1、高考生物微生物学实验目的与要求(生物科技行业)微生物学实验目的与要求实验五病原性球菌目的(一)掌握致病性葡萄球菌的特征;抗链球菌溶血素“O”试验;甲型链球菌与肺炎链球菌区别。(二)熟悉三种链球菌在血平板上的区分;肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌的形态特征。(三)了解病原性球菌的形态、染色性。内容(一)病原性球菌的形态及染色性(示教)。(二)葡萄球菌培养及生化特性(示教)。(三)致病性葡萄球菌的鉴定(操作)。(四)链球菌的培养与抗链球菌溶血素“O”试验(示教与操作)。(五)肺炎链球菌与甲型链球菌的区别(示教)。(六)脓汁或咽拭子分离培养(操作)。一、病原性球菌的形态及染色性(示教)1葡萄球菌的形态及染色
2、性(示教)【材料】金黄色葡萄球菌革兰染色示教片。【方法】油镜观察细菌的形态、排列及染色性。2链球菌的形态及染色性(示教)【材料】乙型链球菌血清肉汤培养物制作的革兰染色示教片。【方法】油镜观察链球菌的形态、大小、排列及染色性。3肺炎链球菌的形态结构及染色性(示教)【材料】肺炎链球菌革兰染色示教片、肺炎链球菌荚膜示教片。【方法】油镜观察二张示教片中肺炎链球菌的形态结构特点及其染色性。4脑膜炎奈瑟菌的形态及染色性(示教)【材料】脑膜炎奈瑟菌革兰染色示教片。【方法】油镜观察注意形态、大小、排列以及染色性。5淋病奈瑟菌的形态及染色性【材料】淋病性尿道、阴道脓汁涂片(革兰染色)。【方法】油镜观察细菌形态、
3、排列、在细胞内或外及染色性。二、葡萄球菌培养及生化特性(示教)【材料】1金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌血琼脂平板培养物2金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌甘露醇管【方法】1取金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的血琼脂平板培养物,观察二种葡萄球菌单个菌落的形态、大小、表面、边缘、透明度、颜色及溶血性(如颜色不易区别时,可用滤纸片揩抹菌落观察)。2取金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的甘露醇发酵管,观察二者对甘露醇的分解情况。三、致病性葡萄球菌的鉴定致病性葡萄球菌的鉴定,一般实验室都根据以下特征,其中尤以血浆凝固酶试验意义最大。1产生金黄色色素。2对家兔或羊红细胞有溶血作用。3分解甘露醇,产酸不产气。4血浆凝固酶试验
4、阳性。5耐热DNA酶试验阳性。血浆疑固酶试验:试管法(示教)【材料】见实验四。【方法】见实验四耐热DNA酶试验(示教)【原理】致病性葡萄球菌能产生DNA酶,它可特异地分解DNA的磷酸戊糖联结的磷酸二酯键;且有明显耐热性,经18015分钟或602小时也不灭活。此酶最适pH9.0,在含DNA基质的琼脂一Tris缓冲液中(PH9.0),随DNA被分解指示剂甲苯胺蓝从蓝色变粉红色。【材料】经100煮沸15分钟后的金黄色葡萄球菌,表皮葡萄球菌24小时液体培养物;甲苯胺蓝-DNA-琼脂(PH9.0)。【方法】1取装有3ml甲苯胺蓝-DNA-琼脂培养基的小试管置沸水浴中溶化,浇小玻片一块(琼脂全部用完),待
5、琼脂冷却凝固后,以3mm直径打孔器打2个孔。2用无菌滴管吸取加热冷却后的金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌菌液,加人不同的小孔中,置37培养23小时后观察结果。3凡小孔周围出现透明粉红色小圈者为阳性,小孔周围仍为蓝色不透明者为阴性。注:指示剂甲苯胺蓝在酸性中呈红色,在中性或弱碱性溶液中呈蓝色。四、链球菌的培养与抗链球菌溶血素“O”试验(一)培养特性(示教)【材料】甲、乙、丙三型链球菌血琼脂平板及乙型链球菌10兔血清肉汤培养物。【方法】1观察三种链球菌在血琼脂平板上的菌落形态,注意其大小、表面、透明度及溶血情况。2观察链球菌在10兔血清肉汤中生长情况(混浊、沉淀、表面生长)。(二)抗链球菌溶血素“O”
6、(ASO)试验(操作)【原理】链球菌侵人体内可释放溶血素“O”(SO),它刺激机体产生相应抗体(ASO)。试验时先以溶血素“O”与病人血清混匀产生中和反应,再加入SO乳胶试剂,若病人血清中ASO量很多,未被中和掉的抗体则与乳胶试剂反应,产生清晰凝集,是为阳性;反之为阴性,故本试验属体外中和反应,观察到的现象为间接凝集。【材料】8单位/毫升链球菌溶血素“O”,l:15病人血清,链球菌溶血素“O”乳胶试剂,黑底玻片,滴管,对照(正常)血清。【方法】1取已稀释的病人血清与正常血清各一滴,分别滴于玻片的两侧,然后于两侧各加一滴8单位/毫升链球菌溶血素“O”,晃摇或用牙签混匀2分钟,使其充分混匀。2于上
7、述混合液中各加一滴乳胶试剂,晃摇或用牙签混匀3分钟,使其充分混匀。3立即观察结果:(1)有清晰凝集者为阳性,血清滴度500单位/毫升。(2)无凝集者为阴性。“注”:若需进一步测定其血清滴度,用生理盐水将阳性血清再作对倍稀释,再按第2项进行实验,若仍呈清晰凝集时,则血清滴度800单位/毫升。五、肺炎链球菌与甲型链球菌的区别(示教)(一)培养特性(示教)【材料】肺炎链球菌及甲型链球菌血琼脂平板培养物【方法】观察并比较两种细菌菌落的大小、形态及溶血性等。(二)菊糖发酵试验(示教)【材料】肺炎链球菌及甲型链球菌菌落,菊糖发酵管。【方法】1挑取肺炎链球菌及甲型链球菌菌落分别接种于菊糖发酵管中,37培养1
8、024小时。2观察两种细菌在葡糖管中生长后的情况,以溴甲酚紫变色与否作为是否发酵菊糖的判断依据。(三)胆汁溶菌试验(示教)【材料】肺炎链球菌及甲型链球菌血清肉汤培养液18小时生长物,去氧胆酸钠溶液,干燥小试管,1毫升无菌吸管、试管架、生理盐水、37水浴。【方法】1取洁净小试管4支,标明1、2、3、4。于第一及第二管内各加入0.2毫升牛胆汁或10%胆盐溶液,第三及第四管中各置0.2毫升生理盐水。2用一吸管取0.8亳升肺炎链球菌血清肉汤培养液置于第一管,再吸取0.8毫升至第三管。用另一吸管吸取0.8毫升甲型链球菌血清肉汤培养物于第二管;又0.8毫升于第四管,混匀后置37水浴箱中15分钟到一小时,取
9、出观察,若液体变清即为胆汁溶菌阳性,否则为阴性。六、脓汁或喉拭子分离培养(操作)【材料】1标本:脓汁或喉拭子。2培养基:血琼脂平扳、甘露醇发酵管、菊糖发酵管。3兔血浆、生理盐水、毛细滴管、吸管、小试管、试管架、革兰染液、玻片。【方法】1将脓汁或喉拭子作涂片(注意先分离培养,后作涂片,避免污染),革兰染色后镜检,观察细菌形态、排列及染色性。2将脓汁或喉拭子材料接种血琼脂平板,置37培养1824小时。3根据菌落特点及涂片检查结果,作出初步判断,必要时再作进一步鉴定。(1)若菌落中等大小、完全溶血、不透明、产生金黄色色素、涂片革兰染色阳性,葡萄状排列,可能是金黄色葡萄球菌,可进一步做血浆凝固酶试验和
10、甘露醇发酵试验,确定其致病力。(2)若菌落较小、半透明、完全溶血、涂片革兰染色阳性、大都呈链状排列,为乙型链球菌。(3)若菌落较小、半透明、绿色不完全溶血环,涂片革兰染色阳性、呈短链状排列,为甲型链球菌或肺炎链球菌,需要进一步鉴别,可作胆汁溶菌和菊糖发酵试验。学生通过判别做进一步的实验(甘露醇发酵和菊糖发酵试验)。将接种后的甘露醇发酵管和菊糖发酵管放入37孵箱。附录:血琼脂平板培养基:加热融化pH7.6的肉汤琼脂培养基100毫升,冷至4550时,以无菌操作加入脱纤维的兔血或羊血510毫升。摇匀后倾注平板,冷凝后即成。37孵誉24小时,无菌生长,即可使用。血琼脂平板是营养培养基,因血液内含多种营养物质,可促进营养要求较高的细菌的生长。血琼脂平板也可用来检测细菌的溶血性。血液不耐热,故需待琼脂稍冷后才能加入。
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