小肽测定.docx

1、小肽测定发酵大豆蛋白中小肽的测定1、原理：利用三氯醋酸作蛋白质沉淀剂，将发酵大豆蛋白中的蛋白质和肽链较长的肽沉淀，并将其中的短链小肽用酸溶解出来，经过滤、离心、消化、蒸馏，测定其蛋白质含量，并以其占样品粗蛋白质的百分数来表示含量。本方法是参照中华人民共和国轻工行业标准大豆肽粉标准(QB/ T 2653 -2004)基础上修订而来。2、试剂及仪器：1）100ml烧杯；2）10ml，50ml移液管；3）干过滤装置；4）半微量法或全量法粗蛋白质测定的试剂和装置；5）15三氯醋酸溶液；6）4000 转/ 分钟的离心机。3、方法：准确称取样品6克于100 ml烧杯中,准确加入15 %三氯乙酸溶液50 毫

2、升，混合均匀，静置5 分钟，以中速定性滤纸干过滤，弃去少许初始滤液，将滤液转移至离心管，在4000 转/ 分钟下离心10 分钟，准确移取其上清液10ml于消化管中，按半微量法（消化后定容至100ml，准确移取其中10ml进行蒸馏）或全量法粗蛋白质测定方法测定其粗蛋白质含量。同时做空白试验、测定样品的粗蛋白质的含量。4、结果与计算：小 肽%（半微量法）=（V1V0）C6.250.014105m100%CP100%小 肽%（全量法）=（V1V0）C6.250.0145m100%CP100% 式中： V1-馏出液消耗盐酸标准液的体积，ml；V0-空白试验消耗盐酸标准液的体积，ml；C-盐酸的摩尔浓度

3、，mol/l；6.250.014-蛋白质转换系数；m-称取样品质量，；CP样品的粗蛋白质含量，%。重复性: A）、每个试样的两个平行样间允许相对偏差为其算术平均值的10%，以其算术平均值上报结果； C）、所得的结果是指小肽占粗蛋白质的百分含量。因其中含有无机氮，测得结果应减去无机氮，见非蛋白氮的测定。测定小肽含量时，是如何区分小肽及游离氨基酸的？饲用小肽产品中，小肽含量是表现小肽产品中是“肽”，而非“原蛋白或“游离氨基酸”的一个最重要的技术指标。蛋白质经蛋白酶水解，其水解中间产物为胨、肽等，最终产物为氨基酸，肽产品的总蛋白质含量包括未被水解的蛋白质和所有水解中间产物，如部分水解蛋白、胨、肽及游

4、离氨基酸的总量。小肽的分子量小于2000道尔顿，小肽含量指标反映了产品中小肽的实际含量。 肽含量是通过检验产品中酸溶蛋白质和游离氨基酸含量，经计算差值而得。酸溶蛋白质是指能够溶解于15TCA(三氯乙酸)溶液的可溶性蛋白，测定中除去了未水解的较大分子量的蛋白质，其结果显示出产品中(分子量在2000Dalton以下的)肽的含量。这种方法的测定结果对肽含量的范围比较敏感，一般只能对肽含量大于15的产品测定有实际意义，对低肽含量的产品，需要继续改造才能比较。比如，把用15TCA沉淀改成用一定浓度的乙醇溶液沉淀，测量的结果可能有新的变化。 超滤膜超滤法是目前测定小肽总含量比较简便的方法，产品溶解后，经初

5、步离心，上清夜分别通过截留分子量为100Dalton与10000Dalton的超滤膜，然后进行氨基酸含量测定，测定结果就是分子量在l00Dalton至10000Dalton的小肽段组分的含量。问：肽的测定方法-目前无国家标准，各位朋友可有好的方法？市场上很多保健品打着小肽含量高的招牌，但因小肽测定暂无国家标准，建议各位同仁，齐心协力，研究出可行的测定小肽的方法。 我处现有美国安捷伦HP1100高效液相色谱仪，相用于测定肽类物质，尤其是小肽中的二三肽含量，不知市场上的哪种柱的分离效果好，且测定的小肽含量结果更准确!相关的C18柱品种太多，不知选择哪个品牌，哪种型号，国产或是进口？ 我的联系方式：

6、0835-*答：你可以选择Waters 的Symmetry300的柱子，比多肽分析专用柱便宜，还可以得到好的分析和分离度。郭玉东 张 洋 张均国摘 要 小肽一般是指二肽或三肽，小肽饲料就是通过化学或生物方法将本来不适合动物利用的蛋白原料分解，制成含有大量小肽的饲料产品。小肽饲料的营养价值在于小肽的吸收优势和其自身的质量。根据影响小肽营养价值的因素，可以选取小肽的总含量、平均肽链长度、特定小肽的含量、特定氨基酸的含量作为评价小肽饲料营养价值的指标。目前小肽含量的测定方法主要有双缩脲法、福林-酚法、三氯乙酸法、甲醛滴定法、凯氏定氮法、紫外光吸收法、消光系数法、考马斯亮兰法、层析比色法、高效凝胶色谱

7、法、高效液相色谱法和CE-ESI-MS联用法。关键词 小肽；营养价值；评价指标中图分类号 S816.15The evaluation method for nutrition of small peptide feedGuo Yudong, Zhang Yang, Zhang JunguoAbstract Generally, small peptide includes depeptide and tripeptide. Small peptide feed, which contains a lot of small peptide, is produced with bad protei

8、n material by chemical or biological technique. The nutritional value of small peptide feed includes its advantage in absorption and its quality. Based on the facts which affect the small peptide feeds value, we choose total content of small peptide, average peptide length(APL), content of special p

9、eptide, and content of special amino acide as the index to evaluate the small peptide feed. The main assay methods include Biuret method, Lowry method, trichloroacetic acid method, formol-titration method, Kjeldahl determination method, UV absorption Spectrum, extinction coefficient method, Bradford

10、 method, chromatography and spectrophotometry, HPGC, HPLC and CE-ESI-MS.Key words small peptide；nuturition；assessment index传统的代谢模型认为蛋白质必须水解成氨基酸后才能被吸收利用，饲料中氨基酸比例符合理想蛋白质模型就能获得最大的营养效果。但近些年的研究表明，不同来源的饲料氨基酸利用率存在差异，而且在给动物喂以按理想氨基酸模式配制的纯合日粮或低蛋白质氨基酸平衡日粮时，不能获得最佳生产性能。现代研究认为，蛋白质在动物消化酶作用下的水解终产物大部分是由2个或3个氨基酸残基组成的

11、小肽，它们以完整的形式被吸收进入循环系统而被组织利用。以此理论为基础，很多饲料企业开发了小肽饲料，做为饲料添加剂应用于动物饲料中。但是到目前为止，小肽市场仍十分混乱，小肽产品良莠不齐，这归根结底是由于缺乏小肽营养标准。而科学的营养价值评价方法是营养标准的前提，本文对制定合适的小肽营养价值评价方法进行了一些探索，综述了评价小肽营养价值的指标和测定方法。1 小肽和小肽饲料的概念评价小肽饲料的营养价值，首先要对小肽和小肽饲料的概念有一个明确的定义。肽是氨基酸的线性聚合物，含氨基酸残基50 个以上的通常称为蛋白质，低于50 个氨基酸残基的称为肽。最简单的肽由两个氨基酸残基组成，称为二肽（dipepti

12、de），其中含一个肽键。含3个、4个、5个氨基酸残基的肽分别称为三肽、四肽、五肽。通常把含几个至十几个氨基酸残基的肽链统称为寡肽（oligopeptide），更长的肽链称为多肽（polypeptide）。有的学者把超过12个而不多于20个氨基酸残基的称寡肽，含20个以上氨基酸残基的称为多肽。在动物营养学上一般认为“含2个或3个氨基酸残基的肽为小肽”。小肽饲料是一种功能营养性添加剂，也称为小肽营养素。小肽饲料的产生是基于现代营养学的研究成果。研究者认为，蛋白质在消化道中的消化终产物的大部分往往是小肽而不是游离氨基酸(FAA)。小肽能完整地通过肠粘膜细胞进入体循环。小肽的吸收具有转运速度快、耗能低

13、、载体不易饱和等优点，且各种肽之间转运无竞争性与抑制性。小肽也是组织内氨基酸的重要来源之一，动物组织可以直接利用小肽中的氨基酸合成组织蛋白。根据这些研究结果，可以确定小肽是一种更优质的氮源。于是人们开始研究如何生产小肽饲料。在当前的生产工艺下，小肽饲料就是通过化学或生物方法将本来不适合动物利用的蛋白原料分解，制成的含有大量小肽的饲料产品。现在生产小肽饲料的方法主要有酸解法、酶解法、微生物发酵法三条途径。酸解法通过强酸、强碱的作用分解大分子蛋白为小分子肽，由于强酸、强碱具有腐蚀性, 该法会带来大量的污染；酶解法利用酶的定向分解的特性将大分子蛋白分解为小分子肽；微生物发酵法是利用微生物的生化反应将

14、蛋白转化为肽。仅就制备小肽来说还有化学合成法、重组DNA法等，但目前仍不适合商业化生产。目前市场上很多小肽饲料并不符合小肽的定义，简单地把寡肽甚至分子量较小的多肽称为小肽，这样做忽略了小肽和寡肽、多肽的区别。肽链的长度是影响肽吸收的原因之一，肽转运主要限于二肽、三肽, 对长链肽大量转运的可能性很小，这样的饲料产品其实并不具有小肽在吸收方面的特点。2 影响小肽饲料营养价值的因素作为一种饲料产品，小肽饲料的营养价值一方面在于小肽在吸收方面相对于FAA的巨大优势，另一方面取决于饲料本身的质量。2.1 影响小肽吸收的因素2.1.1 肽链的长度目前的研究认为，二肽和三肽能被完整的吸收，但三肽以上的寡肽是

15、否能完整吸收还有争议。Grimble 等报道，肠道对大于三肽的寡肽吸收慢于小肽，肠道内胰蛋白酶、肽酶对其进一步水解可能是寡肽吸收的主要限速反应。当蛋白质水解产物中的寡肽和FAA所占比例较高时，寡肽能诱导肠肽酶的分泌，在肠肽酶的进一步作用下水解释放出FAA，使FAA的浓度提高，从而加剧 FAA吸收的竞争抑制，进一步减慢肽的吸收速率。但是，反刍动物瘤胃细菌对大分子肽的摄取速度比小分子肽和氨基酸摄取速度快，且利用效率更高，虽然细菌对低分子量的蛋白质降解产物（小分子量的肽和氨基酸）发酵较快，但大分子肽更容易转化为菌体蛋白质。2.1.2 肽的氨基酸残基组成肽的氨基酸残基组成是影响肽吸收的另一个重要因素。

16、当赖氨酸(Lys)与甘氨酸(Gly)形成二肽时，Lys处于N端比处于C端吸收得更快；而Lys与谷氨酸(Glu)形成二肽时，Lys处于C端时吸收更为迅速。L型小肽比D型小肽更易被动物吸收，中性小肽比酸、碱性小肽更易被动物吸收。当肽是由疏水性且体积较大的底物如Met和Phe构成时，载体对肽就有较高的亲合力，因而转运速度较快；而亲水性且带电荷的小肽，载体对其亲合力较小，所以转运速度较慢。乐国伟等研究发现，含疏水性的苯丙氨酸的肽类对肽载体的亲和力高，以肽形式吸收可能是苯丙氨酸吸收本身的需要。Broderick等研究了混合瘤胃微生物对中性肽的代谢，发现含有3个丙氨酸残基的肽代谢最快，其次是Leu(Gly

17、)2、Gly(Ala)2，然后是其它中性三肽、二肽代谢速度相似，但Gly-Pro较慢，(Ala)2代谢较Gly-Pro快；在由丙氨酸残基构成的肽中，三肽代谢速度大于四肽，然后是五肽，二肽最慢。由此可见，肽链的氨基酸序列对肽的利用率也有影响。通过研究Lys-Pro肽、Lys-Ala肽、Met-Ala肽的效应发现，前两种肽的代谢速度比后一种肽慢4倍。2.1.3 肽的来源程茂基等通过体外培养发现，反刍动物对瘤胃液肽的摄取量和摄取率显著高于大豆肽（P0.05）和玉米肽(P0.05)，表明肽来源不同能影响其吸收和利用。2.2 决定小肽饲料质量的因素2.2.1 小肽饲料中小肽的含量小肽是小肽饲料中的有效成

18、分。不同生产工艺下小肽饲料中小肽的含量是不同的，小肽含量的高低决定了小肽饲料的营养价值。小肽含量既要求饲料中要有足够的肽，又对这些肽的分子量有要求。2.2.2 小肽饲料中高价值氨基酸的含量小肽最终是要进入动物体内充当动物组织蛋白的氨基酸残基。不同的氨基酸在体内的重要性大不相同。以赖氨酸、蛋氨酸等限制性氨基酸的残基为主要组成成分的小肽必然具有更高的营养价值。另外，一些氨基酸之间存在拮抗作用，包含这些氨基酸残基的小肽其营养价值也会高于其它小肽。2.2.3 小肽饲料的特殊功能除了作为蛋白饲料应具有的营养价值外，小肽饲料还有许多其它的功能。首先，小肽能促进微量元素的吸收。以小肽为主要配体的微量元素螯合

19、物，利用小肽的吸收转运机制和特点，可能以整体的形式被转运，因而能够促进微量元素的吸收，更有利于微量元素生物学效价的提高。大量的研究表明，小肽络合物形式的矿物离子更易被机体吸收，而且小肽螯合物的稳定性较氨基酸螯合盐（AAC）更高。其次，小肽能促进动物对其它营养物质的消化率。Siddons（1975）通过在绵羊日粮中添加不同水平的小肽蛋白替代植物蛋白（各处理组总蛋白水平相同），发现动物对能量的利用率有显著的提高（P0.05）。再次，小肽能提高动物的生产性能。施用晖等报道，在蛋鸡基础日粮中添加肽制品后，其产蛋率和饲料转化率显著提高，蛋壳强度也有提高的趋势。曹志军等试验结果表明，荷斯坦牛日粮中添加小肽

20、比不添加小肽能较明显地提高乳蛋白率（P0.05），同时添加保护性小肽比添加普通小肽产奶量提高10.91%。王恬等试验表明，添加小肽营养素后，无论是乳蛋白还是乳脂率，试验组均比对照组有所提高，且随着小肽营养素添加浓度的增加有提高的趋势，小肽营养素对乳品质的提高具有一定的促进作用。不同小肽在这些生理功能中的贡献是不一样的，因此某些特定种类的小肽的含量决定了小肽饲料的特定功能。3 小肽营养价值的评价指标及测定方法3.1 评价小肽饲料价值的指标根据小肽的概念和影响其价值的因素，我们可以把小肽饲料的营养品质分成以下几个方面进行考虑。3.1.1 小肽的总含量所有的小肽饲料都含有载体、稀释剂等成分，其比例根

21、据产品的生产方式、厂家及市场定位而有所不同。小肽是饲料中的有效成分，它在饲料中所占的比例是影响小肽饲料质量的最重要因素，因此必须测定饲料中小肽的总含量。3.1.2 平均肽链长度小肽指的是二肽或三肽，大于三肽的并不容易被动物机体吸收。许多小肽饲料中的肽其实是寡肽和多肽，这些肽分子仍然要经过消化后才能吸收，饲料中平均肽链长度是影响小肽质量的一个重要因素，反映了饲料中有效小肽所占的比例。3.1.3 特定小肽的含量小肽由20多种氨基酸残基中的两个或三个构成，这些氨基酸残基的任意一种组合都是一种特定的小肽，再加上不同的分子构象，小肽的家族非常庞大。不同小肽被吸收的能力、营养价值和生理功能并不相同。因此测

22、定特定小肽的含量也是评价小肽营养价值的重要指标。3.1.4 特定氨基酸的含量对动物机体来说，不同的氨基酸具有不同的价值。小肽作为动物体内蛋白质的氨基酸来源，其所包含的氨基酸决定了饲料的价值，因此小肽饲料中特定氨基酸的含量也是一个非常重要的指标。3.2 小肽饲料价值指标的测定方法3.2.1 小肽总含量的测定方法3.2.1.1 双缩脲法双缩脲法的原理是利用蛋白质和肽分子中含有的肽键（CO-NH-）具有双缩脲反应的特性。在碱性溶液中蛋白质或肽与Cu2+形成紫红色的络合物，络合物颜色的深浅与其浓度成正比。所以它是蛋白质和肽类物质的特异性测定方法。双缩脲法测定灵敏度不高，一般测试浓度在110 mg/ml

23、之间。此法尤其适合于肽类物质的测定，但只能测定二肽以上的肽, 造成测定结果偏低。对于小肽来说，双缩脲法会把三肽以上的肽也算在小肽里面，因此只适合可以确定饲料中只含有三肽的饲料。3.2.1.2 福林-酚法（Lowry法）福林-酚法是在双缩脲法的基础上发展起来的。首先是在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色的络合物，然后该络合物再与还原磷钼酸-磷钨酸试剂反应产生深蓝色溶液。此法适合于蛋白类的定量分析，灵敏度较高，检测低限为5 g，通常测定范围在20250 g之间，但专一性不强。同双缩脲法一样，此法也只适合可以确定饲料中只含有三肽的小肽饲料的检测。3.2.1.3 三氯乙酸（TCA）法三氯乙酸法的原理

24、是利用大分子的蛋白质在TCA溶液中沉淀，除去酸不溶蛋白质，然后测定酸溶蛋白含量。国外大量资料表明，在蛋白质酶水解的研究中测定水解度，通常在酶解液中加入TCA溶液，使未水解的大分子蛋白质沉淀，而与小分子的酸溶蛋白成分，即肽类和FAA离开，测定酸溶蛋白占总蛋白的含量，求得水解度，即酸溶蛋白占总蛋白的百分比。日本某公司将TCA可溶蛋白做为大豆肽的常规检测方法。大豆肽粉行业标准中酸溶蛋白质的测定方法就是将肽粉经酸沉处理后用国家标准（GB14771-1993）的方法测定酸溶蛋白，游离氨基酸含量测定方法采用GB/T14965食物中氨基酸的测定方法，酸溶蛋白质含量减游离氨基酸含量即为大豆肽含量。3.2.2

25、平均肽链长度的测定测定平均肽链长度需要测定-氨基氮（-NH2-N）含量和总氮（TN）含量。用甲醛滴定法测定-NH2-N含量，总氮用凯氏定氮法测定。然后计算平均肽链长度，公式如下：平均肽链长度（APL）3.2.3 特定小肽和氨基酸含量的测定3.2.3.1 紫外光吸收法分子中含有芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、组氨酸等）的肽，在280 nm处有最大吸收峰。肽在最大吸收峰max波长处的吸光值的强弱与蛋白的浓度成正比。这种方法适合对分子中含有芳香族氨基酸的肽进行定量分析，对不含芳香族氨基酸的肽灵敏度较低。3.2.3.2 消光系数法分子中含有芳香族氨基酸残基的肽，在280 nm处有特定吸光值。肽分子中所

26、含氨基酸数量不同，它们在280 nm处吸光值的强弱就有差异。因此，每一种纯的单一肽在280 nm处有一个特定的消光系数。如果已知某个小肽的消光系数，只要在280 nm处测定出该蛋白吸光值就可以计算出其相应的含量。3.2.3.3 考马斯亮兰法（Bradford法）1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其它几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置由465 nm变为595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。经

27、研究后人们认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595 nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是：灵敏度高，据估计比Lowry法约高4倍；测定快速、简便，只需加一种试剂，完成一个样品的测定只需要5 min左右；干扰物质少，此法可以用来测定含碱性氨基酸的肽的含量。3.2.3.4 层析比色法通过层析柱将不同分子量的肽或氨基酸一一分开，用比色法测定其浓度，再采用已知分子量的肽类和氨基酸做标准曲线，从而计算出一定分子量范围内肽类的含量。该方法与以前的方法相比有很大的进步，但基本上仍属化学法，操作繁琐，人为误差较大。3.

28、2.3.5 高效凝胶色谱法（HPGC）该法在层析比色法的基础上，进行了仪器自动化的改进，准确性高、重现性好、数据处理科学，能真实地表示出蛋白质和肽类的分子量分布。分子量分布的测定不但能定性地鉴定肽类产品的优劣、真伪，而且能定量的表示出不同分子量范围的肽的百分含量。国家药品标准转移因子溶液WS1XG0362000中，将该方法做为转移因子（一种肽类）的标准分析方法。3.2.3.6 高效液相色谱法（HPLC）高效液相色谱法是20世纪60年代发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的重要化学分离分析手段，是常用的小肽分析方法。高效液相色谱法分为两种；一种用反相C18柱

29、，用乙睛和0.1% TFA或高氯酸的水溶液进行梯度洗脱分离，有的还需加入十二烷基磺酸钠；另一种是以分离氨基酸的经典反相高效液相色谱（HPLC）条件，对小肽进行柱前或柱后衍生化来进行测定。邹娟娟等研究了反相HPLC 分离分析化学合成的O8肽的方法。欧宇认为HPLC测定小肽含量简便、准确，结果稳定，可以用来测定已知小肽在瘤胃中的释放情况。冯健等使用HPLC法测定草鱼血浆肽和虾蛋白肽中小肽总量。但是该法成本高、耗时长，不适用一般饲料企业的快速测定。刘庆生等研究了新型离子色谱的氨基酸分析系统和积分脉冲安培检测对小肽的检测，结果发现此方法无需衍生，可以直接分离测定小肽和氨基酸，而且操作简单、重现性好，其

30、流动相为水、氢氧化钠和醋酸钠溶液，有环境污染小、危险性小和排放少等优点。3.2.3.7 CE-ESI-MS联用法毛细管电泳（CE）作为一种高效、快速的分离方法，样品用量少，已被广泛应用于小肽和蛋白质的分离分析。质谱（MS）能够进行微量鉴定，并提供精确的分子量和结构信息，使其成为小肽和蛋白质检测及序列测定强有力的支撑技术之一。其中的电喷雾（ESI）质谱作为一种软电离技术，易与常规的高分辨率分离方法如高效液相色谱、毛细管电泳等实现在线联用，具有分离效率高、检测灵敏度高和样品定性方便等特点，因而在小肽和蛋白质的测定中得到广泛的应用。梁振等研究了CE-ESI-MS联用测定小肽混合物的技术，其检测限可达

31、4.233 pg。4 总结随着小肽制品商业化的不断深入，制定科学、统一的小肽标准，对小肽饲料进行营养价值的评定已非常必要。科学的测定方法是小肽标准的制定和使用的保证。明确小肽的概念，了解影响小肽饲料营养价值的因素是评定小肽价值的前提，在此基础上我们要选择必要的测定指标，然后筛选相应的测定方法。目前，测定小肽含量的方法有很多种，但从中发展出一套科学有效的测定方法做为小肽标准的尺度仍是一个艰难的任务，有待进一步的研究。（参考文献38篇，刊略，需者可函索）（编辑：张学智，mengzai007）郭玉东，东北农业大学动物科学技术学院，150030，哈尔滨市东北农业大学316信箱。张洋、张均国，单位及通讯

32、地址同第一作者。收稿日期：2006-12-18小肽饲料营养价值的评价方法小肽饲料营养价值的评价方法郭玉东* 张洋 张均国（东北农业大学，动物营养研究所，哈尔滨，150030）摘要：小肽一般是指二肽或三肽，小肽饲料就是通过化学或生物方法将本来不适合动物利用的蛋白原料分解，制成的含有大量小肽的饲料产品。小肽饲料的营养价值在于小肽的吸收优势和其自身的质量。根据影响小肽营养价值的因素可以选取小肽的总含量、平均肽链长度、特定小肽的含量、特定氨基酸的含量作为评价小肽饲料营养价值的指标。目前的测定方法主要有双缩脲法、福林-酚法、三氯乙酸法、甲醛滴定法、凯氏定氮法、紫外光吸收法、消光系数法、考马斯亮兰法、层析比色法、高效凝胶色谱法、高效液相色谱法和CE-ESI-MS联用法。关键词：小肽，营养