Nek2与小细胞肺癌多药耐药性的关系.docx

1、Nek2与小细胞肺癌多药耐药性的关系可 行 性 报 告项目名称：NEK2与小细胞肺癌多药耐药性的关系申报单位：中山大学附属第三医院技术领域：四.引导项目专题名称：重大疾病防治及优生优育技术 （1）常见病、多发病（恶性肿瘤、心血管系统疾病、代谢性疾病及神经精神性疾病等）早期诊断、 社区干预的防治技术关键词： 小细胞肺癌，食蟹猴，发病进程模型，早期诊断，荧光定量PCR技术， 2010年2月NEK2与小细胞肺癌多药耐药性的关系一、立项依据（一）目的意义1小细胞肺癌耐药的危害肺癌已成为人类因癌症死亡的主要原因，肺癌发病率在多数发达国家中占男性恶性肿瘤的首位，女性占第二位。中国每年癌症新发病例为220万

2、人，因癌症死亡人数为160万人。近20年来，中国每4-5个死亡者中就有一个死于癌症，居死亡原因之首。男女恶性肿瘤死亡率最高的均为肺癌。据预测，到2020年，中国也将有550万新发癌症病例，其中死亡人数将达400万(1)。 肺癌患者中约有15%-20%为小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)，由于SCLC在肺癌各病理分型中分化程度最低，较早的发生血道转移，因此预后极差。临床上病理确诊为小细胞肺癌的患者，由于对化疗极其敏感，所以采取化疗为主要的治疗方式，但很快就会出现肿瘤耐药，化疗失效，导致小细胞肺癌患者早期出现肿瘤进展、复发、转移，5年生存率不足10%(1)。因此

3、化疗的耐药性是临床小细胞肺癌治疗的最大问题之一，如何减少小细胞肺癌对化疗药物的耐药性是基础、临床工作者亟待解决的关键问题。 2NEK2基因的基本生物学功能及其与癌症的相关性NEK2 基因是NIMA相关的激酶，属于丝氨酸-苏氨酸激酶。NEK2 其催化活性中心位于N端，而在其C端有碱性程度较高的等电点(2)。人的NEK2编码2个同分异构体，即NEK2 A和NEK2B。NEK2是一个中心体激酶，在调整中心体分离和维持中性体完整性中起作用(3)。活性NEK2的过表达诱导中心体过早分裂(4, 5)；而非活性激酶NEK2或NEK2的表达抑制则阻断纺锤体和染色体的分离，导致积累多个中心体(6, 7)。而且，

4、用siRNA的方法极度下调NEK2则导致中心体成熟缺陷(8)。总之，这些资料支持这样一个模型，即内源性NEK2在G2/M转变期通过触发假定的中心体间连接来促进中心体分离。已报道大量的蛋白质与NEK2互相作用。NEK2通过对其底物C-NAP1(9)、 protein phosphatase 1 (PP1) (9)、 NIP2/centrobin(10)、 beta-catenin (11)和SGO1(12)的可逆性磷酸化来调控有丝分裂中心体的分离。研究发现NEK2只存在于某些细胞的细胞质中及另外一些细胞的核中(13)。位于细胞核中似乎在表达典型干细胞标志物的未分化生殖细胞或新生生殖细胞是一个特点

5、(13)。大量研究表明NEK2异常表达与癌症的发生、发展及复发相关。目前，研究人员已经发现NEK2在骨髓瘤，急性髓性白血病、膀胱癌、神经胶质瘤、肺腺癌、套细胞淋巴瘤、间皮瘤、黑色素瘤、胆管癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌和胃腺癌等多种癌组织和癌细胞系中均高水平表达(14)。研究人员通过免疫组化和免疫荧光技术检测发现NEK2在非小细胞肺癌组织中的表达要明显高于正常组织，且NEK2还是个很好的小细胞肺癌细胞增殖和预后指标(15)。我们的基因芯片结果表明NEK2在SCLC组织中的表达要明显高于正常组织（图A）。研究人员通过体内、体外实验研究发现过表达NEK2能促进癌细胞增值，并增加癌细胞的耐药性，

6、而下调NEK2则极度抑制癌细胞生长，并诱导癌细胞程序化死亡。大量的临床数据也表明NEK2高表达与癌症病人生存率差，预后差及复发密切相关(14)。3. NEK2与癌细胞多药耐药性的相关性 肿瘤细胞产生的耐药性是肿瘤化疗失败最常见而又最难解决的问题之一，肿瘤细胞的耐药性是多方面的，其中以多药耐药性（multiple drug resistance，MDR）(16)最为常见，多药耐药是指对一种抗肿瘤药物具有耐药性的同时，对其他结构不同，作用靶点不同的抗肿瘤药物也具有耐药性。多药耐药是一种广谱耐药现象，其形成机制非常复杂，其中由膜糖蛋白ABC转运子（ATPbinding cassette transp

7、orter）介导的多药耐药是癌细胞获得耐药能力的重要原因(17)。ABC转运子具有运输调节通道功能，通过水解ATP获得的能量将进入细胞内的药物泵出细胞外。研究人员发现ABC转运蛋白在多种癌细胞中高表达，增加癌细胞的耐药能力，此外ABC转运蛋白还是肿瘤干细胞的重要标志(18)。NEK2与癌症的发生、发展及复发相关，这不仅仅是因为NEK2高表达促进癌细胞增殖，还与其增加癌细胞耐药性相关。研究人员已经发现过表达NEK2能增加多种癌细胞耐药性，包括卵巢癌细胞、骨髓瘤、乳腺癌等。NEK2增加多种癌细胞耐药性是否表明其与癌细胞的多药耐药性相关？研究人员在多发性骨髓瘤及其他多种癌症研究中的结果有力的支持了这

8、个观点，他们发现NEK2通过增加癌细胞的ABC转运子蛋白表达来提高癌细胞的耐药能力(14)。此外研究人员在大肠癌研究中发现将NEK2 RNAi和化疗药物顺铂联合使用能明显增加药物治疗效果(19)。NEK2在多种癌细胞中呈高水平表达，且高表达NEK2能增强癌细胞多药耐药性，这些研究结果表明NEK2是一个新的治疗癌症的靶基因，有很广阔的临床应用前景。SCLC细胞产生多药耐药性是化疗失败的重要原因，因此研究SCLC产生多药耐药性的分子机制意义重大。我们通过慢病毒载体上调或干扰SCLC细胞内NEK2表达，进而研究NEK2对SCLC细胞多药耐药性的影响，为将来针对NEK2的靶向分子药物应用于SCLC临床

9、治疗提供理论依据。（二）国内外概况SCLC起源于支气管粘膜或腺上皮内的嗜银细胞细胞，与非小细胞肺癌相比SCLC病情进展快，更早发生广泛转移，恶性程度在所有肺癌类型中最高。SCLC分为局限期和广泛期病变，约2/3患者确诊时已属广泛期病变，未经治疗的广泛期SCLC患者仅能生存6周-12周。SCLC的治疗以全身化疗为主，联合放疗和手术为辅助治疗手段。目前，临床上针对广泛期SCLC的主要一线化疗方案有：EP（足叶乙甙+顺铂）方案、CE（足叶乙甙+卡铂）和IP（依立替康+顺铂）方案，其中EP方案是最常用的治疗方案(20)。尽管SCLC对化疗呈现良好的初始反应，但很快便产生耐受，并出现复发。耐药的形成，尤

10、其是多药耐药性的产生是SCLC化疗失败最重要原因。SCLC产生多药耐药性的机制非常复杂，常有多种因素参与其中，国内外研究人员对SCLC的多药耐药性发生机制进行了广泛研究。目前，研究人员已经认识到SCLC 多药耐药性的产生与具有外排泵作用的膜蛋白如ABC转运蛋白过度表达有关。研究人员在耐药的SCLC组织和体外培养的SCLC细胞系中都发现MDR1、MRP-1和ABCG2表达增高(21)。ABC转运蛋白通过将进入SCLC细胞内的化疗药物泵出细胞外，降低细胞内药物浓度，最终使SCLC细胞获得耐药能力。癌症发病机制复杂，难于治疗且容易复发。近年来，随着表皮生长因子、血管内皮生长因子等肿瘤相关基因的发现和

11、研究，研究人员开发了多种针对这些基因的分子靶向药物，这些分子靶向药物不仅给常规放化疗失败的复发或转移晚期患者带来益处，同时在一线治疗中的应用也日趋广泛。针对癌细胞容易对化疗药物产生耐受，有研究人员提出分子靶向药物和化疗联合治疗方案。目前该种方案已经应用于肺癌治疗当中，且取得 了较好的疗效。来自Dana-Farber癌症研究所的研究人员发现化疗药物结合分子靶向药物selumetinib（MEK抑制剂）比单独使用化疗药物对KRAS的突变的非小细胞肺癌（NSCLC）更有效(22)。EGFR-TKI（吉非替尼和厄洛替尼）是目前为止唯一批准治疗化疗失败的复发转移晚期NSCLC的两个分子靶向药物，基础研究

12、显示某些化疗药物与EGFR-TKI联合有增效作用(23)。针对VEGF的单克隆抗体贝伐单抗是第一个被证实在NSCLC中联合化疗具有生存优势的靶向药物(24)。Sandler等发现贝伐单抗联合紫杉醇/卡铂一线治疗非鳞型晚期NSCLC与单纯紫杉醇/卡铂化疗比较，不仅能显著提高客观缓解率（27% vs 10%, P0.0001）还能延长无进展生存期(25)。 1癌细胞多药耐药性相关的ABC转运蛋白ABC转运蛋白是膜整合蛋白，广泛存在于真核生物和原核生物中，包括两个疏水的跨膜结构域（transmembrane domains，TMDs)和两个核苷酸结合域（cytoplasmic nucleotide-

13、binding domains，NBDs) (26)。ABC转运蛋白利用核苷酸结合域水解ATP获得的能量对细胞内各种生物分子进行跨膜转运，其转运的底物包括：药物、糖、多肽、金属离子、细胞代谢产物等(27)。目前，研究人员已经发现ABC转运蛋白家族成员P-糖蛋白(P-glycoprotein，PgP)、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance associated protein，MRP)和乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)与癌细胞多药耐药性相关(26) (27)。1.1 PgPPgP是由多药耐药基因MDR1编码的一种跨

14、膜糖蛋白，它属于典型的ABC(ATP- binding cassette)转运蛋白超家族成员。PgP是一个ATP依赖性的药物外排泵，能利用ATP水解释放的能量主动将疏水亲脂性化疗药物转运至细胞外，导致细胞内药物浓度低予杀伤浓度，从而使肿瘤细胞产生多药耐药性。一般与疏水性药物(如阿霉素)引起的耐药有关(28)。1.2 MRPMRP与PgP有某种程度上的序列同源性，同属ABC转运蛋白超家族。MRP可通过促进谷胱甘肽结合药物从细胞内的排出而产生MDR，其介导的耐药性弱于Pgp介导的耐药性。研究表明由MRP引起的多药耐药的肿瘤有胃癌、食管癌、乳腺癌等，其中MRP的高表达参与了食管癌耐药的形成(29)。

15、1.3 ABCG2ABCG2属于ABC转运蛋白家族中的半转运蛋白。两个BCRP分子通过二硫键形成同源或异源二聚体后才具有转运活性。现普遍认为位于第三个跨膜区的Arg482及其突变体与肿瘤细胞耐药性的产生密切相关 。BCRP可以降低阿霉素、柔红霉素等在肿瘤细胞内的积累从而产生耐药性(30)。2. 慢病毒载体介导基因表达上调或下调 慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞。对于一些较难转染的细胞， 如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢

16、病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。所以，在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒己经成为表达外源基因或外源shRNA的常用载体形式之一， 并且正在获得越来越广泛的应用。参考文献1. GovindanR，PageN，MorgenszternD，etcChanging epidemiology of small cell lung cancer in the United States over the last 30 years: analysis of

17、 the surveillance, epidemiologic, and end result databaseJ Clin Oncol,2006，24(28):4539-45442. Schultz SJ, Fry AM, Sutterlin C, Ried T, Nigg EA. Cell cycle-dependent expression of Nek2, a novel human protein kinase related to the NIMA mitotic regulator of Aspergillus nidulans. Cell Growth Differ. 199

18、4;5:625-635.3. Fry AM, Meraldi P, Nigg EA. A centrosomal function for the human Nek2 protein kinase, a member of the NIMA family of cell cycle regulators. EMBO J. 1998; 17:470-481.4. Mayor T, Hacker U, Stierhof YD, Nigg EA. The mechanism regulating the dissociation of the centrosomal protein C-Nap1

19、from mitotic spindle poles. J Cell Sci. 2002; 115:3275-3284.5. Mayor T, Stierhof YD, Tanaka K, Fry AM, Nigg EA. The centrosomal protein C-Nap1 is required for cell cycle-regulated centrosome cohesion. J Cell Biol. 2000; 151:837-846.7. Faragher AJ, Fry AM. Nek2A kinase stimulates centrosome disjuncti

20、on and is required for formation of bipolar mitotic spindles. Mol Biol Cell. 2003; 14:2876-2889.8. Sonn S, Khang I, Kim K, Rhee K. Suppression of Nek2A in mouse early embryos confirms its requirement for chromosome segregation. J Cell Sci. 2004; 117:5557-5566.9. Prigent C, Glover DM, Giet R. Drosoph

21、ila Nek2 protein kinase knockdown leads to centrosome maturation defects while overexpression causes centrosome fragmentation and cytokinesis failure. Exp Cell Res. 2005; 303:1-13.10. Fry AM, Mayor T, Meraldi P, Stierhof YD, Tanaka K, Nigg EA. C-Nap1, a novel centrosomal coiled-coil protein and cand

22、idate substrate of the cell cycle-regulated protein kinase Nek2. J Cell Biol. 1998;141: 1563-1574.11. Sonn S, Jeong Y, Rhee K. Nip2/centrobin may be a substrate of Nek2 that is required for proper spindle assembly during mitosis in early mouse embryos. Mol Reprod Dev. 2008.12. Bahmanyar S, Kaplan DD

23、, Deluca JG, et al. beta-Catenin is a Nek2 substrate involved in centrosome separation. Genes Dev. 2008;22:91-105.13. Fu G, Ding X, Yuan K, et al. Phosphorylation of human Sgo1 by NEK2A is essential for chromosome congression in mitosis. Cell Res. 2007;17: 608-618.14. Zhou W, Yang Y, Xia J, et al. N

24、EK2 induces drug resistance mainly through activation of efflux drug pumps and is associated with poor prognosis in myeloma and other cancers. Cancer Cell. 2013; 23(1):4862.15. Zhong X, Guan X, Dong Q et al,. “Examining Nek2 as a better proliferation marker in non-small cell lung cancer prognosis,”

25、Tumor Biology, vol 35, no. 7, pp. 7155-7162, 2014.16 Gergely S, Jill KP, Joseph AL, et al. Targeting multidrug resistance in cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 2006; 5:219-234 17. Modok S, Mellor HR, Callaghan R. Modulation of multidrug resistance efflux pump activity to overcome chemoresistance

26、 in cancer. Current Opinion in Pharmacology. 2006; 6(4):350354. 18. Cheol HC. ABC transporters as multidrug resistance mechanisms and the development of chemosensitizers for their reversal. Cancer Cell Int. 2005;5:3019. Kazushi S, Toshio K, Takeshi S, et al. Novel combination treatment for colorecta

27、l cancer using Nek2 siRNA and cisplatin. Cancer Sci. 2010;101(5):1163-116920. 姚南, 姜雷, 杨克虎, 等. 依立替康联合顺铂与足叶乙甙联合顺铂治疗广泛期小细 胞肺癌的系统评价. 中国肺癌杂志，2009，12（8）：884-44421. 陈一天，封冰，陈龙邦. 小细胞肺癌化疗耐药研究进展. 医学研究生学报，2012,25 （5）：515-518 22. Jnne PA, Shaw AT, Pereira JR. Selumetinib plus docetaxel for KRAS-mutant advanced n

28、on-small-cell lung cancer: a randomised, multicentre, placebo-controlled, phase 2 study. Lancet Oncol.2013;14(1):38-4723. Pircher A, Manzl C, Fiegl M. Overcoming resistance to first generation EGFR TKIs with cetuximab in combination with chemotherapy in an EGFR mutated advanced stage NSCLC patient.

29、Lung Cancer. 2014;83(3):408-41024. Sandler A, Gray R, Perry MC, et al. Paclitaxel-carboplatin alone or with bevacizumab for Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med, 2006;355(24):2542-2550.25. Sandler A, Gray R, Perry MC. Paclitaxel-carboplatin alone or with bevacizumab for non-small-cell lung cance

30、r. N Engl J Med. 2006;355(24):2542-255026. Michael D, Andrey R, Rando A. The Human ATP-Binding Cassette (ABC) Transporter Superfamily. Genome Res. 2001;11:1156-116627. 王慧娟，王启鸣，马智勇. ABC转运蛋白超家族与肺癌多药耐药. 中原医刊. 2006，33（8）：55-5728. Sauna Z, Ambudkar S. Evidence for a requirement for ATP hydrolysis at two

31、distinct steps during a single turnover of the catalytic cycle of human P-glycoprotein. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000; 97(6):2515-252029. Choudhuri S, Klaassen CD. Structure, function, expression, genomic organization, and single nucleotide polymorphisms of human ABCB1 (MDR1), ABCC (MRP), and ABCG2

32、 (BCRP) efux transporters. Int J Toxicol. 2006;25(4):231-259.30. Yoh K, Ishii G, Yokose T, et al. Breast cancer resistance protein impacts clinical outcome in platinum-based chemotherapy for advanced non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2004;10(5):1691-1697.（三）市场预测和发展趋势在美国，每年约有16万人死于肺癌，其中75的患者为非小细胞肺癌。最新统计资料显示，在我国主要城市中，肺癌的发病率已超过各种恶性肿瘤的发病率。我国每年有近100万人罹患肺癌，近80万人死于肺癌，其中，非小细胞肺癌患者约占80，小细胞肺癌约占20%。因此，关于肺癌的防治研究，成为当今最受人们关注的研究之一。 以每个受检者费用1000元计，市场开拓期预计每年100个检测服务，则每年效益为10万元；成熟市场预计每年1000个检测服务，则每