的选择，实验室条件有限，我们暂定稀释液为无菌

9、水和缓冲液、.在得到最优的预处理方案后，做出荧光值和菌数的对应曲线，得到相关系数、.2.研究方案 2.1牛奶原液总菌数的检测 2.1.1 牛奶原液总菌数检测的目的 为了确定市面上销售的巴氏灭菌奶的灭菌效果和之后的实验是否要采用加菌的办法得到较好的实验结果，我们首先采用平板菌落计数法检测牛奶原液中的总菌数，以便确定之后的实验方案、. 2.1.2牛奶原液总菌数检测的步骤 （1）设备 SPX-250型 恒温培养箱；YX-4502 高压灭菌锅；SW-CJ-ID型 单人超净工作台；250ml锥形瓶(2个）;玻璃试管（6只）；试管架；培养皿（18个）；小烧杯；10 ml移液管；微量移液枪及一盒吸头；酒精灯

10、； （2）试剂 营养琼脂粉；盒装牛奶； （3）步骤 培养基的配制；（详细方法见附录一）；将六只试管中均用10ml移液管加入9ml的蒸馏水，用盖子盖好；18个培养皿装盒，一盒吸头用报纸包好，然后把两瓶培养基、6只试管、2盒培养皿、一盒吸头放入高压蒸汽灭菌内灭菌（121，20min)； 样品的稀释 待所有灭菌过的器具冷却后，用移液枪吸取吸牛奶原液1ml加入有9ml无菌水的无菌试管内，盖好盖子后将其震荡至混匀（大约5min左右），制成1:10 的样品匀液；用1 ml 微量移液枪吸取1:10 样品匀液1 ml，沿管壁缓慢注于盛有9 ml 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试

11、管使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液；重复上述步骤，制备10 倍系列稀释样品匀液、.每递增稀释一次，换用1 次吸头； 倾注法到平皿 选择2个3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），吸取1 ml样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做三个平皿、.同时，分别吸取1 ml空白稀释液加入三个无菌平皿内作空白对照；及时将15 ml20 ml冷却至46 的平板计数琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀； 培养 等到培养皿内的琼脂凝固后，将平板倒置，在37 1 培养箱中培养48 h3 h； 菌落计数要求 用肉眼观察，必要时可以用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量、.菌落计数以菌落形

12、成单位（colony-forming units，CFU）表示、. 选取菌落数在30 CFU300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数、.低于30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计、.每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数、. 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数、. 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，将每条单链作为一个菌落计数； 2.1.3结果分析 平板上的菌落生长状况并不理想，

13、甚至有些平皿中并未长出菌落、.具体情况见下表、.表一稀释倍数10100100010000CFU24/16/285/1/70/1/00/0/0 计算得，总菌数= ； 结论：部分平皿并未长出菌落，并且长出菌落的平皿都未达到计数要求，这证明巴氏灭菌奶中总菌数过少，为了之后的实验结果尽可能的准确，我们需要向牛奶中添加大肠杆菌、. 2.2 牛奶原液加菌后总菌数的测定 2.2.1 牛奶原液加菌后总菌数的测定的目的 为了保证样液可以用传统平板菌落计数法计数，并达到有效计数范围；这样才能使ATP生物荧光法的计数和传统平板菌落计数法更好的对应起来、. 2.2.2 牛奶原液加菌后总菌数的测定的步骤 （1）设备 基本同2.1.2（1），并且在2.1.2的基础上多准备一只试管； （2）试剂 同2.1.2（2）； （3）步骤 按照2.1.2（3）中的方法将培养基配制好，并且在五只试管中用10ml移液管加入9