重金属镉对小麦苗期生长的影响.docx

1、重金属镉对小麦苗期生长的影响1 引言重金属是具有潜在危害的重要污染物。重金属不能被微生物分解,相反重金属离子可以在生物体富集,并且生物体能够将某些重金属转化为毒性更强的金属有机化合物,因此重金属的环境污染问题日益受到人们关注。在污染环境的诸多重金属中,镉的毒性较强1。环境中的镉来源归于自然和人为两大来源,前者主要来自岩石和矿物中的本底值。后者的主要来源有工业含镉废水的排放和农业上含镉磷肥的施用2。重金属在植物体积累到一定数量时,就会影响植物对营养元素的吸收、蒸腾作用、光合作用、呼吸作用等正常生理活动,改变植物细胞的超微结构，对植物造成伤害甚至引起植物死亡3。镉在作物中，特别是在可食部位的大量积

2、累,可以通过食物链危害人和动物。人体也有长期积累镉的特性, 而且镉在人体代谢周期很长,长期食用高镉含量的食物，可以引起人体多种疾病4，5。20世纪60年代,在日本的富山县神通川流域，由于铅锌冶炼厂排放的含镉废水污染水稻田,居民长期食用含镉稻米和含镉水而造成镉中毒,镉进入人体后破坏人体骨骼系统, 使骨质变脆易折,也就是所谓的“骨痛病”6。据统计，我国仅镉污染的农田就超过上万公顷，而且还有上升的趋势7。2 材料和方法本实验选用的小麦为淮麦18，各处理用含镉0.05mmol/l，0.1mmol/l，0.2mmol/l，0.3mmol/l的Hoagland培养液培养，对照用不含镉的Hoagland培养

3、液培养。选择饱满健康的种子，用自来水漂洗数次后，用NaClO消毒，再用蒸馏水清洗数次，浸种24小时。然后铺在细沙上催芽，保持湿润，等第一片真叶抽出后，选取生长健壮，大小一致的幼苗分盆移栽。用不含镉的培养液培养。第二片真叶抽出后，镉处理分别用含镉的培养液培养。毒害5天后测各项指标,以后每隔5天测一次。2.1 测定方法根系活力测定：TTC法。制作含TTF25g、50g、100g、150g、200g的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。称取小麦根尖样品0.5g，放入10ml试管中，加入0.4TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液，在37下暗

4、保温13h，加入1mol/L硫酸2ml，以停止反应。（与此同时做一空白实验）。把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯34ml和少量石英砂一起在研钵磨碎，提出TTF。红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二、三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。四氮唑还原强度（mg/g(根鲜重)/h）四氮唑还原量（mg）/根重（g）时间(h)8。叶绿素测定：96乙醇法。称取剪碎的新鲜样品0.2g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及23ml96乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3

5、5min。把提取液过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯。以96乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度8。过氧化氢酶活性：高锰酸钾滴定法测定。酶活性用每克鲜重样品1Min分解H2O2的毫克数表示：酶活(MggMin)（A-B）VT1.7/（FWV1t）式中:A:对照KMnO4滴定毫升数(Ml)；B:酶反应后KMnO4滴定毫升数(Ml)；VT:酶液总量(Ml)；V1:反应所用酶液量(Ml)；W:样品鲜重(

6、g)；1.7:1Ml 0.1MolL的KMnO4相当于1.7MgH2O28。丙二醛含量测定：硫代巴比妥酸法。取样品0. 5 g置预冷的研钵中加5mL 0. 05mo l/L pH7.8磷酸缓冲液, 研磨成浆,匀浆于1500xg离心15 min, 上清液用作SOD活性及脂质过氧化测定。将1.5mL上述提取液加入2.5mL 0.5%的硫代巴比妥酸的三氯乙酸(TCA )溶液,于沸水中加热30min 后迅速冷却, 在5000 xg下离心10min, 测OP532, 减去600nm下非特异吸收值, 用EmM(532- 600) = 155 L算MDA 含量, 以mol/gFW 表示9。细胞膜透性：选取小

7、麦一定部位上生长叶龄相似的叶子若干，剪下后，先用纱布拭净，称取二份，各重2g。 蒸馏水冲洗二次，并用洁净滤纸吸干。然后剪成长约1cm小段放入小玻杯中（大小以够容电极为度），在杯中准确加入蒸馏水20ml，浸没叶片。振荡2小时，用电导仪测定溶液电导率。鲜重测量：取10株幼苗，洗净根系和叶片，用吸水纸擦干后称重，两个重复。2.2 数据分析利用STAT系统分析软件对测定的各个指标进行统计分析。3 结果与讨论3.1 对根系活力的影响重金属对根系的影响主要有：对根的数目和根系长度的影响，对根系生物量和体积的影响，对根系生理的影响。根系活力与根系生命活动的强弱有直接的关系, 它是植物生长的重要生理指标之一8

8、。用TTC（四氮唑）还原量可以反映根系活力的大小。随着镉浓度的加大根系活力逐渐降低。从图1-1可以直观的看出变化的情况。从毒害发生后第5天和第10天测量的结果来看，0.05mmol/L 镉处理的根系活力比对照略高，0.1mmol/L的镉处理根系活力与对照相比有明显的提高；当浓度达到0.2mmol/L，0.3mmol/L时，根系活力显著下降。在毒害第15天的时候，0.05mmol/L的处理比对照略低，0.1mmol/L的处理根系活力又上升，比对照略高，然后随着浓度加大，又开始大幅下降。毒害第20天和第25天的测量结果都是根系活力随镉浓度的加大而明显降低。对于这种趋势,分析认为在低浓度的重金属处理

9、下，植物对胁迫产生应激反映，使根系活力有所上升；而大剂量、长时间的重金属作用,则表现出强烈的毒性。从图1-2中可以看出，四个镉处理的根系活力都是随着毒害时间的延长而明显下降。从对不同浓度处理的统计分析结果来看：对照与0.05mmol/L镉处理在5%和1%显著水平下差异不显著，其他的处理之间的差异在5%和1%显著水平下差异显著（如表1所示）。从对不同毒害时间的统计分析结果来看：各毒害时间之间的差异在5%水平下差异显著，在1%水平下，除毒害第10天和第15天之间的差异不显著外，其他处理之间差异显著（如表2所示）。图1-1：镉对TTC还原强度的影响图1-2：随着毒害时间延长根系活力的变化双春等人用玉

10、米做研究发现：当Cd2 + 的质量浓度小于1.0 mg/ L时,根系活力先减小后增大,而大于1.0 mg/ L时,出现不可逆转的降低,随着处理的质量浓度的增大,Cd2+ 对根系活力的影响加大。少量的重金属会刺激植物根系的生长，但根系的生长介质中存在过多的重金属时,重金属能够干扰根的细胞分裂、抑制根系的生长发育,从而使根系生物量和根系体积下降11。本实验的结果和双春等人的结论类似。所以镉对根系活力的影响表现为在低浓度下（0.05mmol/L,0.1mmol/L）有促进作用，在高浓度下有抑制作用。表1：不同处理间的根系活力差异显著性分析镉浓度（mmol/L）差异显著性5%显著水平1%显著水平cka

11、A0.05aA0.1bB0.2cC0.3dD表2：不同毒害时间的根系活力差异显著性分析毒害天数差异显著性5%显著水平1%显著水平5aA10bB15cB20dC25eD3.2 对叶绿素含量的影响Cd 进入植株体, 首先影响光合色素, 使叶绿素总含量下降,进而影响光合功能1，导致光合速率下降，蒸腾速率下降。随着重金属浓度的加大和毒害时间的延长叶绿素含量逐渐降低。从图2-1和图2-2可以看到：在毒害第5天和第10天测量的时候，0.05mmol/L的处理叶绿素含量比对照要高，0.1mmol/L的处理叶绿素含量比对照明显升高，达到峰值，随后当浓度上升到0.2mmol/l和0.3mmol/L的时候含量下降

12、。而在第15天，第20天，第25天测量的时候镉处理的叶绿素含量就明显低于对照，图2-1：叶绿素含量随毒害浓度和毒害时间延长的变化图2-2：随毒害时间延长叶绿素含量的变化且叶绿素含量随着镉浓度的加大而迅速下降。这个结果和蓝群等人研究铅、镉浸种对水稻叶绿素影响基本一致：低浓度的铅、镉离子溶液能促进水稻叶片叶绿素的合成使含量增加12。从对不同浓度处理的统计分析结果来看：对照与其他处理在5%和1%显著水平下均差异显著，从表3可以看出各处理间的差异显著性，除0.05mmol/L和0.1mmol/L处理间的差异在5%和1%水平下不显著以外，其他各处理间在5%和1%水平下都有显著差异。从对不同毒害时间的统计

13、分析结果来看：除了毒害第20天和第25天之间的差异在5%和1%水平下都不显著以外，其他各处理在两个水平下均差异显著（见表4）。由此可见，低浓度镉离子溶液（0.05mmol/L,0.1mmol/L）能促进小麦叶片叶绿素的合成使含量增加,相应地比对照的高,但随着处理浓度的加大和毒害时间的延长，植株受胁迫的程度加强,叶绿素的含量比对照的降低。其原因可能是Cd2 +等进入叶细胞后逐步积累,与叶绿体蛋白质上的- SH 结合或取代其中的Zn2 + ,Mg2 +等,破坏了叶绿体结构和功能活性。但是何翠屏的研究则表明这是由于进入叶片中的重金属引起的超量活性氧自由基将叶绿素作为靶分子,致使叶绿素结构破坏、叶片失

14、绿而引起的15。表3：不同处理间的叶绿素差异显著性分析处理浓度（mmol/L）差异显著性5%差异1%差异ckaA0.05bB0.1bB0.2cC0.3dD表4：不同毒害时间叶绿素差异显著性分析毒害天数（天）差异显著性5%差异1%差异5aA10bB15cC20dD25dD3.3 对鲜重的影响重金属胁迫下一些营养元素（K、P、Mg、Ca、Cu、Fe、Mn 和Zn 等）在植株营养体中的吸收、积累会减少，进而引起体它们参与的物质和代谢的紊乱，影响植物的正常生长13。Cd 胁迫下的小麦幼苗生长受到抑制,苗高随Cd 胁迫强度的增加降低的非常明显,叶片伸长迟缓,根系长度迅速降低。从生物量上看,Cd 处理浓度

15、越高,抑制的效应越明显5。从图3-1和图3-2可以直观的看出变化的规律：5次连续取样，每次测定的结果都是随着镉浓度的增大鲜重逐渐降低。从毒害第5天开始到毒害第25天，对照的重量增加了1.75g，高于其他处理。而且从毒害第5天开始，每次测量的结果都是对照高于4个镉处理。以毒害第5天测量的结果为例，0.05 mmol/L的处理重量是对照的90.5%，0.1 mmol/L的处理是对照的86.5%，0.2 mmol/L的处理是对照的77.02%，0.3 mmol/L的处理是对照的70.3%。从统计分析的结果来看：在5%和1%两个显著水平下，各处理鲜重之间的差异都很显著（见表5）。表6显示的是毒害第25

16、天，各处理间差异显著性的分析结果。在5%显著水平下，对照与其他几个处理之间差异显著，但0.05 mmol/L与0.1 mmol/L差异不显著，0.1 mmol/L与0.2 mmol/L的差异不显著，0.2 mmol/L与0.3 mmol/L之间的差异也不显著。在1%水平下，对照与0.05 mmol/L的处理差异不显著，与其他3个处理差异显著，0.1 mmol/L，0.2 mmol/L，0.3 mmol/L这三个处理之间没有显著差异。由此可见，镉对小麦鲜重的影响表现为，随着处理的镉浓度增加，鲜重呈下降趋势，且浓度越高，毒害时间越长，抑制作用越明显。镉能够抑制光合作用14，影响呼图3-1：鲜重随镉

17、浓度的增加和毒害施加延长的变化图3-2：随毒害时间延长鲜重的变化表5：不同处理间鲜重的差异显著性分析处理(mmol/L)差异显著性5%差异1%差异ckaA0.05 b B0.1 c C0.2 d D0.3 e E表6：毒害第25天鲜重差异显著性分析处理(mmol/L)差异显著性5%差异1%差异ckaA0.05 bAB0.1 bc BC0.2 cd BC0.3 d C吸作用，影响水分的蒸腾，影响矿质元素的吸收，进而影响植物的代谢过程，导致生物量积累的下降。袁祖丽等人研究结果表明镉胁迫强烈抑制烟草营养器官的生长发育，明显减少烟草植株体的K、P、Ca等大量元素的含量，且含量随镉处理浓度的增高而减少，

18、同时镉胁迫增加Zn、Fe、Cu、Al等微量元素的含量，在镉Cd3mg/L处理时可增加叶片中P、Ca、Mg、Fe、Cu、Zn、Al元素的含量，但在Cd30mg/L处理时则减少叶片中P、Ca、Mg、Fe、Cu、Al的含量13。3.4 对过氧化氢酶活性的影响CAT 是一种含Fe 的血红蛋白酶类。它可催化H202分解成水和氧。和POD 同是作物体氧化还原反应中起重要作用的酶类。它与SOD 一起起清除自由基的作用, 因此,作物体这一酶活性的维持无疑也十分重要16。CAT 定位在过氧化物酶体/ 乙醛酸循环体和线粒体,可清除大部分的光呼吸/ 呼吸产生的H2O2 。OH-是化学性质最活泼的活性氧,它几乎与细胞

19、的每一类有机物质如糖，氨基酸、磷脂、核苷酸和有机酸等都能反应,因此破坏性极强,但它可以被CAT 分解14。过氧化氢酶(CAT ) 是植物适应多种逆境胁迫的重要酶类,当植物受到重金属胁迫后，CAT的活性会发生相应变化。CAT活性在一定镉浓度的围和一定毒害时间会有所升高。当受到轻度的胁迫（0.05mmol/L的处理）CAT活性大幅升高，当浓度提高到0.1mmol/L时，活性有所下降，此后CAT活性随浓度的变化趋向平缓，没有大幅的升降（见图4-1）。4个镉处理CAT活性随毒害时间的变化不大（见图4-2）。云香的研究也表明Cd或Pb单一胁迫刺激CAT活性升高，并随时间延长出现增加趋势16。这和本实验结

20、果相似。表7是对不同浓度处理的CAT活性差异显著性的分析，对照与其他几个处理差异显著。在1%显著水平下其他几个处理之间，差异不显著。在本实验中CAT的活性与毒害时间的关系不大，从图4可以看出几条线集中在一起，没有表现出大幅的升降。根据统计分析的结果5次测图4-1：过氧化氢酶活性的变化图4-2：随毒害时间延长过氧化氢酶活性的变化定的结果差异不显著（FF0.05)。出现这种情况可能是酶对植物的保护作用有一定限度,即使是耐Cd 植物, 酶的活性也存在一个阈值。在一定的Cd 浓度围，CAT酶活性得以维持或提高，超过这个围，它们的活性就下降1。在本实验中CAT活性没有大幅下降可能是因为选取的最高浓度没有

21、超过CAT活性的阈值。表7：不同浓度处理的CAT活性差异显著性的分析处理浓度（mmol/L）差异显著性5%差异1%差异0.05aA0.3abA0.1abA0.2bAckcB3.5 对细胞膜透性的影响细胞膜是细胞与环境之间物质交换的界面，各种逆境对细胞的影响首先作用于细胞膜，细胞膜又是选择透过性膜，它能调节和控制细胞外物质的运输和交换。植物器官在衰老或逆境条件下，由于自由基的毒害会发生膜脂的过氧化作用，其产物丙二醛严重损伤细胞膜系统。膜脂过氧化是膜透性增加的一个重要原因，细胞膜透性增加导致植物组织电解质渗漏，相对电导率的变化是植物组织电解质渗漏的表观现象18，19。随着镉浓度的加大和毒害时间的延

22、长，相对电导率逐渐变大。但是从图5-1和图5-2中可以看到，在毒害第5天和第10天测量的时候，0.05mmol/L和0.1mmol/L的处理电导率反低于对照。这可能是由于在镉浓度较低时保护酶（CAT，SOD，POD等）活性大幅上升，对细胞摸起了一定的保护作用。因为当镉浓度达到0.2mmol/L，0.3mmol/L的时候，保护酶活性下降（见图4-1），电导率开始上升，在以后几次的测定中，镉处理的电导率都要远高于对照。对不同浓度处理的统计分析结果表明：对照，0.05mmol/L，0.1mmol/L三者之间的差异不显著，而0.2mmol/L和0.3mmol/L两个处理之间的差异以及和其他处理之间的差

23、异显著（见表8）。对不同毒害时间的统计分析结果表明：不论在5%水平下还是在1%水平下，各处理之间的差异都很显著（见表9）。从上面的结果可以看出，随着镉浓度的加大和毒害时间的延长，细胞膜透性逐渐变大；在浓度较低时，因为保护酶活性显著升高，透性会变小，但是与对照没有显著差异；当浓度较高，毒害时间延长时，透性大幅上升；在本实验中毒害时间延长对小麦细胞膜的损害更明显。图5-1：细胞膜透性随镉浓度增加的变化图5-2：细胞膜透性随毒害时间的变化表8：不同处理间细胞膜透性差异显著性分析处理浓度（mmol/L）差异显著性5%差异1%差异0.3aA0.2bB0.1cC0.05cCckcC表9：不同毒害时间透性差

24、异显著性分析毒害天数差异显著性5%差异1%差异25aA20bB15cC10dD5eE3.6 对MDA含量的影响植物受Cd 污染后, 丙二醛(MDA ) 会高度积累。膜脂过氧化是膜上不饱和脂肪酸中所发生的一系列活性氧反应, 其产物MDA 含量是反映脂质过氧化作用强弱的一个重要指标1。MDA含量的变化趋势同CAT的完全相反，它随处理浓度的增大而呈上升趋势。随着镉离子浓度的增加，MDA 含量趋于增加，说明镉胁迫引起了膜脂过氧化作用。MDA含量随着镉浓度的加大而增加，随着毒害时间延长而增加。图6-1和图6-2可以直观的反映变化的趋势。从浓度对MDA含量影响的统计分析结果来看：各处理之间差异显著，说明随

25、着镉浓度的变化，MDA含量显著增大。从毒害时间对MDA含量影响的统计结果来看：除第15天和第20天，第15天和第10天之间的差异不显著，其他差异显著。这说明毒害时间的延长对MDA含量增加的影响小于浓度增加对MDA含量的影响。 有研究表明,5MCd处理下,大麦功能叶的MDA含量急剧增加,并随Cd处理时间延长而加剧17。爱珍的研究发现青菜和白菜叶片MDA含量随着Cd处理浓度的增加而增加7。丁等人的研究表明：在Cd2 + 、Zn2 + 胁迫下,番茄幼苗根系和叶片中MDA图6-1：MDA含量的变化图6-2：MDA含量随毒害时间的变化表16：不同处理间MDA含量差异显著性分析处理浓度（mmol/L）差异

26、显著性5%差异1%差异0.3aA0.2bB0.1cC0.05dDckeE表17：不同毒害时间MDA含量差异显著性分析毒害天数差异显著性5%差异1%差异25aA20bB15bcB10cB5dC大量积累,可溶性蛋白含量降低叶片中MDA 积累量大于根系,且在高浓度条件下变化较快,Cd2 + 在0. 1 mmolL - 1时,叶片中MDA 积累量最大，为对照的5.8 倍。相同浓度条件下，叶片中MDA 的含量以Cd2 + 胁迫高于Zn2 + 胁迫20。这些结果和本实验相似，由此可见，MDA含量随镉浓度的加大而显著增加，随毒害时间的延长而明显增加。3.7 讨论Cd是植物非必需元素，Cd 进入植物体并积累到

27、一定程度，就会表现出毒害症状。实验结果表明，镉对植物的影响存在剂量效应。低浓度镉(Cd0.1mmolL - 1 )对小麦生长有一定的促进作用。在高浓度下（Cd0.1mmol/l）有抑制作用。在低浓度下（0.05mmol/L,0.1mmol/l）镉对根系活力的影响表现为促进作用。当浓度达到0.2mmol/L，0.3mmol/L时，根系活力显著下降。当毒害时间较短时镉对根系活力的影响较小，而大剂量、长时间的重金属作用，则表现出强烈的毒性。本实验中，四个镉处理的根系活力都是随着毒害时间的延长而明显下降。在低浓度下（0.05mmol/L，0.1mmol/L）镉处理的小麦叶片叶绿素含量比对照要高，随后当

28、浓度上升到0.2mmol/l和0.3mmol/L的时候含量下降。随着毒害时间的延长，镉处理的叶绿素含量就明显低于对照，且叶绿素含量随着镉浓度的加大而迅速下降。镉对小麦鲜重的影响表现为，随着处理的镉浓度增加，鲜重呈下降趋势，且浓度越高，毒害时间越长，抑制作用越明显。5次连续取样，每次测定的结果都是随着镉浓度的增大鲜重逐渐降低。从毒害第5天开始，每次测量的结果都是对照高于4个镉处理。在镉浓度较低时，CAT酶活性会大幅上升，起到保护植物的作用。当受到轻度的胁迫（0.05mmol/L的处理）CAT活性大幅升高，当浓度提高到0.1mmol/L时，活性有所下降，此后CAT活性随浓度的变化趋向平缓，没有大幅

29、的升降。在本实验中CAT活性没有大幅下降可能是因为选取的最高浓度没有超过CAT活性的阈值。随着镉浓度的加大和毒害时间的延长，细胞膜透性逐渐变大；在浓度较低时（0.05mmol/L和0.1mmol/L），因为保护酶活性显著升高，透性会变小，但是与对照没有显著差异；当浓度较高（0.2mmol/L，0.3mmol/L），毒害时间延长时，透性大幅上升。MDA是膜脂过氧化作用的主要产物之一，其含量可反映膜脂过氧化作用的程度。本实验中，随着镉离子浓度的增加，MDA 含量趋于增加,说明镉胁迫引起了膜脂过氧化作用,处理间差异显著。减少镉对植物的毒害需要控制植物对镉的吸收，也就是要降低土壤中镉含量。控制土壤中的

30、镉含量可以从磷肥入手，磷肥中含有Cd、F、As、稀土元素以及三氯乙醛,特别是镉含量比土壤高百倍，如美国的过磷酸钙含镉816114 mgkg-1，磷铵含镉715156 mgkg-1。加强和完善磷肥的制作工艺,并加强国家磷肥管理工作，合理调配磷肥的配置地区，才不会导致含镉较高的磷肥在某个地区连续施用，使得土壤的含镉量维持在土壤镉临界量之下。结 论实验结果表明,低浓度镉(Cd0.1mmolL - 1 )对小麦生长有一定的促进作用。在高浓度下（Cd0.1mmol/l）有抑制作用。在低浓度下（0.05mmol/L,0.1mmol/l）镉对根系活力的影响表现为促进作用。当浓度达到0.2mmol/L，0.3mmol/L时，根系活力显著下降。本实验中，四个镉处理的根系活力都是随着毒害时间的延长而明显下降。在低浓度下（0.05mmol/L，0.1mmol/L）镉处理的小麦叶片叶绿素含量高于对照，当浓度上升到0.2mmol/l和0.3mmol/L的时候含量明显下降。镉对小麦鲜重的影响表现为，随着处理的镉浓度增加，鲜重呈下降趋势，且浓度越高，毒害时间越长，抑制作用越明显。当受到轻度的胁迫（0.05mmol/L的处理）CAT活性大幅升高，当浓度提高到0.1mmol/L