蛋白质提取与制备的原理和方法.docx

1、蛋白质提取与制备的原理和方法蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不 同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固左的程序适用各类蛋 白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、 稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因 此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水 基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的 内因。温度、pH、离子强度等

2、是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外 因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与英它不需要的物质分开。但动物材料中的 蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分 离。蛋白质中的角蛋白、胶原及线蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随 物，如脂类、糖类以及英他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞 破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即 得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定 性及溶解度均能增加。如球蛋白类能溶于

3、稀盐溶液中，脂蛋白可用稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂昔（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。英它不 溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。蛋白质类别和溶解性质白蛋白和球蛋白：溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸彼析出。真球蛋白：一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。拟球蛋白：溶于水，可为50%饱和度硫酸彼析出醇溶蛋白：溶于7080%乙醇中，不溶于水及无水乙醇壳蛋白：在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液精蛋白：溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀组蛋白：溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀硬蛋白质：不溶于水、盐、稀酸及稀碱缀合蛋白（包括磷蛋白、粘

4、蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等）：此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外, 一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如脂肪部分露于外，则脂溶性占优势，如脂肪部分 被包用于分子之中，则水溶性占优势。蛋白质的制备是一项十分细致的工作。涉及物理学、化学和生物学的知识很广。近年来虽然有 了不改进，但英主要原理仍不外乎两个方面: 一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相 中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等: 二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目 的

5、，如电泳、超离心、超滤等。由于蛋白质不能溶化，也不能蒸发，所能分配的物相只限于固 相和液相，并在这两相间互相交替进行分离纯化。制备方法可按照分子大小、形状、带电性质及溶解度等主要因素进行分类。按分子大小和形态 分为差速离心、超滤、分子筛及透析等方法：按溶解度分为盐析、溶剂抽提、分配层析、逆流 分配及结晶等方法；按电荷差异分为电泳、电渗析、等电点沉淀、离子交换层析及吸附层析等: 按生物功能专一性有亲合层析法等。由于不同生物大分子结构及理化性质不同，分离方法也不一样。即同一类生物大分子由于 选用材料不同，使用方法差别也很大。因此很难有一个统一标准的方法对任何蛋白质均可循用。 因此实验前应进行充分调

6、查研究，查阅有关文献资料，对欲分离提纯物质的物理、化学及生物 学性质先有一泄了解，然后再着手进行实验工作。对于一个未知结构及性质的试样进行创造性 的分离提纯时，更需要经过各种方法比较和摸索，才能找到一些工作规律和获得预期结果。其 次在分离提纯工作前，常须建立相应的分析鉴左方法，以正确指导整个分离纯化工作的顺利进 行。高度提纯某一生物大分子，一般要经过多种方法、步骤及不断变换各种外界条件才能达到 目的。因此，整个实验过程方法的优劣，选择条件效果的好坏，均须通过分析鉴泄来判明。3楼 物理方法主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。I反复冻融法于冷藏库或干冰反复于零下1520C使之冻固，然

7、后缓慢地融解，如此反 复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。由于渗透压的变化，使结合水冻结 产生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液， 但脂蛋白冻结变性。II冷热变替法将材料投入沸水中，于90C左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷 却，绝大部分细胞被破坏。II【超声波法暴壺于910千周声波或10500千周超声波所产生的机械振动，只要有设 备该法方便且效果也好，但一次处理量较小。应用超声波处理时应注意避免溶 液中气泡的存在。处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。IV加压破碎法加一泄气压或水圧也可使细胞破碎。化学及生物化学方法I有机溶媒法粉碎后的新鲜材料在0C以下加入

8、510倍量的丙酮，迅速搅拌均匀，可破 碎细胞膜，破坏蛋白质与脂质的结合。蛋白质一般不变性，被脱脂和脱水成为 干燥粉末。用少疑乙瞇洗，经滤纸干燥，如脱氢酶等可保存数月不失去活性。 II自溶法将待破碎的鲜材料在一立pH和适当的温度下，利用自身的蛋白酶将细胞破 坏，使细胞内含物释放出来。比较稳左，变性较难，蛋白质不被分解而可溶化。 利用该法可从胰脏制取竣肽酶。自体融解时需要时间，需加少疑甲苯、氯仿等。 应防止细菌污染。于温室30C左右较早溶化。自体融解过程中PH显著变化，随 时要调pH.自溶温度选在04C,因自溶时间较长，不易控制，所以制备活 性蛋白质时较少用。III酶法与前述的自体融法同理，用胰蛋

9、白酶等蛋白酶除去变性蛋白质。但值得提 出的是溶菌酶处理时，它能水解构成枯草菌等菌体膜的多糖类。能溶解菌的酶 分布很广。尤英卵白中含疑高，而多易结晶化。lg菌体加110陀溶菌酶，p H6. 27. Olh内完全溶菌。于生理食盐水或0. 2mol蔗糖溶液中溶菌，虽失去细 胞膜，但原形质没有脱岀。除溶菌酶外，蜗牛酶及纤维素酶也常被选为破坏细 菌及植物细胞用。表面活性剂处理较常用的有十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基毗淀及去氧胆酸钠等。此外一些细胞膜较脆弱的细胞，可把它们置于水或低渗缓冲剂中透析将细 胞胀破。2、细胞器的分离制备某一种生物大分子需要采用细胞中某一部分的材料，或者为了纯化某 一特左细胞器上的生

10、物大分子，防止其他细胞组分的干扰，细胞破碎后常将细 胞内各组分先行分离，对于制备一些难度较大需求纯度较高的生物大分子是有 利的。尤其近年来分子生物学、分子遗传学、遗传工程等学科和技术的发展， 对分布在各种细胞器上的核酸和蛋白质的研究工作日益增多，分离各种细胞器 上的各类核酸和特异性蛋白质已成为生物大分子制备工作重要内容之一。各类 生物大分子在细胞内的分布是不同的。DNA几乎全部集中在细胞核内。RNA则大 部分分布于细胞质。各种酶在细胞内分布也有一立位宜。因此制备细胞器上的 生物大分子时，预先须对整个细胞结构和各类生物大分子在细胞内分布匹有所 了解。以肝细胞为例，蛋白质、酶及核酸在肝细胞内分布情

11、况为： 细胞核： 精蛋白、组蛋白、核酸合成酶系RNA占总量10喘左右DA几乎全部粒线体： 电子传递、氯化磷酸化、三竣酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸氧化、腮合成等酶系RNA占总量5$左右 DNA微量 内质网（微粒体）： 蛋白质合成酶系、疑化酶系RNA占总量50%左右溶酶体： 水解酶系（包括核酸酶、磷酸脂酶、组织蛋白酶及糖昔及糖昔酶等） 高尔基氏体：糖昔转移酶、粘多糖及类固醇合成酶系细胞膜： 载体与受体蛋白、特异抗蛋、ATP酶、环化腺昔酶、5 -核昔酸酶、 琥珀酸脱氢酶、匍萄糖-6-磷酸酶等，细胞液喀咙和嚓吟代谢、氨基酸合成酶系、可溶 性蛋白类RNA （主要为tRNA）占总30%.细胞器的分离一般采用

12、差速离心法。细胞经过破碎后，在适当介质中进行差速 离心。利用细胞各组分质量大小不同，沉降于离心管内不同区域，分离后即得 所需组分。细胞器的分离制备、介质的选择十分重要。最早使用的介质是生理 盐水。因它容易使亚细胞颗粒发生聚集作用结成块状，沉淀分离效果不理想， 现一般改用蔗糖、Ficoll （种蔗糖多聚物）或匍萄糖-聚乙二醇等髙分子溶液。4楼1.水溶液提取大部分蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中。因此蛋白质的提取一 般以水为主。稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳立性好、溶度大，也是提取蛋白 质的最常用溶剂。以盐溶液及缓冲液提取蛋白质经常注意下面几个因素。 盐浓度等渗盐溶液尤以0. 020. 05m

13、ol/L磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液常用。0. 1 5mol/L氯化钠溶液应用也较多。如6-磷酸葡萄糖脱氢酶用0. lmol/L碳酸氢钠液 提取等。有时为了螯合某些金属离子和解离酶分子与英他杂质的静电结合，也 常使用枸椽酸钠缓冲液和焦磷酸钠缓冲液。有些蛋白质在低盐浓度下浓度低， 如脱氧核糖核蛋白质需用lmol/L以上氯化钠液提取。总之，只要能溶解在水溶 液中而与细胞颗粒结合不太紧密的蛋白质和酶，细胞破碎后选择适当的盐浓度 及PH, 般是不难提取的。只有某些与细胞颗粒上的脂类物质结合较紧的，需 采用有机溶剂或加入表面活性剂处理等方法提取。PH值蛋白质提取液的PH值首先应保证在蛋白质稳定的范围内，即

14、选择在偏离等 电点两侧。如碱性蛋白质则选在偏酸一侧，酸性蛋白质选择偏碱一侧，以增大 蛋白质的溶解度，提高提取效果。如细胞色素C属碱性蛋白质，常用稀酸提取, 肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质，用稀碱提取。某些蛋白质或酶与其分 物质结合常以离子键形式存在，选择PH36范围对于分离提取是有利的。 温度多数酶的提取温度在5C以下。少数对温度耐受性较高的蛋白质和酶，可适 当提髙温度，使杂蛋白变性分离且也有利于提取和进一步纯化如胃蛋白酶等 及许多多肽激素类，选择3750C条件下提取，效果比低温提取更好。此外提取酶时加入底物或辅酶，改变酶分子表面电荷分布，也能促进提取 效果。2.有机溶剂提取有机溶剂提

15、取用于提取蛋白质的实例至今是不多的。但一些和脂结合较牢或 分子中非极性侧链较多的蛋白质，不溶于水、稀盐或稀碱液中，可用不同比例 的有机溶剂提取。从一些粒线体（Mitochondria）及微粒体（Microsome）等含 多量脂质物质中提取蛋白质时，采用Morton的丁醇法效果较好。因丁醇使蛋白 质的变性较少，亲脂性强，易透入细胞内部，与水也能溶解10%,因此具有脂质 与水之间的表而活性作用，可占据蛋白质与脂质的结合点，也阻碍蛋白质与脂 质的再结合，使蛋白质在水中溶解能力大大增加。丁醇提取法的pH及温度选择 范用较广（pH310,温度-2至40C）。国内用该法曾成功地提取了琥珀酸脱 氢酶。丁醇法

16、对提取碱性磷酸脂酶效果也是十分显著的。胰岛素既能溶于稀酸、 稀碱又能溶于酸性乙醇或酸性丙酮中。以60-70%的酸性乙醇提取效果最好，一 方而可抑制蛋白质水解酶对胰岛素的破坏，同时也达到大量除去杂蛋白的目的。3.表而活性剂的利用对于某些与脂质结合的蛋白质和酶，也有采用表而活性剂如胆酸盐及十二 烷基磺酸钠等处理。表而活性剂有阴离子型（如脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐及胆酸盐等），阳离子 型（如氧化节烷基二甲基彼等）及非离子型（Triton X-100、Tirton X-ll4.吐温60及吐温80）等。非离子型表而活性剂比离子型温和，不易引起酶失活, 使用较多。对于膜结构上的脂蛋白和结构，己广泛采用胆酸盐处

17、理，两者形成 复合物，并带上净电荷，由于电荷再排斥作用使膜破裂。近年来研究膜蛋白使 用表而活性剂的稀溶液提取时，较喜欢用非离子型表面活性剂。4.对提取物的保护在各种细胞中普遍存在着蛋白水解酶，提取时要注意防止由它引起的水解。 前面所讲的降低提取温度英目的之一也是防止蛋白水解酶的水解。多数蛋白水 解酶的最适PH在35或更高些，因在较低PH条件下可降低蛋白质水解酶引起 的破坏程度。低pH可使许多酶的酶原在提取过程中不致激活而保留在酶原状 态，不表现水解活力。加蛋白质水解酶的抑制剂也同样起保护作用，如以丝氨 酸为活性中心的酶加二异丙基氟磷酸，以兢基为中心的酶加对氯汞苯甲酸等。 提取溶液中加有机溶剂时

18、也能产生相类似的作用。蛋白水解酶的性质变化很大, 上述条件均视具体对象而变化。200S-3-26 16:21有一些蛋白含兢基，这些猛基可能是活性所必需。在提取这种蛋白不要带 入金属离子和氧化剂。前者可往提取液中加金属螯合剂如EDTA,后者可加入还 原剂如抗坏血酸。有某些蛋白质带一些非共价键结合的配基。提取时要注意保 护，不要使酸基丢失。蛋白质提取与制备的方法：1.分离纯化的原则从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的，需进一步纯化。纯化包括将 蛋白质与非蛋白质分开，将各种不同的蛋白质分开。选择提取条件时，就要考 虑尽量除去非蛋白质。一般总是有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质（如 脂肪）以事先

19、除去为宜。先除去便于以后操作。常用有机溶剂提取除去。对于异类物质，提纯蛋白质和酶时常混有核酸或多糖，一般可用专一性酶 水解，有机溶剂抽取及选择性部分沉淀等方法处理。小分子物质常在整个制备 过程中通过多次液相与固相转化中被分离或最后用透析法除去。而对同类物质 如酶与杂蛋白、RNA、DNA以及不同结构的蛋白质、酶、核酸之间产分离，情况 则复杂得多。主要采用的方法有盐析法、有机溶剂沉淀法，等电点沉淀法、吸 附法、结晶法、电泳法、超离心法及柱层析法等。英中盐析法、等电点法及结 晶法用于蛋白质和酶的提纯较多，有机溶剂抽提和沉淀用于核提纯较多，柱层 析法、梯度离心法对蛋白质和核酸的提纯应用十分广泛。如前所

20、述，蛋白质的 分离纯化较难，而且其本身的性质又限制了某些方法的使用，因此要研究目的 物的微细特征，巧妙的联用备种方法并进行严密的操作，同时有必要了解精制 各过程的精制程度和回收率。具有活性的蛋白质可利用吸收光谱等物理性质或 以相当于单位氮活性增加为尺度进行追踪。苴他蛋白质可用电泳、超离心、层 析、扩散及溶解等测定纯度。如结晶核糖核酸酶经层析分为两个成分。可见对 确定蛋白质结晶纯度尚无最终的尺度。根据经验即或纯净的标准品，有极微戢 的不纯物时，也会给实验带来较大的影响。不稳立的蛋白质，如分离SH-酶时 使用试剂及缓冲液等，要确认不含重金属离子（特级试剂也需检龙）。蛋白质纯 化的操作如脱盐、浓缩干

21、燥等均与低分子化合物不同，必须经过独特的繁琐操 作。蛋白质和蛋白质相互分离主要利用它们之间的并种性质的微小差别。诸如 分子形状、分子量大小、电离性质、溶解度、生物功能专一性等。蛋白质提取 液中，除包含所需要的蛋白质（或酶）夕卜，还含有苴它蛋白质、多糖、脂类、 核酸及肽类等杂质。杂质除去的方法有：A.核酸沉淀法该法可用核酸沉淀剂和氯化徭、硫酸鱼精蛋白或链監素等。必要时也可用 脱氧核糖核酸酶除去核酸。即在粗匀浆中加入少量DNase,于4C保温3060min, 可使DNA降解为足够小的碎片，以致不影响以后的纯化。B.醋酸铅沉淀法利用醋酸铅沉淀剂除去杂蛋白。因这些沉淀剂也常常使需要的酶（或蛋白质） 缓

22、缓变性而失去活性，所以用这类试剂时应迅速进行盐析，使样品与这类试剂 脱离接触。C.调pH值或加热沉淀法利用蛋白质酸碱变性性质的差异除去杂蛋白。利用蛋白质的热变性的温度 系数差异，可在一泄的PH下将蛋白提取液加热到一泄的温度，使对热不稳左的 杂蛋白性沉淀而除去。D.选择性变性法利用各种蛋白质稳左性的不同，可用选择性变性法来除去杂蛋白。例如胰 蛋白爾及细胞色素C等少数特别稳左的酶，甚至可用2.旅三氯醋酸处理，此时 其它杂蛋白均变性而沉淀，而胰蛋白酶和细胞色素C则仍留在溶液中。E.透析法小分子物质常在整个制备过程中多次液相与固相互转化中被分离，或最后 用透析法除去。F.利用溶解度不同的纯化方法2.盐

23、析法盐析法对于许多非电解质的分离纯化均适合。对蛋白质和酶的提纯应用也 最早。至今还广泛使用，一般粗抽提物经常利用盐析法进行粗分。也有反复用 盐析法得到纯的蛋白质的例子。英原理是蛋白质在低盐浓度下的溶解度随盐液 浓度升高而增加（盐溶，与离子强度101间成比例增加）。球蛋白当盐浓度不 断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出（盐析）（离子强度I 210）。这是由于蛋白质分子内和分子间的电荷的极性基团有静电引力。当水 中加入少量盐时，盐离子与水分子对蛋白质分子一的极性基团的影响，使蛋白 质在水中溶解度增大。但盐浓度增加一泄程度时，水的活度降低，蛋白质表而 的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于

24、是蛋白质相互聚集而沉淀析出。盐析法 是根据不同蛋白质在一左浓度盐溶液中溶解度降低程度不同达到彼此分离的方 法。6楼 盐的选择如上所述，蛋白质在水中溶解度取决于蛋白质分子上离子基团周用的水分 子数目，即取决于蛋白质的水合程度。因此，控制水合程度，也就是控制蛋白 质的溶解度。控制方法最常用的是加入中性盐。主要有硫酸彼、硫酸镁、硫酸 钠、氯化钠、磷酸钠等。苴中应用最广的是硫酸彼，它的优点是温度系数小而 溶解度大（25C时饱满和溶解度为4. Imol,即767g/l;0C时饱满和溶解度为3. 9 mol,即676g/l）o在这一溶解度范囤内，许多蛋白质均可盐析岀来，且硫酸钱价 廉易得，分段效果较其它盐

25、好，不易引起蛋白质变性。应用硫酸彼时对蛋白氮 的测泄有干扰，另外缓冲能力较差，故有时也应用硫酸钠，如盐析免疫球蛋白， 用硫酸钠的效果也不错，硫酸钠的缺点是30C以下溶解度太低。其它的中性盐 如磷酸钠的盐析作用比硫酸彼好，但也由于溶解度太低，受温度影响大，故应 用不广。氯化钠的溶解度不如硫酸彼，但在不同温度下它的溶解度变化不大， 这是方便之处。它也是便宜不易纯化的试剂。硫酸鞍浓溶液的PH常在4. 55. 5之间，市售的硫酸彼还常含有少量游离硫 酸,PH值往往降至4. 5以下，当用英他PH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节.确定沉淀蛋白质所需硫酸彼浓度的方法将少量样品冷却到05C,然后搅拌加入固体硫

26、酸钱粉末，见蛋白质产生沉 淀时，禽心除去沉淀，分析上淸液确立所要蛋白质的浓度，如它仍在溶液中则 弃去沉淀，再加更多的硫酸彼于上淸液中，直到产生蛋白质沉淀时止。以所要 提取的蛋白质在溶液中的浓度对硫酸钱浓度作图，得沉淀曲线，找出蛋白质开 始沉淀的浓度。如不考虑收率，饱和度区间可取得窄一些，使纯度高一些。 盐析时注意的几个问题：(1)盐的饱和度：不同蛋白质盐析时要求盐的饱和度不同。分离几个混合组成 的蛋白质时，盐的饱和度常由稀到浓渐次增加。每出现一种蛋白质沉淀进行离 心或过滤分离后，再继续增加盐的饱和度，使第2种蛋白质沉淀。例如用硫酸鞍 盐析分离血浆中的蛋白质饱和度达20弔时，纤维蛋白原首先析岀：

27、饱和增至28 33%时，优球蛋白析出；饱和度再增至3350%时，拟球蛋白析出：饱和度大于5 0%以上时淸蛋白析出。用硫酸彼不同饱和度分段盐析法，可从牛胰酸性提取液 中分离得到9种以上蛋白质及酶。(2)PH值：pH值在等电点时蛋白质溶解度最小易沉淀析岀。因此盐析时除个 别特殊情况外，pH值常选择在被分离的蛋白质等电点附近。由于硫酸披有弱酸 性，它的饱和溶液的pH值低于7,如所要蛋白质遇酸易变性则应在适当缓冲液 中进行。(3)蛋白质浓度：在相同盐析条件下蛋白质浓度愈髙愈易沉淀。使用盐的饱和 度的极限也愈低。如血淸球蛋白的浓度从0. 5%增至3. 0弔时,需用中性盐的饱和度 的最低极限从29%递减至

28、24%.某一蛋白质欲进行两次盐析时，第1次由于浓度较 稀，盐析分段范国较宽，第2次则逐渐变窄.例如胆碱酯酶用硫酸彼盐析进时，第1 次硫酸讓饱和度为35%至60%,第2次为40%至60$.蛋白质浓度髙些虽然对沉淀有 利，但浓度过高也易引起杂蛋白的共沉作用.因此，必须选择适当浓度尽可能避 免共沉作用的干扰。(4)温度： 由于浓盐液对蛋白质有一泄保护作用，盐析操作一般可在室温下进 行。至于某些对热特別敏感的酶，则宜维持低温条件。通常蛋白质盐析时对温 度要求不太严格。但在中性盐中结晶纯化时，温度影响则比较明显。(5)脱盐： 蛋白质用盐析法分离沉淀后，常需脱盐才能获得纯品。脱盐方法最 常用的是透析法。透

29、析法所需时间较长，常在低温下进行并加入防腐剂避免微 生物污染。透析使用前必须处理，方法是将透析袋巻于0. 5mol/LEDTA溶液中煮 0. 5h,弃去溶液,用蒸霜水洗净，置50%甘油中保存备用。也可用分子筛层析，常用SephadexG-25柱层析法，上样不要超过床体积的 20%。此外，有些金属离子能和蛋白质形成较为专一的结合而使蛋白质沉淀。这 虽不是典型的盐析，但在制备蛋白质中有许多成功的例子。锌离子在特左pH下 与胰岛素结合形成沉淀就是这种例子。7楼 蛋白质从悬浮液中沉淀出来的速度极慢，必须用强力离心来促进这个过程。3.有机溶剂分离纯化法有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不

30、同电荷的引力, 导致溶解度降低。有机溶剂与水作用能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定 浓度的有机溶剂中沉淀析出。常用的有机溶剂是乙醇和丙酮，由于有机溶剂的 加入易引起变性失活，尤其乙醇和水混合释放热呈:，操作一般宜在低温下进行, 且在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以免局部浓度过大。用此法所析出的沉淀一 般比盐析法易过滤或离心沉降。分离后的蛋白质沉淀应立即用水或缓冲液溶解, 以降低有机溶剂的浓度。操作时的pH值大多数控制在待沉淀蛋白质等电点附 近。有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性和提高分离的 效果。一般在有机溶剂沉淀时添加中性盐的浓度在0. 05mol左右,过多不仅耗费 有机溶剂

31、，而且可能导致沉淀不好沉淀的条件一经确定，就必须严格控制，才能 得到重复性结果有机溶剂浓度通常以有机溶剂和水容积比或用百分浓度素示. 故操作条件比盐析法严格。许多有机溶剂，如碳链较长的醇，它溶于水，但有限度。英量大到一左程 度后则分成两相，一相以水为主，一相以有机溶剂为主。某些第3组分的存在可 以改变两相的比例和组成。有许多蛋白质在两相中均能溶解，形成分配。在同 一个两相的溶剂系统中，不同的蛋白质有不同的分配系数。根据这一原理，操 作全部机械化的有逆流分溶。因要求实验室温度恒眾且操作也繁杂，虽一直有 人在用但很不普遍。分配层析也是应用这一原理，但在分离纯化蛋白质工作中 用得不多，主要是因为多数

32、蛋白质在有机溶剂中，特别是在易与水分相的溶剂 中溶解度小且易变性。4.疏水层析：是近年发展的新方法。它利用蛋白质表面有一部分疏水性， 与带有疏水性的载体在髙盐浓度时结合。洗脱时将盐浓度逐渐降低，蛋白质因 疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化。此法能分离英它一些方法不易纯化的 蛋白质。利用分子形状和大小不同的分离方法蛋白质形状有细长的如纤维，有密实的如圆球，形状很不相同。蛋白质的 分子量从6000左右开始，有各种大小，大的可以大到几百万。利用这些差别， 有几种方法可用来分离蛋白质。5.凝胶层析属最常用的蛋白质分离方法。系混合物随流动相流经装有凝胶作为固左相 的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。所指凝胶从广 义上说是一类具有三维空间多孔网状结构的物质，如天然物质中的马铃萼淀粉 及琼脂糖凝胶，人工合成品的匍聚糖凝胶及带离子交换基团的葡聚糖凝胶等。 把适当的凝胶颗粒装填到玻璃管中制成层析柱，于柱内加入欲分离的混合物， 然后用大量蒸镭