银杏胚胎与种实发育的细胞生物学研究.docx

1、银杏胚胎与种实发育的细胞生物学研究银杏胚胎与种实发育的细胞生物学研究博 士 生：王 莉指导教师：陈鹏教授专业方向：植 物 学1.研究目的意义银杏，裸子植物，为孑遗树种。现在种植的银杏是银杏科唯一生存的种类，是著名的活化石植物。银杏原遍布于全球,第四纪冰川之后,仅留存于我国亚热带山区，因而我国被称为“银杏的故乡”。由于银杏在地球上出现的历史久远，树体寿命极长，因而具有许多原始性状，此外随着对银杏树的开发利用，目前银杏又是珍贵的观赏树种、经济树种、生态树种，其栽培面积逐年递增，并在中国国树评选中得票遥遥领先。因而对银杏传粉受精过程及种实生长发育的研究具有重大意义。研究方向之一:银杏胚胎发育的观察

2、迄今为止世界上最早的种子植物发现于北美和欧洲西北部的晚泥盆纪（3亿6千万年前）地层。这些种子植物可能起源于前裸子植物,即解剖构造上较为进化的一类蕨类植物(Jason Hilton，1998）。种子植物一经出现地球上的植物格局发生重大改变，表现为：维管植物能较好的适应陆地生活的结构发展，植物通过产生次生木质部大大增加了他们的身体，形成了乔木，进而发展为森林；平面化的叶片发育还增加了光合效率；种子把植物从受精作用需要外部潮湿条件的束缚中解放出来，种子还为幼小植物提供营养来源，种子能够在受精和萌发之间保留一段休眠期，这样就可以利用随时出现的有利条件使其萌发。关于银杏类植物源自何种植物和出现的大致时间

3、至今还没有确切的证据和得到公认的结论。有研究表明苏铁类植物是最早的种子植物,被称为”植物元老”,而许多研究证实银杏生殖方式和胚胎发育比较原始，并和苏铁类植物较为类似；近年来从分子系统学研究认为有些细胞器（叶绿体和线粒体）基因rbcL序列和核糖体核酸rRNA序列同样说明银杏同苏铁的近似程度超过与松柏类植物,因而银杏很可能是最早的乔木类种子植物。目前公认可靠的银杏类化石发现是在2.7亿年前，至侏罗纪和早白垩纪达到银杏类植物的鼎盛时期，种类繁多，在形态上差异很大，在地域分布上遍及世界各大洲，但当被子植物于早白垩纪迅速崛起时，银杏类植物同其它裸子植物一样急剧衰落，发展至今仅保存一属一种。银杏作为一种多

4、年生乔木，是以巨大的植株和漫长的生命、以及不断产生有限成活的幼株的方式来生存和繁殖。历经上亿年的生存繁衍，目前保留下来的银杏从传粉到受精的整个过程依然表现出了许多原始特征，但同时在不同时期银杏类植物的演化不断又使得现在的银杏有了许多进化性状。因而对银杏这一“活化石”植物的胚胎发育方面的系统研究，并将其特征及过程与更早期出现的蕨类植物、之后出现的被子植物进行比较分析，对于研究木本植物的进化与系统分类具有极为重要的意义。 研究方向之二：银杏种实生长发育的细胞学观察 银杏不仅以古老著称，同时又是珍贵的经济树种，是中国特有而丰富的经济植物资源。对银杏开发利用的研究主要集中在：对银杏叶片的研究，发现其含

5、有黄酮类和银杏内酯等物质，对于改善人体器官扩张、促进血液循环、防止血管老化具有重要功能；银杏外种皮长期以来被作为废弃物，但近年来在外种皮中同样发现了黄酮类和银杏内酯等物质，因而对外种皮的开发利用成为目前的热点；银杏种实含有大量的淀粉、蛋白质、脂肪等营养物质，还含有银杏内酯等药用成分，一直以来被做为营养品和保健品深受国内外大众的喜爱。因而银杏种实从种皮到可食用部分胚乳都是重要的经济资源，但到目前为止对银杏种实的研究仅仅局限在生长发育过程方面的简单分析，而对其种皮的分化形成、黄酮内酯的合成部位与形成机理、胚乳形成的细胞学研究、营养物质的发生增殖方式等方面仍属空白，本研究将从以上几个方面对银杏的种实

6、发育进行研究，从而为提高种皮药用成分与种实产量，改善银杏食用品质提供理论基础。2.研究现状有关银杏的生殖过程的研究,自从日本东京大学的Hirase发现银杏的精子具鞭毛结构后,已有100多年的历史了, 其中在银杏大小孢子发生、雄配子体发育、精细胞及离体培养、颈卵器的形成、胚胎发育等方面已有大量报道。如Friedman W对银杏花粉体内生长状况进行连续切片，利用计算机重组技术得到的银杏花粉在体内萌发的图片，表明银杏花粉萌发时首先经历弥散状生长阶段，并通过顶端生长和亚顶端的高度分枝，在珠心组织的细胞内形成吸器状结构，最后花粉管不分枝的一端膨大，雄配子体达到成熟13-15；李正理、Stewart KD

7、、吉成均等对银杏大孢子形成的形态发生进行了研究，认为大孢子母细胞开始经历减数分裂期和期后，形成四分体，偏向合点端细胞最大，最后形成功能大孢子，且在分裂过程中细胞呈现两极分化现象；颈卵器的发育首先由2个表面细胞逐渐变大，细胞内充满液泡的颈卵器母细胞经有丝分裂和垂周分裂后形成2个颈细胞和1个中央细胞，受精前分裂成4个颈细胞，1个腹沟细胞和1个卵细胞；受精过程的研究表明，6月初精原细胞分裂形成，8月中下旬，精原细胞分裂形成精子，由于银杏精子带有鞭毛，因而在颈卵器室内以盘旋的方式向前游动，很快就到达颈卵器口。几乎在精细胞从花粉管释放的同一时刻，卵细胞的细胞质向外冲出，使覆瓦状排列的颈细胞中上面的细胞向

8、上张开，精子的带鞭毛端贴着卵细胞的伸出物并随着它的回缩而进入颈卵器，精核进入卵细胞后向卵核靠拢，靠近卵核后其核膜紧贴卵核的核膜，随后在近精核处的卵核产生凹陷，逐渐将精核包入，随着精核进入卵核，精核的染色质散入卵核中，完成受精过程，受精后合子立即分裂。但仍然有许多没有搞清楚的地方，如由于银杏的精原细胞从产生到分裂形成精细胞相距2个多月,在其发育过程中依次产生了生毛体、液泡状结构和纤维颗粒体等特殊结构,有关雄配子体发育的许多细节都不清楚,如在液泡状结构和纤维颗粒体的结构和功能,精子如何穿过狭小的颈卵器口,精子是否全部进入颈卵器等方面还存在很大的争议。有关银杏种实发育的研究报道较少，而且观点差异较大

9、。已有研究表明功能大孢子形成以后，雌配子体的发育先后经历了游离核阶段和细胞化阶段，游离核是由功能大孢子进行不断的分裂形成的，但对分裂次数和游离核数目的统计报道不一，有的文献统计雌配子体经连续10多次的有丝分裂，形成约2000个游离核后,开始由合点端向珠孔端向心地分化出细胞壁,而其他的观点有的认为分裂形成多于1000个游离核16，有的报道经历13次有丝分裂形成8000个游离核20（Faver-Duchartre），各种说法差异较大。对雌配子体发育营养物质供应途径的研究比较少，现有的研究表明，在多核期时，雌配子体外面的大孢子膜逐渐加厚，此膜是由一系列短而垂直的线丝彼此紧密挤压在一起形成的，由珠柄运

10、输而来的营养物质通过大孢子膜供应于核分裂和细胞壁的形成，同时银杏胚珠自身也可进行光合作用，其光合产物也通过大孢子膜作用于雌配子体发育。但对于这一观点目前缺乏图片资料的证实21。雌配子体除发育成颈卵器以外的大部分则发育为营养组织-胚乳，胚乳仅为雌配子体的一部分，由于是由大孢子减数分裂直接发育而成，属于单倍体，但对胚乳的结构组成、细胞化的过程、细胞壁充实的物质来源、细胞内营养物质的发生及增殖方式、种实内营养物质的供应途径、种皮的分化形成过程等方面的研究未见报道。3.研究内容4.试验技术路线4.1银杏传粉受精特征观察4.1.1银杏传粉生物学研究4.1.2花粉萌发过程观察4.1.3雌配子体发育过程观察

11、4.1.4受精过程观察4.2银杏种实发育的细胞学观察4.2.1种皮的分化与形成4.2.2胚乳的发育5.试验方法5.1银杏雌雄株开花的生物学特性观察选取结实正常的雌雄株，分别调查不同轮枝层和不同树龄的雌雄花数量，分布规律。每日定时观察雌雄花的形态变化，跟踪记录开花过程。花期及单花开放进程调查：以肉眼观测花部性状，在显微镜下观察细微结构。初花期为全株盛开花在5%以下，盛花期为全株盛开花50%以上.开花末期为全株仅有1%的花朵仍在开花。在自然生长条件下。每次观测记录雌雄花开放状态、花药状态、花粉散出情况、柱头状态、传粉滴出现和持续的时间。5.2银杏花粉的形态及大小观察采用扫描电镜法。在盛花期，选择发

12、育成熟的花粉，将新鲜花粉直接散布在样品台上，经IB-5型离子溅射仪喷金后，在环境扫描电镜下直接观察拍照并测量。5.3银杏传粉过程的观察采集传粉期不同发育阶段的胚珠，FAA固定，分别进行扫描电镜和光镜观察，以研究胚珠珠孔道、贮粉室的发育形成过程，珠孔处传粉滴的产生细胞学机制。当胚珠形成时，切取带有胚珠的枝条在室内水培，观察传粉滴出现和持续的时间，采集成熟花粉，于室内进行人工授粉，光镜观察花粉在柱头传粉滴中的形态及大小变化，花粉在柱头停留时间，并每隔6h拍照1次，直至花粉进入胚珠体内。 当花粉进入胚珠体内后，每隔2h采集胚珠柱头处，FAA固定用于观察花粉粒在胚珠体内的运动过程。5.4胚珠对花粉粒捕

13、获能力观察观察正常条件下及人工授粉条件下传粉滴及贮粉室内的花粉粒数量。传粉滴中的花粉粒数观察直接在光镜下观察，胚珠接受花粉粒数的观察方法为在珠孔处切开漏出珠心和贮粉室，滴0.5%饱和水合氯醛酸性品红溶液，覆盖薄片，轻压挤出花粉，镜检。5.5花粉粒的离体培养采集未开裂的银杏雄花序，在组培室中进行消毒处理，配置培养基，每瓶中挑出1个花序的花粉粒进行培养，一定要进行避光处理，1个星期以后开始观察其萌发情况，并定期进行显微拍照。5.6花粉粒在贮粉室的萌发观察采集人工授粉后胚珠，先在解剖镜下选取贮粉室及珠孔道的确切位置，并浸泡在FAA固定液中，置于4冰箱中保存，进行复水处理，分别用70%，50%，30%

14、，10%，0%酒精处理，每隔23h处理1次，再用NaOH软化处理810h，倒掉NaOH并用蒸馏水冲洗3次，加入1.5ml的2%K3PO4（或者是PH89的磷酸缓冲液），压片后在350nm400nm的荧光显微镜下观察并拍照。由于银杏花粉粒进入胚珠体内后并不立即萌发，先在贮粉室内停留一端时间后才开始萌发，且花粉管生长时间较长，因此，采样时间应从授粉后1d至120d每隔10d取样一次。尤其是后期的取样工作比较困难，因为银杏胚珠体积逐渐增大，需要对贮粉室进行准确定位，以确保观察到花粉粒及萌发的花粉管。5.7杏种实生长发育过程中胚乳形态与体积的变化每隔7d取样，刀片进行纵切后用扫描仪扫描，photosh

15、op处理图片。5.8胚乳游离核分裂次数及数目的统计由于银杏胚乳经历游离核阶段和细胞化阶段，在游离核阶段位于珠心组织中央的为大液泡，细胞核分散在液泡中或分布在液泡周围，此时可直接在珠心组织的一端切一小口使液体流出并涂抹在载玻片上，用苏木精染色并置于光镜下观察游离核的形态并记数。由于游离核阶段持续的时间在4月底到6月初约40d的时间，因此取样时间自授粉后1d开始至6月5日，每隔2d取样一次，可采样后直接观察，也可用FAA固定后统一时间观察。5.9胚乳细胞数目的统计将胚乳置于苏木精中染色24h以上，后移至水中分色至水清，染色样品置于0.1%的纤维素酶中（磷酸-柠檬酸缓冲液，PH5.0），40恒温水浴

16、4h或更长时间，加以振荡，使胚乳组织完全离解为细胞悬浮液（开始硬化的胚乳可以用吸管轻轻吸排以促进细胞分散）。将完全均匀的细胞悬浮液定容至10ml，使其充分悬浮，吸取1ml等份试样，加入盛有20ml左右蒸馏水的过滤管中，抽气过滤，使细胞沉降于微孔滤膜上，制好的滤膜贴于滴有甘油的载玻片上。在普通显微镜下，以视野为单位镜检滤膜上的细胞数，又视野平均数换算得每一胚乳的细胞数。滤管有效截面积定容总量显微镜视野面积等分试样量每胚乳细胞数=视野细胞数 由于银杏游离核细胞化的进程具有不同步性，处于外围的游离核首先形成薄壁细胞，而中央的游离核后形成薄壁细胞，因而在细胞化没有完全形成之前，取样部位为外围的胚乳组织

17、，在细胞化完全后取整个胚乳组织。5.10形态解剖结构观察石蜡切片:观察种皮分化形成过程;胚乳细胞游离核形态大小及分裂方式与时期；胚乳细胞壁形成过程;种实发育过程中胚乳细胞淀粉体及蛋白体形态、大小及数量变化;胚乳糊粉层形成的过程；胚乳细胞核的衰退；颈卵器发育过程；受精过程；树脂半薄切片：胚乳细胞游离核形态大小及分裂方式与时期；胚乳糊粉层形成的过程等。超薄切片透射电镜观察：胚乳细胞游离核内细胞器分布与分裂特征；胚乳游离核在细胞化过程中微管的发生及作用机理；小泡的产生及在细胞壁形成中的作用；胚乳细胞垂周壁与平周壁的发生；胚乳细胞增生方式；胚乳细胞中淀粉体及蛋白体发生来源与增殖方式；外种皮分泌腔及原始

18、细胞团的超微结构；卵细胞的超微结构等。免疫荧光法；观察游离核微管分布特征；胚乳细胞壁的形成。6 拟解决的关键问题银杏的传粉机制；银杏的受精过程；银杏的胚胎发育过程；银杏胚乳细胞化过程中微管的作用；胚乳细胞中淀粉体与蛋白质体的发生与增殖方式；细胞核在胚乳发育过程中的变化；种皮的分化与形成过程中结构特征。7 可行性分析要完成上述试验，关键在于明确银杏授粉受精的关键时期，胚乳游离核发生、分裂及细胞化的各个时期，具有测定所需的仪器设备，掌握研究的方法。对于银杏种实发育过程中各个时期的确定，通过我们1年的大量石蜡切片及物候期的观察，结合前人的研究结果，已经明确了各个时期的基本过程，以后只要选准部位，进行

19、切片观察，就能取得预期结果。参考文献1 陈鹏， 何凤仁，余碧钰. 银杏种核形状及其种仁成分的分析研究. 江苏农业研究，1999，20（1）：3033Chen P, He F R, Yu B Y. Analysis and studies on the nucleus shape and the compositions in its kernel for the seed of Ginkgo bilobaJ.Jiangsu Agricultural Research ，1999，20（1）：3033（in Chinese）.2 陈鹏， 何凤仁， 钱伯林. 中国银杏的种核类型及其特征. 林业科学

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