酶工程复习材料.docx

1、酶工程复习材料 1. 酶生物合成的模式有哪些？哪一种模式较为适合生产的需要？对于其他的合成模式，应如何调节发酵的条件以使其更为趋近于最佳的模式？酶生物合成的模式同步合成型延续合成型中期合成型滞后合成型同步合成型概念：酶的合成与细胞生长同步进行。当细胞进入对数生长期，酶大量产生，细胞生长进入稳定期后，酶的合成随之停止。特点：属于这种类型的酶，其生物合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和产物阻遏作用。延续合成型概念：酶的合成伴随着细胞的生长而开始，但在细胞生长进入平衡之后，酶还可以延续合成较长的一段时间。特点：这种类型的酶可受诱导但不受分解代谢物阻遏和产物阻遏，其对应的mRNA是相当稳定的。中期合成

2、型概念：酶的合成在细胞生长一段时间以后开始，而在细胞进入平衡期后，酶的合成也随着停止。特点：酶的合成受到反馈阻遏，而且其所对应的mRNA 是不稳定的。滞后合成型概念：只有当细胞生长进入平衡期后，酶才开始合成并大量积累。特点：酶的合成受到分解代谢物阻遏作用。 在酶工程生产中为了提高酶的生产率，延长酶的发酵生产周期，酶最理想的生物合成模式应为部分生长偶联型（延续合成型），因为这类酶在发酵过程中没有明显的生长期和产酶区的区别，随细胞生长即有酶的产生，直到细胞生长进入平衡期之后酶还可以合成。对于其他型的酶，要提高酶产率，可以再细胞选育上，工艺条件等方面加以条件控制。对于同步合成型的酶，可以采用适当的生

3、产工艺，如降低发酵温度以尽量提高其对应的mRNA的稳定性；对于滞后合成型的酶，在发酵过程中应设法尽量减少甚至借出分解代谢物阻遏，使酶的合成提早开始, 控制葡萄糖等易利用碳源, 添加一定量的cAMP；对于中期合成型的酶，则要在提高mRNA稳定性和解除阻遏两方面进行。控制末端产物浓度,添加末端产物类似物2. 试以基因调节控制理论说明酶生物合成的分解代谢物阻遏作用、诱导作用及反馈阻遏作用的原理。 基因调节控制理论-操纵子学说分解代谢物阻遏作用是指容易利用的碳源阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象酶生物合成的诱导作用是指加进某种物质，使酶的生物合成开始或加速进行的过程酶合成的反馈阻遏作用是指酶催化

4、作用的产物或代谢途径的末端产物使该酶的合成受阻的过程3. 何为酶电极、酶标免疫测定？酶标免疫测定是指在放射免疫测定的基础上发展起来的一种分析方法，它是将酶作为标记物质，使之和抗原（或抗体）结合形成酶与抗原（或抗体）复合物，然后再根据待测抗体（或抗原）与复合物专一且定量的结合关系，通过测定与待测抗体（或抗原）结合的酶的活力，从而计算出待测抗体（或抗原）的量。酶电极是最早问世的生物传感器，它是把测定无机离子或低分子量气体的电化学器体（如离子选择性电极或气敏电极）与酶固定化技术相结合而产生的传感器，使原来仅有测量物理量功能的电极具备了测量生物化学量的功能，它在生物试样化学成分的检测方面具有良好的选择

5、性和较强的特异性。4. 试以米氏方程说明酶法分析、酶活测定的原理。 酶活力测定（Enzyme Assay）分析对象 酶一般常测定酶促反应的初速度以确定酶活力。酶单位：1961 年，国际生化联合会酶委员会建议，一个酶单位为在确定的最适反应条件下，每分钟催化1 ml分子底物变化所需要的酶量。测定原理:酶法分析（Enzyme Analysis ）分析工具 酶（酶免分析、酶电极）原理：米氏方程：当s 2m微滤：颗粒直径0.2 m 2 m 分离细菌、灰尘2膜分离技术：超滤：颗粒直径20 0.2 m 分离不同分子量的物质反渗透：颗粒直径20 分离各种离子与小分子物质粗滤可分为常压过滤、加压过滤、减压过滤。

6、为了加快过滤速度，提高分离效果，经常需要添加助滤剂。常用的有硅藻土、活性炭、纸粕等。膜分离：加压膜分离；电场膜分离（电渗析、离子交换膜电渗析）；扩散膜分离（透析）：用于酶、蛋白质等大分子的浓缩与脱盐。脱盐可以超滤、透析（扩散膜分离）以及层析法进行脱盐。浓缩酶的浓缩有五种方式：蒸发浓缩、胶过滤浓缩、超滤浓缩、反复冻融浓缩、聚乙二醇浓缩法9.层析的主要方法，简述疏水作用层析、离子交换层析等各种层析方法分离酶蛋白的原理。层析是利用混合物中各组分的物理化学性质（分子的大小、形状、分子极性、吸附力、分子亲和力和分配系数等）的不同，使各组分在层析的固定相和流动相之间的分布程度不同而得到分离，又称为色谱分离

7、。凝胶层析概念：又称“分子筛、体积排阻色谱”，是根据溶质分子量的大小不同而进行分离的一种相色谱技术。离子交换层析概念：是利用离子交换剂上的可解离基团对各种离子的亲和力不同，而使不同的蛋白质组分得以分离的方法。原理：离子交换层析是利用电荷间相互作用使不同蛋白质得以分离疏水层析吸附层析概念：是利用吸附剂对不同酶蛋白的吸附力不同，而使混和液中的各种蛋白质得以分离的方法。原理：表面积较大的吸附剂，在低PH、低离子强度下吸附，在提高PH、增加离子强度的条件下解吸。亲和层析概念：是利用生物分子对之间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的技术。酶与底物，酶与竞争性抑制剂，酶与辅酶之间即是具有专一

8、而又可逆的亲和力的分子对反相色谱和疏水作用色谱10.纯化表的计算及纯化工艺优劣的评价。11.酶的固定化：概念、方法及固定化工艺优劣的评价。通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用的技术。固定化酶(immobilized enzyme)固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。固定化细胞（immobilized cell）固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。1.吸附法依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作用，使酶吸附于惰性固体的表面或离子交换剂上。1）物理吸附法（physical adsortion）作用力：氢键

9、、疏水键常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素等。2）离子结合法（ion binding）作用力：离子键常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素优点：条件温和，操作简便，酶活力损失少。缺点：结合力弱，易解吸附。2.共价偶联法借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联。优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性3.交联法（crosslinking）借助双功能试剂使酶分子之间发生交联的固定化方法。双功能试剂：常用的是戊二醛,戊二醛有两个醛基，均可与酶或蛋白质的游离

10、氨基反应,使酶蛋白交联。此法与共价偶联法利用的均是共价键，不同之处：交联法不使用载体。交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保持溶解状态。 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为不溶态。优点：酶与载体结合牢固，不易轻易脱落，可连续使用。缺点：(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便4. 包埋法（entrapment）将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚物）内。分为：网格型：将酶包埋在高分子凝胶细微网格中。微囊型：将酶包埋在高分子半透膜中。与网格型包埋法相比，微囊型包埋法的优点：1）固定化酶颗粒

11、小，有利于底物和产物扩散。2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。缺点：反应条件要求高,制备成本也较高。包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，与其它固定化方法相比：优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。112.何为盐析沉淀、酶的分子修饰、等电聚焦电泳。盐析沉淀盐析沉淀是利用在弄一浓度盐溶液中，不同的蛋白质和酶的溶解度各不相同的原理，对酶蛋白进行分离的方法。原理：对于含有多种蛋白质或酶的混合液，可以采用分段盐析的方法进行分离纯化。因为在某一浓度

12、的盐溶液中，不同的蛋白质和酶的溶解度各不相同，故可达到彼此分离的目的。酶的分子修饰通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质等电聚焦电泳概念：在电泳系统中加入两性电解质载体，通以直流电后，两性电解质即在电场中形成一个由阳极到阴极连续增高的PH梯度。当蛋白质、多肽或酶进入这个体系时，不同的蛋白质即移动到与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的蛋白质得以分离。良好的载体两性电解质必备的条件13.对于未知蛋白的分离，如何选择恰

13、当的离子交换层析的介质？14.酶的分子修饰的方法有哪些？如何运用蛋白质工程的方法来改造天然的酶分子？分子修饰通过各种方法使酶的分子结构发生某些改变，从而改变了酶的某些特性和方法，以提高酶的活力，增加酶的稳定性，消除或降低酶的抗原性等的过程，称之。蛋白质工程蛋白质高级结构预测利用分子生物学技术方法改造酶蛋白一级结构,进而改造其高级结构酶分子的修饰方法金属离子置换修饰,大分子结合修饰(共价/非共价)侧链基团修饰肽链有限水解修饰氨基酸置换修饰酶分子的物理修饰利用基因工程技术定向改造酶蛋白的结构基因定点诱变（ Site-directed mutagenesi s）PCR 诱变（PCR mutagene

14、sis）15.何为酶反应器？酶反应器的种类及适用范围，如何保持酶反应器稳定的生产能力。用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。按结构区分搅拌罐式反应器（Stirred Tank Reactor, STR）鼓泡式反应器(bubble column reactor, BCR )填充床式反应器(packed column reactor, PCR )流化床式反应器( Fluidized Bed Reactor, FBR)膜反应器(Membrane Reactor, MR)按操作方式区分分批式反应(batch )连续式反应(continuous )流加分批式反应(fed batch )混合形

15、式连续搅拌罐反应器（Continuous Stirred Tank Reactor, CSTR）分批搅拌罐反应器（Batch Stirred Tank Reactor, BSTR）在应用游离酶进行催化反应时，酶与底物均溶解在反应溶液中，通过互相作用，进行催化反应。可以选用搅拌罐式反应器、膜反应器、鼓泡式反应器、喷射式反应器等。通常颗粒状、片状、膜状或纤维状固定化酶均可采用填充床反应器（PBR），而颗粒状、粉末状及片状固定化酶均可使用于连续式搅拌罐（CSTR），膜状固定化酶要用螺旋卷膜式反应器。可溶性底物适用于所有的反应器。难溶底物或者底物溶液呈胶体状者，易堵塞柱床，可选用FBR。颗粒状底物溶液可适用于CSTR。当反应过程需要控制温度、调节pH时，选用CSTR更为方便。