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1、专业实习报告 南通大学生物技术专业班级：生物技术112 姓名：孔月 学号：1109051054 实习报告 目录一 序言 1二 实习目标 2三 公司简介 2四 内容 34.1 CIK细胞制备培养与研究 34.2 培养原理 54.3 细胞制备 64.4步骤简图与推荐试剂 8五 实习体会 9 一. 序言毕业实习是大学生大学学习阶段的重要实践环节，它是与今后的职业生活最直接联系的，我们学生在生产实习过程中将完成学习到就业的过渡，因此实习活动是培养技能型人才，实现培养目标的主要途径。它不仅是校内教学的延续，而且是校内教学的总结。可以说，没有生产实习，就没有完整的教育。作为新世纪的大学生，在注重理论知识学

2、习的前提下，首先要提高生产实习管理的质量。生产实习教育教学的成功与否，关系到学校的兴衰及我们的就业前途，也间接地影响到现代化建设。我于2014.7.3-2014.8.30到南通市科尔生物科技有限公司实习，收获颇丰。2. 见习目标1、通过深入各实习岗位进行综合性的实习，将所学的基础理论、基础知识和基本技能运用于实践之中，将所学的知识转化为能力，培养实际工作能力、科研能力。2、掌握现代生物技术手段与运用能力，训练实际操作技能。3、了解校外科研机构的实际工作情况，尤其是与所学专业相关的学科如生物学、化学、医学药学等学科的研究情况和前沿状况。4、从实际出发，检验自己在态度、知识、能力、技能等四项指标方

3、面所达到的程度。5、了解CIK细胞培养及作用原理。6、熟练掌握细胞培养的各项操作技能,并注意观察与记录。7、积极交流，开阔专业视野,并做好实验室卫生打扫。三、公司简介南通科尔生物技术有限公司位于南通市太阳鑫城大厦2幢156室,主要提供生物技术的研发,化妆品,防护用品,生化试剂(不含化学危险品和有毒品)的研发,销售等产品和服务。4、内容4.1 CIK细胞培养制备与研究 CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-Induced Killer，CIK)是一种新型的免疫活性细胞，CIK增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。由于该细胞同时表达 CD3 和 CD56 两种膜蛋白分子，

4、故又称为NK 细胞（自然杀伤细胞）样 T 淋巴细胞，兼具有 T 淋巴细胞强大的抗瘤活性，和 NK 细胞的非 MHC 限制性杀瘤优点。该细胞对肿瘤细胞的识别能力很强，如同 “ 细胞导弹 ” ，能精确 “ 点射 ” 肿瘤细胞，但不会伤及 “ 无辜 ” 的正常细胞。尤其对手术后或放化疗后患者效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发，提高机体免疫力，因此， CIK 细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。4.1.1 CIK细胞特点 ：1、增殖能力强，主要效用细胞CD3+CD56+ 可增殖1000倍；2、杀伤活力强，远优于传统的LAK细胞和细胞因子干扰素、白细胞介素2等；3、

5、杀瘤谱广，不受MHC限制，具有广谱杀肿瘤和病毒的作用，对多重耐药肿瘤细胞仍敏感，杀瘤活性不受环孢素A（CsA）和FK506等免疫抑制剂的影响，能抵抗肿瘤细胞引发的效应细胞Fas-FasL凋亡。4、毒副作用小，无严重不良反应。4.1.2 CIK细胞治疗技术的优势:1、可有清除手术、放化疗 后残余的癌细胞及微小病灶，预防肿瘤的复发和转移；2、可与放、化疗联合使用，能降低放化疗的毒副作用的感染率，提高放化疗的疗效；3、可用于放、化疗无效的患者，或对化疗药物产生耐药性的患者的治疗；4、对于失去手术机会或已复发转移的晚期肿瘤患者，能迅速缓解其临床症状，延长生存期；大部分患者出现瘤体减小甚至消失或长期带瘤

6、生存的治疗效果；5、由于CIK细胞具有免疫调节和体细胞修复作用，在治疗肿瘤的同时，大部分患者尤其是放化疗后的患者，可出现消化道症状减轻或消失，皮肤有光泽，黑斑淡化，静脉曲张消失，脱发停止甚至头发生长或白发变黑等“年轻化”表现，及精神状态或体力明显恢复等现象，从而提高肿瘤患者的生存质量，延长生存期。4.2 培养原理CIK培养用细胞因子和抗体：4.2.1 nCD3激发型单抗：T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T

7、细胞表面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶(Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇途径或MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(

8、如IL-2和IFN-g等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺激所有人的T细胞的增殖，而

9、其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。4.2.2 nIL-2 (白细胞介素-2)IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。4.2.3 nIFN-g (干

10、扰素-g)IFN-g 具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN- g ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-g加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相关。先加入IFN- g，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。4.2.4 nIL-1a(白细胞介素-1a)IL-1a也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1a与IFN-g和激发型CD3单抗合用时，可以明显提高CIK 的细胞毒作用。4.3 细胞制备4.3.1 细胞采集外周血单个核细胞的采集用血细胞分离机采集患者自身的

11、外周血单个核细胞50-100mL；淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)；无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC。4.3.2 CIK细胞的培养及鉴定将PBMC按1-2 x 106/ml的浓度悬浮于无血清培养液中，加入1,000 U/ml 的重组人IFN-g，37oC，5%CO2培养箱中培养；24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1a。每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；在培养的第14d，收获CIK细胞

12、。4.3.3 CIK细胞质控：台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%以上。细胞杀伤实验：以CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按10 : 1(数目比) 的比例加入96 孔U 型板中，每孔含靶细胞1 x 104个，终体积为200 ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病原学检测阴性，内毒素5 Eu)

13、。4.4 步骤简图及推荐试剂5、实习体会 通过此次实习，让我学到了很多课堂上更本学不到的东西，仿佛自己一下子成熟了，懂得了做人做事的道理，也懂得了学习的意义，时间的宝贵，人生的真谛。明白人世间一生不可能都是一帆风顺的，只要勇敢去面对人生中的每个驿站！这让我清楚地感到了自己肩上的重任，看清了自己的人生方向，也让我认识到了科研工作应支持仔细认真的工作态度，要有一种平和的心态和不耻下问的精神，不管遇到什么事都要总代表地去思考，多听别人的建议，不要太过急燥，要对自己所做事去负责，不要轻易的去承诺，承诺了就要努力去兑现。单位也培养了我的实际动手能力，增加了实际的操作经验，对实际的研究工作的有了一个新的开

14、始，更好地为我们今后的工作积累经验。我知道工作是一项热情的事业，并且要持之以恒的品质精神和吃苦耐劳的品质。我觉得重要的是在这段实习期间里，我第一次真正的融入了社会，在实践中了解社会掌握了一些与人交往的技能，并且在次期间，我注意观察了前辈是怎样与上级交往，怎样处理之间的关系。利用这次难得的机会，也打开了视野，增长了见识，为我们以后进一步走向社会打下坚实的基础。非常感谢学校能提供这次的实习机会，也很感谢刘东老师在我整个实习期间对我的悉心指导，让我学到了很多，受益匪浅。实习期间，我从未出现无故缺勤。我勤奋好学. 谦虚谨慎，认真听取老同志的指导，对于别人提出的工作建议虚心听取。并能够仔细观察、切身体验、独立思考、综合分析，并努力学到把学样学到的知道应用到实际工作中，尽力做到理论和实际相结合的最佳状态，培养了我执着的敬业精神和勤奋踏实的工作作风。也培养了我的耐心和素质。能够做到服从指挥，与同事友好相处，尊重领导，工作认真负责，责任心强，能保质保量完成工作任务。并始终坚持一条原则：要么不做，要做就要做最好。