食品中过敏原成分环介导等温扩增LAMP检测方法第10部分羽扇豆编制说明.docx

1、食品中过敏原成分环介导等温扩增LAMP检测方法第10部分羽扇豆编制说明食品中过敏原成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法 第10部分：羽扇豆编制说明1 基本信息1.1 标准草案名称中文食品中过敏原成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法 第10部分：羽扇豆英文Loop-mediated isothermal amplification detection method for allergen components in food Part 10:lupin1.2 与国际标准和国外先进标准一致程度情况等同修改非等效标准号/英文名称/中文名称/1.3 任务来源批准立项的文件名称和文件号关于下达20

2、12年第一批出入境检验检疫行业标准制（修）订计划项目的通知（国认科201236号）计划编号2012B1411.4 制（修）订情况制订修订替代的标准编号/1.5 起止时间2012年01月2013年09月1.6 起草单位中国检验检疫科学研究院，中华人民共和国上海出入境检验检疫局，中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局，中华人民共和国山东出入境检验检疫局，中华人民共和国北京出入境检验检疫局，上海迪澳生物技术有限公司等。1.7 起草人张舒亚、印丽萍、陈颖、曹际娟、韩建勋等1.8 专业类别1、食品（化妆品）检验；2、卫生检疫；3、动物检疫；4、植物检疫；5、纺织产品检验；6、轻工产品检验；7、机电产品检验；

3、8、化工、矿产品和金属材料检验；9、管理；10、鉴定；11包装及危险化学品1.9 标准体系表代码1.10 调整情况2 背景情况2.1 目的、意义食物过敏是最近几年日益被关注的一个食品安全问题。引起食物过敏的食物种类即过敏原（又称为致敏原）主要有8种，包括大豆、花生、鱼、牛乳、鸡蛋、甲壳类水产动物、坚果以及大豆。其中大豆、鱼、牛乳、鸡蛋等是食物蛋白的主要来源之一。随着全球经济一体化和食品贸易国际化，食品过敏问题具有更大的潜在危险性，因此建立过敏原检测方法对于确保食品标签的一致性和消费者的安全十分必要。目前对过敏原的检测方法主要有以蛋白质为检测目标的方法和以DNA为检测目标的方法。随着分子生物学理

4、论和技术的快速发展，以聚合酶链式反应（PCR）技术为基础的各种新型鉴定技术也得到快速发展，环介导等温扩增（LAMP，Loop-mediated Isothermal Amplification）就是近些年建立并日益得到广泛应用的一种新型鉴定技术。LAMP是通过针对靶标基因的8个区域设计6条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温（63左右）条件下保温1小时左右即可完成核酸扩增的检测技术。其特点是：在恒定温度下即可完成核酸扩增，摆脱对精密仪器的依赖；需针对靶标基因设计6条引物，识别8个区域，与PCR技术相比，提高了反应的特异性；能对样品中10拷贝甚至更少的模板进行扩增，检测灵敏度高；检测方法简

5、便，可肉眼判断扩增与否；扩增速率快，可在1小时左右完成扩增。总体而言，LAMP法是一种简便、快速、高特异的基因扩增法，不需要特殊的试剂和仪器设备，采用该方法能建立起总成本低廉的检测体系，在食品检测等领域具有广阔的应用前景。2.2 与国内外相关标准、文献的关系无相同的国内外标准。SN/T1961.17-2013出口食品过敏原成分检测 第17部分：实时荧光PCR方法检测羽扇豆成分于2013年发布实施，用于过敏原羽扇豆成分的检测。3 编制过程3.1 准备阶段（可选项）/3.2 分工情况中国检验检疫科学研究院为本系列标准的牵头单位。上海出入境检验检疫局主持本标准研制和编写工作，其它单位参与。3.3 标

6、准草案编写情况2013.3-7完成标准草案的编写。3.4 征求意见情况（适用于送审稿）3.5 审定情况（适用于报批稿）3.6 预期的管理目标（适用于规程类标准）或技术指标（适用于方法类标准）4 主要技术内容的确定一、国内外相关的标准要求无。二、测定步骤1 材料黄花羽扇豆、白花羽扇豆、大豆、鹰嘴豆、扁豆、四季豆 、豌豆、白云豆、绿豆、豇豆、蚕豆、大米、玉米、燕麦、小麦、荞麦、花生、大杏仁、核桃、芹菜、胡萝卜、土豆、番茄、梨、桔子、西柚、红薯、牛奶、羊奶、鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、猪肉、草虾、三文鱼、螃蟹等36种材料购自上海市场或实验室。用于过敏原羽扇豆成分的特异性检测。羽扇豆产品（面包、蛋糕）5份，其他

7、未含羽扇豆成分的食品45份，购自上海超市，用于实际样品检测。2 主要试剂和耗材LAMP反应试剂：Bst DNA polymerase large fragment，New England Biolabs公司；甜菜碱(Betaine)、MgCl2，Sigma公司；dNTPs，宝生物工程(大连)有限公司；SYBR Green I 荧光染料，Invitrogen公司； LAMP引物(正向外引物F3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、反向外引物B3)，生工生物工程（上海）有限公司。3 主要仪器设备冰箱；离心机；LAMP实时浊度仪，LA-320C，日本荣研化学株式会社；漩涡混合器；微量移液器；分析天平

8、。4 LAMP引物的设计查阅羽扇豆相关文献，选取ITS1序列为羽扇豆特异序列，使用在线设计软件Primer Explorer version4()和LAMP Designer软件设计特异引物。外引物扩增片段长度：236 bp。上游外引物（F3），下游外引物（B3），上游内引物（FIP），下游内引物（BIP）如下： F3： GAAGCCTCACAAGCAGTGB3： TAGGATAAGCGTGTCGCA F1c F2FIP(F1c+F2)： GGACCGAGGTGCGAAACAC GACCCCGTGAATCTGTTTT B1c B2BIP(B1c+B2)： GGTGTCCTCCTGGCCTAAT

9、AAC GGGCGAACTAAACGATTTCA5 样品制备使用冷冻研磨机将羽扇豆和小麦磨成粉末状，并60 烘干6 h。用小麦粉配成羽扇豆粉含量为1%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%、0.0005%（w/w）的羽扇豆粉样品，用于过敏原羽扇豆成分的灵敏度测试。6 DNA提取及制备使用天根动物基因组提取试剂盒（天根生化科技有限公司，目录号：DP323）提取动物样品的DNA，使用植物DNA小量提取试剂盒(OMEGA公司，HPE.Z.N.A. HP Plant DNA Kit，货号D2485）提取植物样品的DNA，提取方法详见试剂盒操作说明书。使用BioPhotomete

10、r plus核酸蛋白含量测定仪（德国Eppendorf公司）测定核酸浓度。7 LAMP扩增和检测LAMP反应体系：2Reaction Mix (RM) 12.5 L，FIP和BIP各1.6 M，F3和B3各0.2 M，20 mM Tris-HCl(PH8.8)，10 mM KCl，6 mM MgSO4，10 mM (NH4)2SO4，0.1% Tween20，0.8M甜菜碱，6 mM MgSO4，1.6 mM dNTP，8 U Bst大片断DNA聚合酶，2 l DNA，用蒸馏水补足体系至25 l。63 恒温反应60 min，80 灭活5 min结束反应。通过LAMP实时浊度仪，观察扩增曲线。显

11、色法LAMP检测：产物加入SYBR Green I 荧光染料观察颜色变化，没有扩增产物的阴性管呈橙色，有扩增产物的阳性管为绿色。8 LAMP引物特异性实验对供试的36种动植物材料DNA作为LAMP反应的模板，进行LAMP反应，63运行60min，验证LAMP反应的特异性。分别以实时浊度仪和显色法法观察检测结果。9 LAMP灵敏度实验将1%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%、0.0005% 羽扇豆进行LAMP实验，以ddH2O代替DNA模板作为阴性对照，以羽扇豆DNA（100ng/L）作为阳性对照，进行LAMP扩增，63运行60min,实施浊度仪检测反应结果，以确定实

12、施浊度仪检测的LAMP检测灵敏度。将0.1%、0.001%、0.0005%、0% 羽扇豆进行显色法LAMP实验，以ddH2O代替DNA模板作为阴性对照，以羽扇豆DNA（100ng/L）作为阳性对照，进行LAMP扩增，63运行60min，以确定显色法LAMP检测灵敏度。10 LAMP稳定性实验以0.1%，0.005%，0.001%，0%羽扇豆DNA作为模板，各20个平行样品。以ddH2O代替DNA模板作为阴性对照，以羽扇豆DNA（100ng/l）作为阳性对照进行LAMP扩增，63运行60min，观察LAMP反应的稳定性。分别以实时浊度仪和显色法法观察检测结果。11 实际样品检测对市场上购买的5份

13、羽扇豆产品（面包、蛋糕），其他45份未含羽扇豆成分的食品进行检测，验证LAMP检测方法对实际样品的检出情况。以显色法LAMP检测观察结果。三、方法灵敏度要求目前国内外针对食品过敏原成分检测方法灵敏度没有统一要求。分子生物学方法灵敏度一般超过实际产品检测需求。本方法绝对检测灵敏度为10ng/mLDNA，相对灵敏度为0.01%（W/W）。四、提供的图谱1.食品过敏原羽扇豆成分特异性检测引物初筛和体系优化 初步确定25 L的LAMP反应体系，其成分包括：FIP和BIP各1.6 M，F3和B3各0.2 M，20 mM Tris-HCl(PH8.8)，10 mM KCl，8 mM MgSO4，10 mM

14、 (NH4)2SO4，0.1% Tween20，1 M甜菜碱，6 mM MgSO4，1.6 mM dNTP，8 U Bst大片断DNA聚合酶，2 l DNA物。63恒温反应90 min， 80下保温5 min结束反应，根据出峰时间及阴阳性符合率初步筛选引物。用100%的羽扇豆标准品作为模板进行引物的初步筛选，同时以阴性DNA作为阴性对照。实验结果显示该引物于30min开始出现扩增（图1）。图1 羽扇豆LAMP检测引物反应时间的实时浊度扩增图谱CH1-3：阴性对照，CH4-6：阳性对照 LAMP反应条件的优化：选取Mg2+浓度、甜菜碱浓度、dNTPs浓度和反应温度4个变量参数，进行单因素变化实验

15、。Mg2+浓度优化：设置4个Mg2+浓度梯度依次为4 mM、6 mM、8 mM、10 mM；甜菜碱浓度优化：设置4个甜菜碱浓度梯度依次为0.6 M、0.8 M、1.0 M、1.2 M；dNTPs浓度优化：设置4个dNTPs浓度梯度依次为1.2 mM、1.4 mM、1.6 mM、1.8 mM；反应温度优化：设置4个反应温度梯度依次为61、63、65、67。在反应进行时，采用浊度仪中该反应曲线的出峰时间和出峰高度作为评价的指标，对上述参数进行比较。得出最佳参数为：Mg2+浓度：6 mM；甜菜碱浓度：0.8 M；dNTPs浓度：1.6 mM；反应温度：63。根据上述数据，建立最佳反应体系，63 恒温

16、反应60 min，然后在80 灭活5 min结束反应（图2）。图2 羽扇豆LAMP检测引物体系优化的实时浊度扩增图谱CH1-2：阴性对照，CH3-4：阳性对照2. 食品过敏原羽扇豆成分LAMP特异性检测实验 使用过敏原引物对供试36种植物和动物材料进行LAMP扩增，经过LAMP实时浊度仪检测，其中黄花羽扇豆与白花羽扇豆出现明显的扩增曲线，而在其余的34种动植物样品中均未出现扩增曲线（图3）。根据食品过敏原羽扇豆成分LAMP特异性检测的实时浊度检测结果，对上述供试材料进行显色法LAMP检测，结果显示：黄花羽扇豆与白花羽扇豆反应液为绿色，其他动植物材料DNA反应液为橙色（图4）。实时浊度仪LAMP

17、检测和显色法LAMP检测结果表明该LAMP引物和反应体系具有物种特异性。 A B C DE图3 食品过敏原羽扇豆成分LAMP特异性检测的实时浊度图谱A：CH1-8依次为黄花羽扇豆、大豆、鹰嘴豆、扁豆、四季豆 、豌豆、白云豆、绿豆；B：CH1-8依次为豇豆、蚕豆、大米、玉米、燕麦、小麦、荞麦、花生；C：CH1-8依次为杏仁、核桃、芹菜、胡萝卜、土豆、番茄、梨、桔子；D：CH1-8依次为西柚、牛奶、鸡蛋、羊奶、鸭蛋、鹅蛋、鸽子蛋、猪肉; D：CH1-5依次为白花羽扇豆、草虾、螃蟹、三文鱼、阴性对照、阴性对照图4 食品过敏原羽扇豆成分LAMP特异性检测的显色法检测结果1-37依次为：黄花羽扇豆、阴性

18、对照、白花羽扇豆、大豆、鹰嘴豆、扁豆、四季豆 、豌豆、白云豆、绿豆、豇豆、蚕豆、大米、玉米、燕麦、小麦、荞麦、花生、杏仁、核桃、芹菜、胡萝卜、土豆、番茄、梨、桔子、西柚、牛奶、羊奶、鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鸽子蛋、猪肉、草虾、螃蟹、三文鱼3 过敏原羽扇豆成分的LAMP检测灵敏度将纯白花羽扇豆粉和小麦粉按重量比混合成羽扇豆含量为：1%，0.1%，0.05%，0.01%，0.005%，0.001%和0.0005%的混合样品，提取DNA后用于LAMP检测，每个浓度重复3次，以实时浊度仪记录结果。实时浊度LAMP检测结果显示，1%，0.1%，0.05%，0.01%，0.005%，0.001%羽扇豆均出现扩增

19、曲线，0.0005%羽扇豆未出现扩增曲线，该检测方法的检测限为0.001%（图5）。根据食品过敏原羽扇豆成分LAMP灵敏度检测的实时浊度检测结果，利用LAMP显色法对0.1%羽扇豆，0.001%羽扇豆，0.0005%羽扇豆和0%羽扇豆样品进行检测。LAMP显色法检测结果显示，0.1%羽扇豆，0.001%羽扇豆出现颜色反应，0.0005%羽扇豆未出现颜色反应，该检测方法的检测限是0.001%（图6）。图5 食品过敏原羽扇豆成分LAMP灵敏度检测的实时浊度图谱CH1：1%羽扇豆；CH2：0.1%羽扇豆；CH3：0.05%羽扇豆；CH4：0.01%羽扇豆；CH5：0.005%羽扇豆；CH6：0.00

20、1%羽扇豆；CH7：0.0005%羽扇豆;CH8：阴性对照图6 食品过敏原羽扇豆成分LAMP灵敏度检测的显色法检测结果1-3：0%羽扇豆；4-6：0.0005%羽扇豆，7-9：0.001%羽扇豆，10-12：0.1%羽扇豆；13：阳性对照；14：阴性对照4 过敏原羽扇豆成分的LAMP检测方法的稳定性实验用0.1%的羽扇豆、0.001%的羽扇豆品进行实时浊度LAMP检测，每个样品重复20次。实时浊度LAMP检测实验结果显示，该检测方法对于0.1%的羽扇豆、0.001%的羽扇豆样品均出现稳定扩增，该检测方法稳定性良好（图7、图9）。对0.1%的羽扇豆、0.001%的羽扇豆样品进行显色法LAMP检测

21、，每个样品重复20次。检测结果表明，分别20个0.1%的羽扇豆、0.001%的羽扇豆样品均出现颜色反应，该检测方法稳定性良好（图8、图10）。 A BC图7 0.1%羽扇豆LAMP检测的实时浊度稳定性检测图A:CH1：阳性对照，CH2：阴性对照（超纯水），CH3-8：0.1%羽扇豆模拟样品;B:CH1-8为0.1%羽扇豆模拟样品；C：CH1-6为0.1%羽扇豆模拟样品图8 0.1%羽扇豆LAMP检测的显色法稳定性检测图1：阳性对照，2：阴性对照，3-22：0. 1%模拟样品 A BC图9 0.001%羽扇豆LAMP检测的实时浊度稳定性检测图A：CH1：阳性对照，CH2：阴性对照，CH3-6：0

22、.001%羽扇豆样品；B：CH1-8为0.001%羽扇豆样品；C：CH1-8为0.001%羽扇豆样品 图10 0.001%羽扇豆LAMP检测的显色法稳定性检测图1：阳性对照，2：阴性对照，3-22：0.001%模拟样品5食品中羽扇豆原成分LAMP检测的应用在市场上收集含有羽扇豆成分的制品（羽扇豆粉、蛋糕、面包、披萨等）5份，其他未含羽扇豆成分的食品（面粉、面包、蛋糕、皮萨饼、肉肠、果酱、饺子、饮料等）45份。用新建立的检测方法对这50个样品进行显色法LAMP检测， 5个标识含有羽扇豆成分样品的检测结果与样品标签标识相符，在45个未标识含有羽扇豆成分的样品中未检出羽扇豆成分。6结论 该研究建立了

23、食品过敏原羽扇豆成分LAMP快速检测方法，方法的灵敏度高，检测限可达到0.001%羽扇豆；方法特异性强，与对照组34种样品无交叉反应，操作步骤简单，检测时限短，结果判断准确，该检测方法的建立，对于加强食品过敏原标识管理，改进食品安全，保护消费者利益具有重要意义。 5 验证情况（适用于方法类标准）5.1 验证单位情况验证单位验证人员验证时间厦门局陈双雅2013年7月8日福建局邵碧英2013年7月8日天津局张霞2013年7月8日上海交通大学邹华松2013年7月8日上海大学李平2013年7月8日5.2 验证过程采用上海出入境检验检疫局提供的引物、实验材料及实验方法，分为4部分验证：1、稳定性实验取阳

24、性羽扇豆1-5号的DNA作为模板进行LAMP检测方法进行等温扩增反应，共进行3次实验，并对实验结果进行判断。2、灵敏度验证用绿豆粉配制成羽扇豆粉含量为10%、2%、0.5%、0.1%、0.01%和0%（W/W）的羽扇豆粉样品，用于灵敏度测试。3、特异性验证羽扇豆、绿豆、小麦、玉米、花生、大豆、赤豆、牛乳、鸡蛋、鱼、虾等常见食品原料，用于过敏原羽扇豆成分的LAMP特异性检测。5.3 验证数据分析1、稳定性实验结果分析LAMP检测方法对同一样品的3次检测结果一致，并与实时荧光PCR检测结果相符，具有良好的稳定性。2、灵敏度检测LAMP检测方法对0%、0.01%、0.1%、0.5%、2%和10%羽扇

25、豆含量的模拟样品LAMP检测结果均与样品实际转基因情况相符，并与实时荧光PCR检测结果相符。3、特异性实验结果分析LAMP检测方法所有样品进行检测时，没有出现交叉反应，检测结果与实时荧光PCR检测结果相符，具有良好的特异性。5.4 验证评价验证实验表明，上海检验检疫局提供的LAMP检测方法对过敏原羽扇豆成分的特异性具有很好的稳定性和特异性，灵敏度达到0.01%。该方法具有快速、简便、灵敏的特点，无需使用大型仪器设备，适用于食品中羽扇豆过敏原成分的快速筛查检测，适合在基层实验室推广应用。5.5 其他应说明的情况无。6 附加说明（可选项）6.1 宣贯标准的建议6.2 修订和废除现行有关标准的建议6.3 作为强制性标准或推荐性的建议6.4 其他需要说明的情况6.5 参考文献联系人张舒亚联系电话电子邮箱注1：本模版表的共性部分为第1章、第2章、第4章和第6章。注2：3.4适用于标准草案送审稿，3.5适用于标准草案报批稿，3.6中预期的管理目标适用于规程类标准，3.6中技术指标适用于方法类标准，第5章适用于方法类标准编制说明的编写。注3：3.1和第6章为可选项，其余为必填项。编写日期：2013年7月19日