Analyst软件应用培训教程.docx

1、Analyst软件应用培训教程Analyst 软件应用培训教程关于本教程的说明：本教程为AB Sciex公司为在中国使用的客户培训的辅助材料。本教程仅提供给经过AB Sciex公司培训合格的操作人员使用。本教程内容仅限于Analyst 软件基本操作和应用部分。本教程提供的分析方法仅对用户起参考作用。本教程解释权在AB Sciex公司。1、定量分析简明流程2、成功定量分析应注意的问题3、定性分析原则与方法4、LC-MS 实验经验与仪器维护常识5、Analyst 软件操作简介：Calculator 功能与使用Library 功能与使用部分Script 功能与使用其他6、Analyst 软件QTRA

2、P 功能基本操作简介：QTRAP 扫描速度的校正QTRAP 系统的扫描方式QTRAP 系统IDA 指南7、部分化合物液质分析参考方法和信息8、压力单位转换表LC-MS/MS 定量分析简明教程首先确认仪器已经校准，气体、电压工作正常一溶液配制分别将待分析化合物的标准物质配制成110 ppm (110ug/ml) 的溶液，用于注射泵连续进样，以优化质谱参数。二Q1 Scan ，确定母离子a选择或建立Project 建立一个新项目 (Project)： 点击ToolsProjectCreat Project，出现下图对话框，键入项目名称，点击“Add All”添加项目功能，点击OK，完成。b. 硬件

3、配制：激活MS 主机，如果是API2000、3200，硬件配置文件中的质谱主机中应选择Integrated Syringe Pump 。c. 进入MS 的Manual Tuning 界面，并设置注射泵流速510ul/min 。d选择质谱扫描方式：Q1 Scan，设置扫描范围(应包含待分析的化合物)；根据化合物性质，选择扫描极性e手动调节DP、GS1 等参数，使喷雾平稳、待分析化合物信号灵敏度较高fMCA on ，点击Acquire，采集并存储2050 张加和图谱(根据灵敏度)，并保存方法，例如：Q1.dam g在质谱图区域，点击右键“Open File”打开图谱，局部放大，确定母离子的质荷比，

4、准确到0.1amu 。，如下图，母离子m/z 应为609.3。三Product Ion Scan ，确定子离子以第一步测得值为母离子，做Product Ion Scan（MS2），手动调节CE 等参数，使母、子离子都具有一定强度，一般以母离子的强度占图谱中基峰强度的1/3 到1/4 为宜。MCA on ，点击Acquire，采集并存储2050 张加和图谱，并保存方法，例如：609-MS2.dam。在质谱图区域，点击右键“Open File”打开图谱，选择2 个最高的子离子，如上图中，选择195、397，局部放大，确定子离子的质荷比，准确到0.1amu， 则上面两个子离子为195.2、397.3

5、。四MRM，优化质谱中与化合物相关的参数以前两步选定的母离子、子离子，组成离子对，例如609.3/195.2，609.3/397.3 等，做MRM Scan，每个离子对的分析时间100 或200ms。通过Edit Ramp ，分别优化Compound 项下的各参数，如DP、EP、CE、CXP 等：点击Edit Ramp ，选择要优化的参数点击OK，出现该参数的优化窗口，可以根据需要改变该参数的优化范围(Start、Stop)和优化步长(Step)。不同参数需逐一优化。然后保存方法，例如609-MRM.dam。同样步骤，优化需要分析的另外化合物，分别保存方法。五、将MRM 方法转化为液质联用方法

6、关掉所有质谱分析界面，将现有质谱体系灭活，激活液相色谱、质谱设备。单击Acquire 中Build Acquire Method ，打开上面保存过的MRM 方法，右键显示方法左边导引条中第一行Acquire Method，点击Add/Remove Device Method 添加设备：色谱泵、自动进样器选中方法左边导引条中第一行Acquire Method 参数页，设置色谱同步。设置色谱参数，分析时间一般为0.81min ，流动相组成和流量与实际样品分析时相同；修改质谱分析时间 (Duration ，一般设置0.81min) ，与色谱参数一致；设置GS1、GS2、TEM 初始值为40、40、4

7、00 左右，保存方法，例如：LC-MRM.dam。六、源参数优化将上面用过的样品溶液稀释1001000 倍。在Tune 项下，双击 Quantitative Optimization ，选择FIA 分析，根据向导进行自动优化。注意：需要优化的各可选值之间用“;”分隔。七色谱条件优化接好色谱柱，关掉Tune ，在Acquire 栏下调出上一步优化好的方法，根据色谱柱规格和待分析体系的复杂程度设置液相色谱分离和质谱分析时间，或编辑洗脱梯度，保存方法。用新保存的方法平衡色谱柱，平衡时间为510 倍柱体积。色谱柱充分平衡后，设置Batch 进样，观察色谱峰形及保留时间是否合适，根据具体情况，调节流动相

8、，优化色谱条件。用空白提取液配制同样浓度标样，按上面方法进样，观察色谱峰形及保留时间是否合适，峰高有无变化，有无离子抑制现象，否则调节流动相，进一步优化色谱条件。注意：等度洗脱，样品之间不需要再平衡色谱柱，若为梯度洗脱，则进下一针样品前色谱柱一定要充分平衡。八工作曲线制备用空白提取液配制一系列不同浓度化合物的混合标样，按上一步方法，设置Batch 进样，例如，分别稀释浓度为0.1 g/ml、0.2 g/ml、0.4 g/ml、0.8 g/ml 和1.6 g/ml 的混合标准溶液等。根据项目分析要求，有时也可只做单点校正，而不做多点线性。将采集的数据，根据峰面积，做标准曲线。根据检测项目要求，进

9、一步考证方法的最低检测限、重现性、样品提取回收率等性能参数。成功定量分析应注意的问题一、准备工作1. 查阅文献2. 做好样品前处理，萃取、浓缩、分离、纯化等3. 有条件的可先在HPLC 上摸好LC 条件，能够基线分离更好，注意缓冲体系应符合MS 的要求4. 溶剂(包括水)的纯度，最好色谱纯以上5. 新的色谱柱可能要先冲洗很长时间才能干净，某些样品非常容易吸附在进样阀和管路中，应及时用溶剂清洗6. 质谱仪须校准，预热时间要足够长，气流的稳定也很重要，液氮气阀开度要注意，达到稳定程度二、MS 条件优化先定性后定量1. 首先，根据待分析化合物的性质，确定离子化方式： ESI or APCI，POS

10、or NEG 2. 用1-100ppm 的纯样，Q1 SCAN 察看存在哪些离子，要能够看到待测的母离子，应明显比周围的噪声离子高，通过改变DP，观察离子的增减，若为POS 方式，看M+1，M+18，M+23 等等，初步判断分子离子，如看不到则可能是浓度太低或离子化方式不合适，或选择的溶剂体系不合适。3. 母离子选M+H，或M-H 最好，但有时只有M+NH4，M+Na 等，此时CAD 能量可能需要高些。选择M+H+，还是+NH4，+Na 等，要由化合物决定。加合离子若稳定，则可用，不稳定则可能需要更换流动相，但+H 的离子通常好些，所需碰撞能量低，灵敏度高；如含Cl 可选择2 个母离子峰。4.

11、 SIM 与MRM 方式的选择：单级Q 只能SIM，MRM 可看成2 个SIM，选择性更好。5. 再根据上一步确定的母离子进行Product Scan，确保所有碎片离子都来自待测化合物，而不是溶液中的杂质，找出较强的碎片离子信息。通过改变CE， 从中选定MRM 需要测定的一对或更多离子对，为最后LC-MS/MS 联用做准备。6. 做Product Scan 时，注意小数点后的位数。MRM 离子对信息输入准确，灵敏度才会高。7. 先多选几个离子对，待出现基质干扰时可换，最后根据法规要求确定离子对数目。8. MRM 方式优化仪器，通过优化仪器参数，使得母、子离子都达到一定强度水平，使MRM 灵敏度

12、最高。可先让仪器自动优化参数，然后再手动细致优化，只检测一对离子时根据TIC 的强度来确定仪器参数，一次优化多对离子时，要根据每对离子的XIC 强度来分别确定仪器参数。9. 先用注射泵优化Compound 项下面的参数，如DP、CE 及CAD 等，再接通LC，用FIA 优化其他参数如温度，气流和IS 电压及离子源位置，或接一个三通，样品仍由注射泵进入离子源，同时LC 保持需要的流量。然后进行MRM 测定。10. Curtain Gas在不降低灵敏度情况下尽量大些，温度在达到灵敏度时不用太高，气流也不用太大，这样可以提高信噪比，保持信号稳定。11. 分辨率的选择：当样品较纯，Q3 可选LOW，提

13、高灵敏度，若选LOW 后本底噪声太高则意义不大。三、LC 条件优化：1. 色谱柱长度可根据分离的要求而定，定性可长些，定量在能有效排除干扰情况下尽量短，提高效率；内径最好选细径柱如2mm、1mm，IS 可不分流，4.6mm柱用1ml 流量时如不分流灵敏度还不是最佳，不如流量低时更好。流速高，峰形好。2. 不同牌号色谱柱，效果很可能不同。3. pH 的影响：正离子方式pH 要低些，负离子方式pH 要高些，除对离子化有影响外，还影响LC 的峰形，以至定量误差。流动相加乙酸铵可适合大部分测定要求。4. 用流动相配制标样，初步优化确定LC 条件是否合适。5. 标准品工作液现配现做，尤其是较低浓度，时间

14、长了可能因吸附分解等降低。6. 进样顺序要先稀后浓。7. 洗针液要常换，进过浓样后要进一针空白，检验是否有残留污染。8. 顺序：纯样-添加样-实际样品。9. 流动相配制的标准品溶液优化后，用空白提取液配制标准品再次优化，考察干扰情况，空白添加再提取后，考察回收率。10. 用空白提取液配制标准样品做工作曲线，可以有效排除干扰因素。四、前处理方法的优化1. LC，MS 都优化过，还是达不到灵敏度要求或无法检测，需要改进提取方法2. 离子抑制：改变前处理方法或LC 条件3. 内标用法，药代动力学时多采用内标，选择原则：内标物与被测物的化学性质有区别时，要注意干扰基质对他们的离子化影响的不同，尽量选同

15、系物。还可利用同位素标记的同一化合物作为内标。4.衍生化：有时有助于使信号增强，且稳定，例如硝基呋喃类，衍生化后容易测定。五、数据处理1. 最低检出限，信噪比3:1，定量限10:1 2. 同一物质几对离子的比例应相对恒定，误差不超过15%峰面积，比使用峰高定量准确3. 当浓度低，信号弱，自动积分不准时，可对峰面积手动积分4. 平滑次数与峰宽因子、保留时间等设置都会影响积分值5. 曲线过零点时，可用4 个点；不用，则需要5 个点6. 线性范围太宽，有时意义不大定性分析原则与方法一、准备工作1. 核对样品名称、编号2. 通过询问样品提供人，查阅文献等，了解样品其他知识，例如熔点，沸点，溶解性等理化

16、性质以及样品来源、合成路线、光谱、波谱数据等3. 可能含有的杂质，样品大致含量4. 样品保存状况，对温度，光是否敏感5. 进行LC-MS 分析前最好大致清楚LC 条件，使体系得到比较好的分离，流动相缓冲体系符合MS 要求6. 色谱柱和管路的清洗：新的色谱柱以及分析过大量样品的色谱柱，可能要先冲洗很长时间才能干净；某些样品非常容易吸附在进样阀和管路中，尤其是采用针泵进样时，应先用空白溶剂充分清洗管路。7. 如果原来溶解样品的溶剂不合适LC-MS 分析，此时应用N2 吹干，再用流动相定量溶解。溶解样品的溶剂一定要和流动相一致，否则得到的谱图不纯，峰形不好，变宽，出怪峰等等；某些固体直接用流动相不溶

17、，可以先加一滴DMSO(二甲亚砜)，再加甲醇或乙腈等稀释。8. 进样顺序要先稀后浓，定量溶解，浓度控制在几个ppm 级，不然易污染系统，造成本底太高影响分析结果。9. 浓度非常低的样品不能保存太长时间，容器吸附、分解等原因使样品浓度降低，样品工作液应现配现做。二、色谱柱的选择1. 选择原则：可长一些，最好能够基线分离，若做不到，可以通过提取离子(XIC) 来得到较好的色谱图。内径无要求，粗细均可，但注意应使流动相的流速与色谱柱的内径相匹配(一般，4.6mm 柱，流速1ml/min；3mm 柱，流速500ml/min；2.1mm 柱，流速200ml/min；1mm 柱，流速50ul/min 左右

18、)。2. 流动相流量大小，MS 分析前是否需要分流，取决于使用的离子源。一般API2000/3000，流速高于600ml/min ，需要分流；对于API3200/4000/5000， 由于使用Turbo V 离子源，流速低于2ml/min 的情况，皆不需要分流。3. 要对各种厂家的色谱柱有所了解，对于一些特殊的化合物必需使用特殊的色谱柱进行分离，相关的知识可以向色谱柱供应商索取。大多数著名的色谱柱厂商都有自己的色谱柱分析数据库，里面可能会有你想要的信息。三、LC 条件的优化1. LC 梯度的设定，目的是快速分离，峰形好，缩短时间，提高效率，可以将所有化合物都冲出，防止影响下一个样品的测定。2.

19、 采取梯度洗脱，如分析多肽类化合物一般采取梯度洗脱，此时的信号会比等度洗脱时强很多，而且加大进样量，是提高灵敏度的一种有效措施，但是分析时间较长，且需要有色谱柱平衡的时间。四、确定离子化方式1. 根据样品性质确定离子化方式：对于高极性的化合物，如：大分子(蛋白质、肽类、低聚核苷酸等生物分子)、胺类、季铵盐等、含杂原子化合物如氨基甲酸酯等，适合ESI；弱极性/中等极性的小分子，如脂肪酸，邻苯二甲酸等；含杂原子化合物如氨基甲酸酯、脲等，适合APCI 2. 不适合用ESI 方式的化合物：极端非极性化合物如苯等；不适合用APCI 方式的化合物：非挥发性、热稳定性差的样品3. 一般碱性化合物宜用正离子方

20、式，酸性化合物宜用负离子方式，如未知，可能正负都要做，有些化合物正负都出峰，选择灵敏度高的方式，不明确的优先用正离子方式试4. APPI，适合非极性化合物，同GC/MS 有重复，但一般小型台式GC/MS，分子量范围小，APPI 比GC/MS 可测比较高分子量的化合物。五、初步定性-确定化合物的分子量1. 对于纯样品，首先可采用针泵直接进样，察看存在哪些离子，设置低的DP 电压可使谱图简单。通过改变DP，观察离子的增减，M+1 、+18、+23、+39、2M+1 等等，初步判断分子量2. 注意要采集一段时间的溶解样品的溶剂本底信息，DP 同实际样品相同，以便扣除本底干扰，可使用高、低DP 电压各

21、做一次，例如20V、80V 等，一般低流速FIA 方式最适合3. 注意，当样品溶液内含有强离子抑制物质时，直接进样可能看不到化合物的分子峰，此时需要经色谱柱分离或重新处理样品。4. 选择一种通用的源参数及源位置，以适合样品中大部分化合物的分析，该参数的确定可按照定量方法中FIA 优化，通常主要取决于流动相有机溶剂比例和流速。正离子方式常出现如下离子： 1.-Na 22 Da. higher than M+H -K 38 Da. higher than M+H -Li 6 Da. higher than M+H -NH4 17 Da. higher than M+H -ACN 40 Da. hi

22、gher than M+H 2.有时还可能出现M+H2O+H、2M+H、3M+H、2M+Na 等3.有意添加可以帮助确定化合物的分子量：例如有几个峰无法判断分子离子是哪个，此时加入微量Li+，有可能观察到增加6 的峰，而通常碎片峰很少加合。负离子方式常出现如下离子：1.-TFA 114 Da. higher than M-H (113 、227 为背景离子) 2.-Acetate 60 Da. higher than M-H 3.-Formic 46 Da. higher than M-H 4.-Cl 36 Da. higher than M-H LC-MS 中常见的本底离子：1. m/z 5

23、0-150, 溶剂离子，(H2O)nH+ ，n= 3-112 2. m/z 102, H+ 乙腈+乙酸, C4H7NO2H+,102.0549 3. m/z 102, 三乙胺, (C2H5)3NH+,102.1283 4. m/z 149, 管路中邻苯二甲酸酯的酸酐，C8H4O3H+,149.0233 5. m/z 288, 2ml 离心管产生的特征离子6. m/z 279, 管路中邻苯二甲酸二丁酯 C16H22O4H+, 279.1591 7. m/z 316, 2ml 离心管产生的特征离子8. m/z 384, 样品瓶光稳定剂产生的离子9. m/z 391, 管路中邻苯二甲酸二辛酯, C2

24、4H38O4H+, 391.2843 10. m/z 413, 邻苯二甲酸二辛酯+钠, C24H38O4Na+, 413.2668 11. m/z 538, 乙酸+氧 +铁（喷雾管）, Fe3O(O2CCH3)6, 537.8793 同位素离子1.各种元素的同位素，基本上按照其在自然界的丰度比出现在质谱中，这对于利用质谱确定化合物及碎片的元素组成有很大方便，如氯35 和37，溴79 和81。2.同位素分布图，可用Analyst 中计算器(Calculator)功能模拟，对于分子量较大，含C 较多的分子，最高峰可能是C13 同位素峰，分析数据时要注意。3.利用稳定同位素合成标记化合物，如：氘等标

25、记的化合物，再用质谱法检出这些化合物，在质谱图外貌上无变化，只是质量数的位移，从而说明化合物结构，反应历程等。六、提取特征离子色谱图(XIC) 1. 利用提取离子色谱图来确定特征离子，在复杂混合物分析及痕量分析时是LC/MS 测定中最有用的方式。当样品浓度很低时LCMS 的TIC 上往往看不到峰，此时，根据上一步得到的分子量信息，输入M+1 或M+23 等数值，观察提取离子的质量色谱图，检验直接进样得到的信息是否在LC-MS 上都能反映出来，确定LC 条件是否合适，以后进行MRM 等其他扫描方式的测定时参考。2. 调机时，注意质量数不要偏差太大，先用标准品校准仪器，如偏差很小，可不用重新校准仪

26、器，读取分子量数值时要多采集几次，用平均或累加后得到的质谱图来读取离子质量，会相对准确。七、影响分子量测定的因素1. pH 的影响-正离子方式pH 要低些，负离子方式pH 要高些，除对离子化有影响外，还影响LC 的峰形2. 气流和温度，当水含量高及流量大时要相应增加3. 溶剂和缓冲液流量，流速适当高可以提高出峰灵敏度4. 溶剂和缓冲液的类型，通常正离子甲醇好，负离子乙腈好些5. 不挥发性盐的影响：大量累积，会使仪器的灵敏度下降6. 根据样品结构和性质，选择合适的液相色谱类型：正相、反相、C4、C18 7. 合适的电压：DP 电压高时，样品在源内分解或碎裂；高DP 电压会使多电荷离子比例低，多聚

27、体也减少8. 杂质的影响：溶剂的纯度、水的纯净程度等。当成分复杂，杂质太多时，竞争使被测物离子化不好，同时使LC 分离不好9. 样品浓度不够，有时需要浓缩八、样品预处理的常用方法： a）超滤 b）溶剂萃取/去盐 c）固相萃取 d）灌注（Perfusion）净化/去盐 e）色谱分离：反相色谱分离、亲和技术分离 f）甲醇或乙睛沉淀蛋白 g）酸水解，酶解 h）衍生化 九、目标化合物的检测和谱图解析1. 如果是纯样，则直接进行Product Scan，找出碎片信息，同样要扣本底。做Product Scan 时，注意输入母离子质荷比小数点后的位数，输入准确，灵敏度才会高，而且不容易出错，得到的谱图相对干

28、净。2. 处理得到的数据，一种方法是库检索，另外就是手工谱图解析。为使库检索的结果准确，可使用不同的碎裂能量(如CE：20，35，50V)各采集一张MS2 图谱 (QTRAP 用户可以使用新的CES 功能：三张图谱叠加)。因为化合物性质不同，需要CE 不同。对同一化合物，可以使用高、低能量分别碰撞，高质量区的碎片和低质量区碎片对推测结构都很重要；低碎裂能量可以判断主要碎片，高碎裂能量可看到更多信息；手工解析可以参考质谱解析书籍。3.若为混合物或含有基质的实际样品，则首先由标准品建立方法，按照定量的步骤，选择至少2 对MRM (四个数据点)，进行LC-MS/MS 分析，可以利用IDA 中MRM-

29、MS2 工作流程，提高检测灵敏度。谱图解析：1. IDA：Full Scan-MS2，一次进样，得到大部分信息，进一步可以再细一些，采用灵敏度更高的方法确证。2. 加大DP，用串联四极杆实现拟MS3 功能，以进行进一步的结构解析。3. 前体离子扫描(PREC)和中性碎片丢失扫描(NL)：寻找代谢产物，解析肽磷段酸化位点等4. 互补性方法，选已知同系物，研究其裂解规律，有共同的碎片或相差同样质量数，再扩展到未知物。下图为天然产物结构分析的一种思路：LC-MS 实验技巧与仪器维护常识样品制备方面：样品处理的好坏直接关系到整个LC-MS 分析的成败，必须要有成熟规范的样品制备方法。样品预处理各步不能

30、随意省略，如萃取、分离、去盐等。某些化合物必须化学衍生化以适应LC-MS 要求，如磷酸酯水解。若MS 信号实在太低，考虑更换样品处理方法。浓度非常低的样品不能保存太长时间，容器吸附、分解等原因使样品浓度降低，标准品工作液现配现用。离子化方法选择一般原则：根据样品性质确定离子化方式适合ESI(IS) 的样品类型：高极性化合物、蛋白质、肽类、低聚核苷酸等生物分子；胺类、季铵盐等；含杂原子化合物如氨基甲酸酯等适合APCI 的样品类型：弱极性/中等极性的小分子，如脂肪酸，邻苯二甲酸等含杂原子化合物如氨基甲酸酯、脲等ESI 不适合的化合物：极端非极性化合物如苯等；APCI 不适合的化合物：非挥发性样品；

31、热稳定性差的样品碱性化合物宜用正离子方式酸性化合物宜用负离子方式如未知,可能正负都要做有些化合物正、负模式都出峰，选择灵敏度高的方式，不明确的优先试用正离子方式LC 条件的选择：1. 根据化合物类型选择流动相组成，甲醇-水，乙腈-水或甲醇-乙腈-水2. 某些化合物只有某种流动相体系才出峰3. 一般正离子方式用甲醇，负离子方式用乙腈好些4. 通常有机相比例高些，可以提高离子化效率5. 梯度的设定：梯度变化太快对离子化效率影响很大，相应源参数也应该改变，所以恒定比例流动相能满足分离分析要求时，尽量不用梯度，尤其定量分析时6. 流动相中加入甲酸、乙酸铵等可提高正离子化效率7.是否加酸不是绝对的，具体应根据LC 的分离情况、样品在酸性条件下的稳定性等决定8.通常pH 值低时，M+H+比率高； pH 值高时，M+Na+、M+K+，或M+NH4+比率高9.定性分析时，有时加一些NH4+ ，Li+等，可帮助确定判断母离子，对碎片较少的化合物，可以增加其质