安徽师大 分子生物学Chapter 2 讲义.docx

1、安徽师大 分子生物学Chapter 2 讲义第二章 基因和染色体Chapter 2 Genes and Chromosomes【教学目的】本章要求学生掌握原核生物和真核生物基因组的区别、染色体的组成、真核生物基因组的复杂性、DNA的结构等；掌握DNA复制的复杂性、几种DNA的复制方式、原核生物DNA复制的酶、真核生物DNA复制的酶、DNA的修复、重组和转座等。【重点难点】基本概念的掌握，清楚DNA复制、修复、重组及转座机制。【教学方法】讲述式和启发式教学 (适当结合讨论法)多媒体教学English Animation【课时安排】14课时主要教学内容Overview Basic material

2、: DNA, RNA, Protein (composition, classes, structures, functions) Transcription: DNA RNA Transcriptional factors RNA processing: RNA splicing, RNA editing Translation: RNA Protein Posttranslational modification: Intein splicing, Phosphorylation, Modification Regulation: Cis-acting elements, Trans-ac

3、ting factorsCentral dogma: old version, new content, progress中心法则(Central dogma)及其研究进展： 中心法则是指遗传信息在细胞内的生物大分子之间转移的基本法则。 1958年Crick第一次提出了中心法则的概念。这是指遗传信息单向流动、且以三步实现的法则，DNA、RNA和蛋白质三者的信息共线，即序列转换。1970年，Temin 和Baltimore在一些RNA病毒中发现它们在宿主细胞中的复制过程是先以病毒的RNA分子为模板合成一个DNA分子，再以新合成的DNA为模板转录形成病毒的RNA。 针对此情况，1970年Crick

4、对原有的中心法则进行了修改DNA、RNA和蛋白质三者的信息非共线性： 1. RNA 与DNA的非共线性： 内含子、外显子的发现和内含子的剪切（ mRNA 与DNA杂交实验 ）。 2. RNA的编辑（ RNA editing） 突变或尿苷酸的缺失与添加，使得mRNA 序列发生不同于模板DNA的变化。 3. protein与DNA的非共线性： 蛋白质翻译及翻译后的修饰，使得protein与原DNA序列信息不同。朊病毒的出现是否对遗传学上的“中心法则”构成了挑战呢？蛋白质控制下的肽链合成：朊病毒(Prion)的发现和复制朊病毒又称蛋白质侵染因子（又称毒阮）。朊病毒是一类能侵染动物并在宿主细胞内复制的

5、小分子无免疫性疏水蛋白质。朊病毒：朊病毒就是蛋白质病毒，是只有蛋白质而没有核酸的病毒。1997年诺贝尔医学或生理学奖的获得者美国生物学家斯垣利普鲁辛纳（ S. B. Prusiner）就是由于研究朊病毒作出卓越贡献而获此殊荣的。朊病毒不仅与人类健康、家畜饲养关系密切，而且可为研究与痴呆有关的其他疾病提供重要信息。就生物理论而言，朊病毒的复制并非以核酸为模板，而是以蛋白质为模板，这必将对探索生命的起源与生命现象的本质产生重大的影响。 病毒是一类个体极微小的生物，它没有细胞结构，其构成很特别，仅由核酸和蛋白质构成。核酸（DNA或RNA）在病毒的遗传上起着重要作用，而蛋白质外壳只对核酸起保护作用，本

6、身并没有遗传性。这是人们对病毒的基本认识。然而，随着人们对一些疾病的深入研究，科学家们发现，还有一类生物与一般病毒不一样，它只有蛋白质而无核酸，但却既有感染性，又有遗传性，并且具有和一切已知传统病原体不同的异常特性。它就是朊病毒。 最为震惊的当首推1996年春天“疯牛病”在英国以至于全世界引起的一场空前的恐慌，甚至引发了政治与经济的动荡，一时间人们“谈牛色变”。致病机制：1982年普鲁宰纳提出了朊病毒致病的“蛋白质构象致病假说”，以后魏斯曼等人对其逐步完善。其要点如下：朊病毒蛋白有两种构象：细胞型（正常型PrPc）和瘙痒型（致病型PrPsc）。两者的主要区别在于其空间构象上的差异。PrPc仅存

7、在a螺旋，而PrPsc有多个折叠存在，后者溶解度低，且抗蛋白酶解；Prpsc可胁迫PrPc转化为Prpsc，实现自我复制，并产生病理效应；基因突变可导致细胞型PrPsc中的螺旋结构不稳定，至一定量时产生自发性转化，片层增加，最终变为Prpsc型，并通过多米诺效应倍增致病。2.1 DNA and DNA structure1. Nucleoside & Nucleotide(1) Components：pentose, base, phosphate groupIn DNA or RNA, a pentose is associated with only one phosphate group

8、, but a cellular free nucleotide (such as ATP) may contain more than one phosphate group. If all phosphate groups are removed, a nucleotide becomes a nucleoside.2. Nucleic Acid Chaincondensation reaction, phosphodiester bond, DNA polymerase连接反应(ligation reaction)Question：Who offered the oxhydryl （OH

9、 group）？Synthesis of a nucleic acid chain always proceeds from 5 to 3.3. DNA Structure (1) DNA Primary Structure: nucleotide acid sequenceThe primary structure of DNA is the sequence itself - the order of nucleotides in the deoxyribonucleic acid polymer. Question：Why is DNA sequence important? 一级结构是

10、二级结构以及高级结构的基础；最终决定蛋白质的组成。DNA sequencing1975， Fred Sanger，Dideoxy termination method双脱氧终止法测序原理：a. DNA复制是以一条链为模板，按碱基配对原则进行的。b. 脱氧核糖的连接是以3 5磷酸二酯键。c. 复制反应可以在体外进行。d. 2和3双脱氧的ddNTP会使复制反应终止。特点：读出的序列是待测链的互补链序列。Material 1. dNTP, ddNTP2. Primer3. DNA polymerase （全自动测序简介）(2) DNA Secondary Structure: double heli

11、x Right-handed helix - A-DNA, B-DNA Left-handed - Z-DNARight-handed or left-handed Helix Diameter 螺旋直径Base Inclination 碱基倾角bp / helical turnHelix pitch 螺旋间距Major groove Minor groove(3) DNA Supercoiling: 自1965年Vinograd等人发现多瘤病毒的环形DNA的超螺旋以来，现已知道绝大多数原核生物都是共价封闭环(covalently closed circle)简称CCC分子。这种双螺旋环状分子

12、再度螺旋化成为超螺旋结构(superhelix或supercoil)。4 DNA Denaturation and Renaturation Denaturation: dsDNA ssDNARenaturation: ssDNA dsDNA (1) DNA respiration：DNA双螺旋结构中，配对碱基之间的氢键处于连续不断的断裂和再生的动态平衡中，这种过程DNA双螺旋的呼吸作用(2) DNA aldehyde test （DNA甲醛试验）：把标准DNA放到含有甲醛的溶液中，发现随时间推移，吸光性出现变化（增加），此表示DNA由双链变成了单链。这是因为DNA上的NH2在甲醛作用下发生了

13、缩醛反应，使DNA双链不可逆地解开，这个过程又称为甲醛的变性作用。(3) DNA fraying：在DNA双链的两端，有37个碱基对经常不同程度的处于单链状态，这种现象DNA 绽裂。(4) DNA Denaturation：DNA双螺旋融解形成单链的现象称为DNA的变性。 变性剂：能使DNA变性的试剂。 如：尿素、甲酰氨、甲醛等 常用的DNA变性的方法： （1）物理学方法：如加热 （2）碱变性法： pH13 （3）低盐法： 0.01 mol/L Nacl溶液DNA变性后理化性质的改变： （1）粘度下降 （2）沉降速度增加 （3）紫外光吸收发生改变 （4）失去生物学活性(5) Hyperchro

14、mic effect & Hypochromic effect（增色效应、减色效应）： 单链和双链DNA的A260吸收值不同。 以50g/mlDNA溶液测量，分别为： 双链DNA A260=1.00 单链DNA A260=1.37 单核苷酸 A260=1.60 由于双链DNA变性而引起的其溶液对紫外光的吸收值增加，叫增色效应（hyperchromic effect ），而单链DNA缓慢复性，其对紫外光的吸收值减少，叫减色效应(hypochromic effect)。(6) DNA renaturation变性后的DNA用某种方法处理后，使之重新形成天然DNA的过程叫做复性（renaturati

15、on) 或退火（reannealing)。复性的机制：从单链分子的无规则碰撞开始 复性是一个比较慢的过程。 1A 1B 1C 1D .ATGA.ATGA.CCCC.ATGA. .TACT.TACT.GGGG.TACT. 1A 1B 1C 1D影响DNA复性的因素： （1）与DNA分子的复杂性有关：DNA碱基的排列 （2）溶液中的DNA浓度： 越浓则复性越快 （3）DNA片断的大小： 较小则复性快 （4）温度的影响：一般在：Tm25C， 但不能太高 （5）离子强度： 需要较高的离子强度，0.15-0.40 mol/L（0.2左右）Nacl（7）DNA复性和分子杂交(molecular hybri

16、dization) 在DNA分子复性时，如果两条链来源不同，则称为分子杂交。分子杂交的类型：（1）DNADNA： Southern Blotting （2）DNARNA： Northern Blotting （3）ProteinProtein: Western Blotting(蛋白质免疫印迹） 2.2 Gene and Chromosomes1. Concepts of Gene(1) Gene (2) Regulatory Gene (3) Structural Gene (4) Gene Cluster 基因簇，gene cluster，指基因家族中的各成员紧密成簇排列成大串的重复单位，

17、定于染色体的的特殊区域。(5) Gene family 基因家族：基因组进化中，一个基因通过基因重复产生了两个或更多的拷贝，这些基因即构成一个基因家族。是具有显著相似性的一组基因，编码相似的蛋白质产物。在真核细胞中许多相关的基因常按功能成套组合，被称为基因家族（gene family）。同一家族中的成员有时紧密的排列在一起，成为一个基因簇；更多的时候，它们却分散在同一染色体的不同部位，甚至位于不同染色体上，具有各自不同的表达调控模式。2. Genome(1) Genome Nuclear genomeMitochondrial genomeChloroplast genome1、C值的概念：r

18、efers to the amount of DNA contained within a haploid nucleus of a eukaryotic organism 一个物种单倍体的染色体数目称为该物种的基因组（Genome) C值是指一个生物单倍体基因组的DNA总量。（1）在系统进化上，表现为由低等到高等，DNA含量越来越增加的趋势。但某些类群的DNA含量却非常的大，如某些两栖类和有花植物的C值比哺乳类还高。同一类群中也表现出极大的差异。如两栖类（2）现已分析的如人类的基因组，约有3万多个基因，加上其调控序列，仅占基因组总量的1。人们无法解释基因组为什么要如此之大。2、 C值矛盾：T

19、he C-value enigma or C-value paradox is a term used to describe the complex puzzle surrounding the extensive variation in nuclear genome size among eukaryotic species. At the center of the C-value enigma is the observation that genome size does not correlate with organismal complexity; for example,

20、some single-celled protists have genomes much larger than that of humans.In general terms, the C-value enigma relates to the issue of variation in the amount of non-coding DNA found within the genomes of different eukaryotes.The C-value enigma, unlike the older C-value paradox, is explicitly defined

21、 as a series of independent but equally important component questions, including:1. What types of non-coding DNA are found in different eukaryotic genomes, and in what proportions? 2. From where does this non-coding DNA come, and how is it spread and/or lost from genomes over time? 3. What effects,

22、or perhaps even functions, does this non-coding DNA have for chromosomes, nuclei, cells, and organisms? 4. Why do some species exhibit remarkably streamlined chromosomes, while others possess massive amounts of non-coding DNA? (2) GenomicsThe branch of genetics that studies organisms in terms of the

23、ir genomes (their full DNA sequences).(3) Functional GenomicsThe branch of genomics that determines the biological function of the genes and their resulting proteins, and the role played by the proteins in the organisms biochemical processes. (4) Structural GenomicsThe branch of genomics that determ

24、ines the three-dimensional structures of proteins.3. Size of Genome(1) Prokaryotic cell vs Eukaryotic cell (2) Relationship of genomic size and evolution4. Model Organisms(1) Bacteria (E. coli, several others)(2) Yeast (Saccharomyces cerevisiae)(3) Plant (Arabidopsis thaliana)(4) Caenorhabditis eleg

25、ans(5) Fruit fly(6) Zebrafish(7) Mouse(8) Human 模式生物生物学家通过对选定的生物物种进行科学研究，用于揭示某种具有普遍规律的生命现象，此时，这种被选定的生物物种就是模式生物。目前在人口与健康领域应用最广的模式生物包括，噬菌体、大肠杆菌、酿酒酵母、秀丽隐杆线虫、海胆、果蝇、斑马鱼、爪蟾和小鼠。在植物学研究中比较常用的有，拟南芥、水稻等 随着生命科学研究的发展，还会有新的物种被人们用来作为模式生物。但它们会有一些基本共同点：1）有利于回答研究者关注的问题，能够代表生物界的某一大类群； 2）对人体和环境无害，容易获得并易于在实验室内饲养和繁殖；3）世代

26、短、子代多、遗传背景清楚；4）容易进行实验操作，特别是具有遗传操作的手段和表型分析的方法。2.3 Features of Genomic Organization1. Features of prokaryotic genomes(1) Relatively small(2) Simple structure (3) Transcription unit：转录单元是一段以启动子开始至终止子结束的DNA序列。（A transcription unit is a sequence of DNA transcribed into a single RNA, starting at the promo

27、ter and ending at the terminator.）(4) Poly cistron在原核细胞中，通常是几种不同的mRNA连在一起，相互之间由一段短的不编码蛋白质的间隔序列所隔开，这种mRNA叫做多顺反子mRNA。这样的一条mRNA链含有指导合成几种蛋白质的信息。 (5) Overlapping gene 所谓重叠基因（overlapping gene）是指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上基因的组成部分。2. Genomes of Prokaryotes(1) E.coli Genome 4.6 million bp 90% of

28、genome encodes protein 4288 genes. almost no repeated DNA Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli.Nature , 2009(461)1243-1247, Jeffrey E. Barrick, Dong Su Yu, Sung Ho Yoon, et al. (2) Phage genome phage genome：Regulatory genesReplication genes 2 genes Lysis ge

29、nes 3 genes Recombination genes 10 genesHead 10 genesTail 12 genes 3. Features of Eukaryotic Genomes(1) Big size, big content(2) Repeat sequence Single copy Moderately repetitive sequenceAlu family：这是一类真核生物中的中度重复序列。重复序列中含有AGCT核心序列，可被Alu I切割(AG CT )。由于这类重复序列中有相同性质的结构，故称为Alu序列。 Highly repetitive seque

30、nceSatellite DNA ：是一类高度重复序列，成串排列。由于这类序列的碱基组成不同于其他部份，可用密度梯度离心法将其与主体DNA分开，因而称为卫星DNA或随体DNA。 高度重复 (106) 非常短 (mini- or microsatellite DNA), 串联排列 集中在着丝粒、端粒附件，是构成异染色质的主要部分 浮力密度梯度离心时呈分离带出现 目前没发现其具体功能，可能与着丝粒的结合有关 Minisatellite DNA ：一般分布在端粒处，也有分布于染色体的其它位置，重复单位是6-40bp ，长度为100bp-10kb。分布在染色体其它位置上的小卫星DNA随所处位置不同，重

31、复长度有差异 。因此也称为可变数目的串联重复（VNTR, Variable Number of Tandem Repeats）Minisatellite repeats are the basis of the DNA fingerprinting techniquesDNA fingerprinting techniques（DNA指纹印迹）：DNA指纹：指具有完全个体特异的DNA多态性，其个体识别能力足以与手指指纹相媲美，因而得名。可用来进行个人识别及亲权鉴定 图中显示了一个简单的DNA分析，用于父子关系的争议。父亲的VNTR基因库（A）、母亲（B)、两个小孩（C、D），在图中显示，小孩C的父子关系无可争议，但A怀疑他不是小孩D的父亲。从血液中得到的DNA用限制性内切酶剪切（小箭头