基地班生物化学大实验讲义酸性磷酸酯酶的提取.docx

1、基地班生物化学大实验讲义酸性磷酸酯酶的提取实验一、 酸性磷酸酯酶的提取分离纯化一、目的 掌握胞内酶的分离提取方法，学会离心机的使用。二、原理酸性磷酸酯酶(Acid Phosphatase，E C 3 132)存在于植物的种籽、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中，能专一性地水解磷酸单酯键。本实验选用绿豆芽的酸性磷酸酯酶为材料，磷酸苯二钠为底物。磷酸苯二钠经过酸性磷酸酯酶作用，水解后生成酚和无机磷，其反应式如下： 由上式可见，当有足量的底物磷酸苯二钠存在时，酸性磷酸酯酶的活力越大，所生成的产物酚和无机磷也越多。根据酶活力单位的定义，在酶促反应的最适条件下每分钟生成1微摩尔(mo1)产物所需要的酶量为一个

2、活力单位，因此可用Folin一酚法测定产物酚或用定磷法测定无机磷来表示酸性磷酸酯酶的活力。本实验采用的是Folin-酚法。 实验前将绿豆芽细胞破碎，释放出酸性磷酸酯酶，离心除去细胞碎片和植物纤维等杂质，得到酸性磷酸酯酶的粗酶溶液，为下面的酶学性质研究及SDS-PAGE电泳法测分子量等系列生物化学实验做准备。 三、实验器材 1LGl02.4A高速离心机：北京医用离心机厂生产，1台组 2托盘天平：1台组。 3滴管：1支组。4100 mL烧杯：2只组。 5100mL三角烧瓶：1只组。 6漏斗：1只组。 7纱布：若干。 8滤纸：若干。 9碾钵：1套组。 10培养皿：1个组。 11100mL量筒：1支组

3、。 12塑料手套：多双组。 13记号笔：公用。 14绿豆芽：当日采摘，50克组。 15.SephadexG-150均为pharmaeia产品。4、实验试剂1.0.01mol/LHAc一NaAc缓冲液：2.0.2mol/LNaOH溶液 3.5.5mmol/LPNPP（对硝基苯磷酸二钠）五、操作1匀浆：戴上手套，将绿豆芽掐去根和叶得绿豆芽茎，称取50 g的绿豆芽茎，在碾钵中用碾锤彻底捣碎，室温静置0.5 h，在培养皿中用双层纱布挤滤，得到滤液。2平衡：将2只100mL烧杯分别放到托盘天平的2只托盘上进行平衡。将滤液倒人2支离心管中，再把离心管连同其盖子分别放入托盘上的2只烧杯中，用滴管增、减离心管

4、中的溶液使其在托盘天平上进行平衡，平衡后盖上离心管的盖子，用记号笔做好标记。 3离心：4 000 rmin离心20 min。 4保存：将离心管中大部分上清液倒人量筒中，少部分接近沉淀物的上清液经滤纸过滤，一并收入量筒中以测量体积，然后倒入三角烧瓶中做好标记，用塑料薄膜密闭，作为“原酶液”在冰箱中保存备用。 5、将原酶液精确等分，一部分在冰箱中保存备用。另一部分用于实验六的sephadexG-150柱层析。6.酶活力的测定将pNPP溶于0.1mmol/LHAc-NaAc缓冲液中配成5.5mmol/L底物溶液，每lmL底物溶液加入0.2mL酶液，37oC保温1小时，再加入4mL0.2mol/LNa

5、OH溶液终止反应，混匀后测405nm光吸收值。以先在底物溶液中加入4mL0.2mol/LNaOH溶液后再加入0.2mL酶液作对照。在此条件下，以每小时催化释放1umol对硝基苯酚的酶量定义为1个活力单位。五、计算上清液体积（mL）粗酶液得率（mL）=上清液体积绿豆芽茎质量100%六、注意事项 1使用离心机前必须将离心管(连同其盖子)精确平衡。 2离心过程中，若听到异常响声，可能是出现了离心管破碎或离心管不平衡等情况，应立即切断电源，停止离心，检查原因 3在离心机高速运转过程中切勿打开离心机盖，以防造成意外事故。 4避免离心机连续使用时间过长，一般使用60 min后要隔2030 min再使用。

6、5有机溶剂会腐蚀离心管，酸、碱、盐溶液会腐蚀金属，若发现渗漏现象应及时擦洗干净以免损坏离心机。 思考题 1实验操作过程中为什么需戴上手套？ 2豆芽在碾钵中用碾锤彻底捣碎对酶液提取起到什么作用? 3离心管中的沉淀物可能是哪些成分？实验二、 酶促反应进程曲线的制作一、目的 学会制作酶促反应的进程曲线，掌握可见分光光度计的使用。二、原理要进行酶的活力测定，首先要确定酶的反应时间。酶的反应时间并不是任意规定的，应该在初速度范围内进行选择。要求出代表酶促反应初速度的时间范围就必须制作酶促反应的进程曲线。所谓进程曲线是指酶促反应时间与产物生成量(或底物减少量)之间的关系曲线。它表明了酶促反应随反应时间变化

7、的情况。本实验的进程曲线是在酶促反应的最适条件下采用每间隔一定的时间测定产物生成量的方法，以酶促反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成的。从进程曲线可以看出，曲线的起始部分在某一段时间范围内呈直线，其斜率代表酶促反应的初速度。但是，随着反应时问的延长，曲线的斜率不断下降，说明反应速度逐渐降低。反应速度随反应时间的延长而降低这一现象可能是由于底物浓度的降低和产物浓度的增高使逆反应加强等原因所致。因此，要真实反映出酶活力的大小，就应该在产物生成量与酶促反应时间成正比的这一段时间内进行测定。换言之，测定酶活力应该在进程曲线的初速度时间范围内进行。制作进程曲线，求出酶促反应初速度的时间范围是酶动

8、力学性质分析中的组成部分和实验基础。三、实验器材1VIS-7220型可见分光光度计2HH一2型数显恒温水浴锅 3取样器：请参见实验一，5 mL、1mL。各1支组。 4试管：20支组。 5试管架：1个组。四、实验试剂 1酸性磷酸酯酶酶液：取原酶液用0.2 molL的pH56乙酸盐缓冲液稀释1020倍。 25 mmolL磷酸苯二钠溶液(pH5.6)：精确称取磷酸苯二钠(C6H6Na2PO42H2O，相对分子质量254.10)2.54 g，加蒸馏水溶解后定容至100mL，即配成了100 mmolL磷酸苯二钠水溶液，密闭保存备用。用0.2molL的pH5.6的乙酸盐缓冲液稀释20倍，即得5mmolL磷

9、酸苯二钠溶液(pH5.6)。 30.2 molL的pH5.6乙酸盐缓冲液。 4Folin-酚试剂：于2 000 mL磨口回流装置内加入钨酸钠(Na2WO42H2O)100 g，钼酸钠(Na2MoO42H 2O)25 g，水700 mL，85磷酸50 mL，浓盐酸100 mL。微火回流10 h后加入硫酸锂150 g，蒸馏水50 mL和溴数滴摇匀。煮沸约15min，以驱逐残溴，溶液呈黄色，轻微带绿色；如仍呈绿色，须重复滴加液体溴的步骤。冷却后定容到1000mL，过滤，置于棕色瓶中可长期保存，使用前，用蒸馏水稀释3倍。 51 molL碳酸钠溶液。 60.4 mmolL酚标准应用液：精确称取分析纯的酚

10、结晶0.94g溶于0.1molL的HCl溶液中，定容至1 000mL，即为酚标准贮存液，贮存于冰箱可永久保存，此时的酚浓度约为0.01molL。使用前将上述的酚标准贮存液用蒸馏水稀释25倍，即得到0.4 mmolL酚标准应用液。五、操作检查试管是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120烘干。1加样与酶促反应：取试管12支，按0到11的顺序逐管编号，空白为0号。各管加0.5mL 5mmolL磷酸苯二钠溶液，在35恒温水浴锅中预热2min后，在111管内各加入0.5 mL预热的酶液。酶液一加入立即精确计时井摇匀，按时间3、5、7、10、12、1 5、20、25、30、40和50min在35

11、恒温下进行定时酶促反应(酶液加入时为起始时间，碳酸钠溶液加人时为终止时间)，参见图82一4。当酶促反应进行到上述相应的时间时，加入1 mol/L碳酸钠溶液5mL终止反应，时间控制详见表。管号1234567891011酶液加入时刻（min 11号试管最先加样）109876543210碳酸钠加入时刻（min）13141517182024283241502显色：加完1 molL碳酸钠溶液5 rnL后再向试管中加入0.5mL Folin一酚稀溶液，混匀，保温约10 min即可显色。空白管所加试剂相同，但酶液最后加入。 3测定：冷却后以0号管作空白，在可见光分光光度计上680 nnl波长处测定各管的吸光

12、度A680。酶促反应操作安排管号123456789101105mmol/L磷酸苯二钠溶液各0.5ml酶液（35预热过的）各0.5ml，一加入就计时，注意合理安排各管的加入时间，最好先加第11管，隔1min再加第10管（详见表8-2-1）035精确反应时间（min）35710121520253040501mol/L碳酸钠溶液各5mL（用于终止反应）Folin-酚稀溶液各0.5mL0号试管加入酶液0.5mL35保温显色10min以上A6800 4画图：以反应时间为横坐标，A680为纵坐标绘制进程曲线，并将其贴在实验报告上，由进程曲线求出酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围(直线部分涵盖的时间)。 5清

13、洁：将用过的玻璃仪器和取样器套头洗净，清洁分光光度计(尤其是比色槽内)、清洗比色皿，整理好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验收，实验报告当场交给老师。六、计算试管1234567891011A680初速度的时间范围：0 min七、注意事项 1酶促反应应保持温和条件，反应液要避免剧烈搅拌或震荡。 2实验前要设计好每支试管的加样顺序，确保反应时间的准确性。 3酶促反应的加样顺序不得搞错，否则无法显色。 思考题 1随着反应时间的延长，曲线的斜率不断下降，说明反应速度逐渐降低，这是为什么？ 2如果酶促反应在一个较大的体系中，如在烧杯中进行，每隔一定的时间从烧杯中取样测定该体系中产物的生

14、成量，并绘制酶促反应进程曲线，该方法和本书采用的方法结果会一致吗?哪个更好一些？实验三、 酸性磷酸酯酶的酶活力测定 一、目的 通过对酶促反应速度的测定，计算出酶的活力，掌握可见分光光度计的使用。 二、原理 请参见实验一 三、实验器材 请参见实验二 四、实验试剂 请参见实验二 五、操作 检查试管内是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120烘干。 1标准曲线的制作取试管6支，按0到5的顺序逐管编号，空白为0号。按照表831，向各试管中依次加入0.4mmolL酚标准应用液、0.2 molL的pH5.6的乙酸盐缓冲液、1 molL碳酸钠溶液和Folin一酚试剂，注意加样顺序不得搞错，否则显不了

15、色。摇匀，在35保温10min以上(先用烧杯盛35的水，置于水浴锅中，再将试管放人烧杯中保温，以防试管滑落人水中)，参见实验八(2) 的图824。以0号试管为空白，在可见光分光光度计上680 nm波长处读取各管的吸光度A680，以A680为横坐标、酚标准应用液的毫升数为纵坐标作一条标准曲线，它应该是一条直线。保留该数据，以便实验八(4)直接引用。以上操作总结为表标准曲线的制作试管1234500.4mmol/L酚标准应用液0.10.20.30.40.500.2mol/LpH5.6的乙酸盐缓冲液（mL）0.90.80.70.60.511mol/L碳酸钠溶液（mL）5Folin-酚试剂（mL)0.5

16、摇匀，在35保温显色10min以上A68002酶活力的测定取2支试管，编号1,0，将0号试管作为空白。在2支试管中备加人0.5mL的5 mmolL磷酸苯二钠溶液，35预热2min，再向1号试管中加人35预热过的酶液0.5mL，立即计时，摇匀，35精确反应10min(酶液加入时为起始时间，碳酸钠溶液加入时为终止时间后立即向2支试管中各加入1 molL碳酸钠溶液5 mL，再各加人Folin-酚稀溶液0.5 mL，混匀，最后向0号试管中加入酶液0.5 mL，2支试管摇匀后在35保温显色约10 min以上，将0号试管作为空白，用可见光分光光度计测1导试管在680 nm处的光吸收值A680，以上详细的加

17、样顺序和操作见表，注意加样顺序不得搞错，否则显不了色。管号105mmol/L磷酸苯二钠溶液（mL）0.50.535预热2min酶液（35预热过的）（mL），一加入就计时0.50摇匀，35精确反应10min后立即加入1mol/L碳酸钠溶液5mL（终止反应用）Folin-酚稀溶液（mL）0.50.50号试管加入酶液0.5mL摇匀，35保温显色10min以上A6800酶活力测定3酶活力的计算 酶活力单位的定义为：在酶促反应的最适条件下每分钟生成1微摩尔(mol)产物所需要的酶量规定为一个活力单位。用1号试管的A680在标准曲线上查出其对应的酚标准应用液的毫升数V，根据公式：20.4V1000/10可

18、计算出lmL酶液中所含有的酶的活力。 4清洁 将用过的玻璃仪器和取样器套头洗净，清洁分光光度计(尤其是比色槽内)、清洗比色皿，整理好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验收，实验报告当场交给老师。6、计算试管00123451A68000V（mL）1mL酶液的活力（U） 七、注意事项 参见实验二的注意事项。 思考题 1用Folin-酚法测定产物酚或用定磷法测定无机磷都可以用来测定酸性磷酸酯酶的活力，你认为哪种方法的适应面更广? 2测定酶活力为什么要在进程曲线的初速度时间范围内进行?3空白管中为什么最后才加酶液?你还可以设计出另一种空白管吗? 实验四 凝胶层析法纯化酸性磷酸酯酶一实验

19、目的 掌握凝胶过滤层析测定原理和实验方法，掌握凝胶过滤柱的使用以及葡聚糖凝胶G-150的使用及保存。二实验原理（一）凝胶过滤层析原理凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatography）、分子筛过滤（molecular sieve filtration）、凝胶渗透层析（gel osmotic chromatography）等。它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。 凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔

20、软而富于弹性的半固体状态。人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间

21、的物质分子，则居中流出。这样被分离物质即被按分子的大小分开。 见下图： 用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品，主要有交联葡聚糖（商品名为Sephadex）、琼脂糖（商品名为Sepharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Biogel）及具有一定网眼的细玻璃珠等和这些凝胶的衍生物。 下面主要介绍葡聚糖凝胶，这是由葡萄糖的多聚物与1氯 2、3环氧丙烷交连而成。环氧丙烷引入丙三醇基将链状的多聚葡萄糖单位交联起来，凝胶网眼的大小由多聚葡萄糖的分子和环氧丙烷的比例（交联度）来控制。葡聚糖具有较强的亲水性，在水和电解质溶液中膨胀成为柔软而富于弹性的凝胶，其吸水能力与葡聚糖凝胶的交联度有密切关系。交联度大的，

22、孔径小，吸水少，膨胀的程度小；交联度小的，孔径大，吸水多，膨胀的程度大。因此，葡聚糖凝胶孔径的大小可以其吸水量的大小来表示，常以G10至G200号码标记。G后面的数字是其吸水量（毫升水/克干胶）乘以10所得的值。如G25即表示吸水量为2.5ml/2干胶。市售有G10、G5、G50、G75、G100、G150、G200等型号。G75以上的胶因吸水量大，膨胀后形态柔软易变，统称为软胶。G75以下的称为硬胶。 葡聚糖凝胶可分离的分子大小从几百到数十万。可根据被分离物质的分子大小及目的选择使用。一般说Sephadex Gl015通常用于分离肽及“脱盐”。Sephadex G75200用以分离各类蛋白质

23、。 凝胶层析是一种物理分离法。葡聚糖凝胶基本上不带电荷呈多惰性，不与被分离物质发生反应，所以分离的效果较好。然而由于它是葡萄糖的聚合物，因而仍有少量活性羟基，能吸附少量蛋白质等被分离的物质。为了克服这个缺点，一般使用含有离子强度达0.08的NaCl等中性盐缓冲液作洗脱液。（二）层析操作（1）凝胶溶胀（水化）商品葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶均为干燥颗粒。使用前必须水化溶胀。商品琼脂糖凝胶呈悬浮胶体可直接用，玻璃球不用溶胀。凝胶溶胀有两种方法：一种是将所需葡聚糖凝胶浸入蒸馏水中于室温下溶胀；另一种是置于沸水浴中溶胀。各种葡聚糖在上述溶胀方法中所需的时间见下表：必须浸泡足够的时间以使凝胶充分溶胀。两种

24、方法中，沸水浴溶胀不但节省时间，还可以杀灭凝胶中污染的细菌并排出网眼中气体。凝胶溶胀后，需用蒸馏水洗涤几次，每次应将沉降缓慢的细小颗粒随水倾倒出去，以免在装柱后产生阻塞现象，降低流速。洗后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。一支层析柱中应该装入的干胶量可以用下法推算：称取1g所需型号的葡聚糖干胶，放在5ml量筒中，用室温溶胀的方法充分溶胀，观察溶胀后凝胶的体积。然后在层析柱中加水到所需柱床高度，将水倒出，量取柱床体积。根据1g干胶溶胀后的体积和所需柱床体积，即可推算出干胶的需要量。（2）装柱将层析剂装入柱中进行层析的方法称柱层析法。作层析用的柱子称层析柱。层析柱有玻璃和透明塑料的两种。柱子的一端为进口，

25、另一端为出口，出口端底部有烧结玻璃砂板或尼龙布，能阻止层析剂流出，溶剂则可流过。如果没有市售的层析柱，可以选用粗细均匀，长短合适的玻璃管，在两端塞上合适的胶塞，胶塞中插人细玻璃管，在一端放一层尼龙布为出口，即可作为层析柱使用。层析柱的长短粗细根据实验的目的而定，一般说来，凝胶层析时柱越长，分离效果越好。但柱过长，层析时间长，样品易稀释造成扩散，反而影响分离效果。柱的内径不宜较细，直径1cm以下的柱易发生“管壁效应”，即柱中部分的物质组分移动较快，管壁周围的则移动较慢，造成分离混乱。当然柱的内径也不宜过粗。凝胶层析中，在把小分子物质（mw1500），如无机或其他物质与大分子物质（mw20000）

26、分离时，层析柱的体积一般约为样品的410倍，高度与直径的比例为5：1至15：1之间。这类柱也称为“脱盐”柱，常用网孔很小的凝胶如G25。用以将生物大分子物质彼此分开的分级层析柱，体积应为样品体积的25100倍。柱长度与直径的比例为20：1100：1。装柱的操作过程如下：将层析柱垂直固定在支架上，打开柱下口开关。将溶胀好的凝胶放在烧杯中，使凝胶表面上的水层与凝胶体积相等。用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内。此时柱下口一边排水，上口一边加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐步形成凝胶柱。当到达所需凝胶柱高度时，立即关闭下口，待凝胶自然沉降形成凝胶柱床。凝胶柱床一般应离柱顶35cm，并覆盖一层

27、溶液。灌注凝胶时要求将均匀的凝胶一直加到所需柱床高度，不能时断时续，否则将出现分层或“纹路”等毛病。若中途出现这些现象，可以用玻璃棒将已形成的柱床逐步搅起，直至出毛病的部分再让凝胶重新沉降或继续加入搅匀的凝胶悬液。若在灌好胶后才发现“纹路”、分层等现象时，要重新装柱，以免影响层析效果。在做大型的凝胶柱时，灌注的凝胶是否均匀往往从表面上看不出来。所以使用前应该用一些带色的大分子物质如细胞色素C、血红蛋白或专用的蓝色葡聚糖2000（Bluedextran2000）通过凝胶柱，观察形成的色斑带是否整齐，若斑带歪斜，应该重新装柱，直至达到要求。刚从冰箱中取出的凝胶液，不能马上用来灌柱，应平衡至室温后再

28、用，不然装好的凝胶会产生大量的气泡影响层析。在整个灌注凝胶的过程及使用中，凝胶柱面上一定要覆盖着一层溶液，以免进入空气。若进空气再加入溶液时，凝胶柱中易形成气泡。（3）平衡装好的凝胶柱，使用前应该用相当于柱床体积两倍或更多的洗脱液流过凝胶柱，以压实凝胶，称为平衡。（4）上样将样品加入到凝胶柱中，准备层析的过程称上样。上样时，应该注意上样量的多少、样品的黏稠度及离子强度。这三个因素会影响到以后层析的效果。一般来说“脱盐”层析时，上样体积可为柱体积的10%25%；生物大分子的分级分离，约为柱体积的1%5%。样品的黏稠度一般不宜大于洗脱液黏稠度的2倍以上，不然洗脱峰会变宽和歪斜。离子强度要达到0.0

29、8，以免产生特异性吸附。上样操作：先打开层析柱的下口开关，放出凝胶柱面上的溶液，或用皮头吸管吸取，使液面与凝胶表面相平齐，但切忌液面低于凝胶表面。然后将样品加在凝胶表面，打开柱下口开关，控制流速，使样品慢慢渗入凝胶内。加样时注意勿将凝胶柱面冲起形成凹面，也不能沿管壁流下，以免样品沿柱壁与凝胶柱的间凝胶隙漏下。当慢慢渗入凝胶的样品液液面与凝胶柱面相平时，关闭下口，完成上样。然后在凝胶柱面上加一层（35cm）洗脱液，接上洗脱瓶准备洗脱。（5）洗脱用规定的溶液流过样品，使分子量不同的样品逐步分开并先后由柱床流出的过程称为洗脱。所用溶液称洗脱液。洗脱液放在贮液瓶（洗脱瓶）中并与层析柱相通连。洗脱时只要打开层析柱下口开关，洗脱液即可流出。洗脱过程中保持恒定的流速是柱层析获得良好分离效果的重要条件。因为凝胶层析的分离作用主要取决于分子扩散进入凝胶的机会，流速过快有些分子来不及在分子筛中分配而流出；过慢时已分离的分子会因扩散而混合。因而要保持适当的恒定流速。洗脱液的流速取决于它的静水压。静水压是指洗脱瓶中洗脱液的液面高出于层析柱出口产生的液体压力（或接触空气的两个液面间的高差），这个高度差越大，静水压越大，洗脱液的流速就越快。这个压力差可以调动，如提高洗脱瓶的位置或瓶中液面的增减；或者降低或提高层析柱出口的位置等，因此静水压又称操作压。由于静水压越大，洗脱液的流