水母frizzled基因cDNA克隆及进化分析.docx

1、水母frizzled基因cDNA克隆及进化分析水母frizzled基因 cDNA克隆及进化分析摘 要 Frizzled 蛋白是一种七次跨膜蛋白，属于G蛋白偶联受体家族成员，其功能主要介导细胞之间的 Wnt 及其它信号转导途径，通过调节细胞核内靶基因的表达，对细胞增殖、细胞分化及细胞命运的决定起调控作用，对于胚胎发育和成体干细胞多能性的维持有重要作用。Frizzled基因普遍存在于脊椎动物和无脊椎动物中。目前人们已经在果蝇、线虫、爪蟾、斑马鱼、小鼠直到人类都发现了该信号通路的存在，但在腔肠动物水母中的研究资料很少。本实验设计针对水母的frizzled基因进行了cDNA克隆及进化分析。关键词：水母

2、frizzled基因，基因克隆，进化分析Rhopilema esculentum frizzled cDNA cloning and sequence analysisAbstract Frizzled is a seven transmembrane protein and belongs to G-protein coupled receptor family. It mainly mediates the Wnt signal pathway and other signaling pathways among organism. By regulating the expression

3、 of its target genes in nucleus, it can regulate cell proliferation, cell differentiation and cell fate decision. Further, it plays important roles in embryonic development and adult stem cell pluripotency maintenance. Frizzled genes are widely present in vertebrates and invertebrates. It has been r

4、eported that Frizzled involved Wnt signal pathway exist in the fruit fly, nematode, Xenopus, zebrafish, mice and human beings, but there is little information in the coelenterate Rhopilema esculentum. Here we cloned the full length cDNA of Frizzled in Rhopilema conducted phylogenetic analysis of the

5、 gene based on the gene cDNA sequence information among different species .Keywords: frizzled gene of Rhopilema esculentum， Gene Cloning, evolutionary analysis前言：海蜇，隶属腔肠动物门,钵水母纲,根口水母目,根口水母科，海蜇属。蜇体呈伞盖状，通体呈半透明，白色、青色或微黄色，海蜇伞径可超过45厘米、最大可达1米之巨，伞下8个加厚的（具肩部）腕基部愈合使口消失（代之以吸盘的次生口），下方口腕处有许多棒状和丝状触须，上有密集刺丝囊，能分泌毒

6、液。其作用是在触及小动物时，可释放毒液麻痹，以做食物。海蜇在热带、亚热带及温带沿海都有普遍散布。 由于人类过度打鱼和其他人类活动，地球上部份海域出现了庞大的水母，它们正成为某些海域的“主宰”。目前，全世界海洋里水母的数量都在上升，特别是东南亚、黑海、北海及墨西哥湾海域水母数量上升尤其明显。有报导显示，日本渔民已经碰到了巨型水母带来的真正麻烦，因为大水母乃至能撕破鱼网。 通常情况下，鱼类吃小水母而且同水母争夺食物，比如浮游生物，这样水母的数量就会取得控制。可是由于过度捕捞，水母的数量急剧增加。水母还会吃鱼卵和小鱼，进一步致使鱼类数量的减少。在我国胶州湾已发现3种大型水母泛滥， 我国的水母暴发主如

7、果大型水母。此刻沙海蜇、海月水母、白色霞水母这3种大型水母均出此刻胶州湾。其中，沙海蜇的体形较大，海月水母更靠近近岸，而白色霞水母的毒性较强。最近几年来由于水母泛滥引发的危害几回发生：以色列哈代拉的奥罗特拉宾发电厂因蒙受大量水母解决被迫关闭，成为又一座因水母作怪而被迫关闭的电厂。那时，大量水母阻塞了用于进行冷却的海水供给装置，电厂被迫停止运转，工作人员随后利用挖掘机清除水母； 苏格兰的托内斯核电站因类似事故被迫关闭反映堆； 在美国佛罗里达州瓦卢西亚县海域，让海滩上近2000名游客陷入恐慌当中。 出现的水母数量惊人，所幸没有人受重伤。在这个阳光充沛的州，从奥蒙德海滩到新士麦那海滩连绵20英里（约

8、合32千米）的区域内，水母将晒日光浴的游客当做了解决目标；2007年北爱尔兰唯一的一家三文鱼养殖场，蒙受了一次特大水母解决。这一事件共造成10万条三文鱼“全军覆没”；在日本，有海域作业时因所捞水母过重而出现船体倾覆事故；2009年，胶州湾水母暴发，水母“大军”入侵华电青岛发电有限公司热电厂，要挟机组的安全运行，工作人员在两天时间里就清理了1万多千克水母。 调查后发现惹祸的水母是海月水母。Frizzled蛋白是Wnt信号系统的重要受体。对胚胎发育进程中的细胞增殖、细胞分化、细胞命运的决定等大体进程也发挥重要调控作用。已在多种多细胞生物体中接踵发现了 frizzled 基因家族成员。可是对水母fr

9、izzled基因的研究资料还很少，本实验设计针对水母frizzled基因进行了初步研究与分析。通过研究frizzled基因能够更好的了解水母是如何增殖，对帮忙研究水母为何会大规模爆将起到帮忙。本实验通过克隆frizzled基因的cDNA和基因组序列，剖析其大体生物信息，为后续研究海蜇繁衍策略及环境因子诱导下的信号通路及发育调控机理等奠定基础。1. Frizzled研究背景综述基因Wnt 家族是一类分泌型糖蛋白，至今，在哺乳动物体内已经发现并经实验证明的 Wnt 家族成员共有19个1-3。是生物发育进程中重要的信号分子，在胚胎发育如细胞极性、细胞命运决定、细胞增殖和分化中发挥重要作用。Wnt 信

10、号途径还与肿瘤发生联系紧密, 而且能维持干细胞的多功能性从而调控成年生物体体内平衡4。但是在很长一段时间的探索 Wnt 信号传递途径机制的进程中，有一个重大的缺口就是受体的发现问题。因为无法取得大量可溶性的 Wnt 信号蛋白，研究者们转换传统的研究思路，利用一系列的遗传学方式、细胞生物学方式和大量生化实验数据证明了 Wnt 的重要结合受体是细胞表面的 Fz家族受体。frizzled 基因最初发现于果蝇的上皮细胞极性化阻断突变挑选实验而得名。尔后，在其它各类多细胞生物体也接踵发现了 frizzled 家族成员：脊椎动物中有 10 个成员，果蝇中有 5 个，线虫中有 4 个。通过对人的 Frizz

11、led 家族 10 个成员基因进行序列分析发现，不同的 Fz 基因之间具有 20%-40%序列相似性。 跨种属间 Fz 基因的保守性较低。蛋白结构Frizzled（Fz）蛋白属于 G 蛋白偶联受体（GPCR）超家族 。Frizzled蛋白是一组 7次跨膜蛋白分子，是 Wnt信号系统的重要受体5 Frizzled家族蛋白的结构是保守的，从昆虫到哺乳动物都编码共享富含半胱氨酸的胞外域和7个跨膜结构域的推测Wnt信号受体。Fz 家族蛋白一般含有三个大体结构:N-结尾位于胞外，具有信号肽和一个保守的半胱氨酸富集区，是胞外 Wnt 等信号分子和 Wnt 抑制因子（WIF）的结合位点跨膜区，含有7 个横跨

12、磷脂层的疏水性 螺旋；至少有三个胞内环和一个向胞内下游信号元件传递信息的 C-结尾尾部。另外，Fz 家族蛋白中存在着几个保守的标志性结构。CRD 被证明是 Wnt 激活 Fz 受体的重要位点所在，是 Wnt 信号通路传递信号不可缺少的结构。对每一个 Fz 基因进行 Kyte-Doolittle 点阵图分析后发现，疏水性跨膜区 GPCR 受体蛋白结构相同。其中位于和、和之间的胞外环结构，均含有超级保守的半胱氨酸残基，能够形成重要的二硫桥结构，这一点也与 GPCR 受体的结构一致。在紧接疏水性跨膜区段后面两个氨基酸的位置处有一段保守的基序KTXXXW。若三个氨基酸发生任意的点突变，Wnt/-cat

13、enin信号通路则会受阻。已有实验证明，该基因序与胞内下游的 Dvl 蛋白的 PDZ 结构域结合来传递信号 。Fig1. frizzled蛋白结构简图. frizzled基因在不同物种中的研究对 Frizzled 受体生物学功能研究表明，作为Wnt信号通路的重要成员，Frizzled蛋白受体对胚胎发育进程中的细胞增殖、细胞分化、细胞命运的决定等大体进程也发挥重要调控作用。Frizzled基因最初发现于果蝇的细胞极性化突变实验，在实验中发现frizzled基因突变致使成年果蝇的毛发、刚毛和小眼的异样发育 。 在模式生物中的研究发现，Fz受体和Wnt-Fz结合配对对于生物体的生长发育有重要作用。在

14、秀丽线虫中，lin-17（Fz）在lin-44（Wnt）的激活下能够调控EMS细胞的不对称割裂；在爪蟾中，Xfz3受体能够调节眼睛的正常发育，而Xfz5则与眼睛的神经视网膜发育相关 ；人的frizzled6(FZ6)基因染色体定位于8q223-q231编码Frizzled6(Fz6)蛋白。共有 IO个成员：FZ1一FZ10。Fz蛋白是分泌性 Wnt蛋白的受体，在细胞极性调节方面发挥关键作用。对于胚胎发育、组织细胞极性 、神经突出形成 、增殖调控乃至发育阶段和成年时期的许多其它生物学进程的正常进行，Fz基因功能都是必需的6。. Frizzled基因与疾病的研究有研究表明Fz基因与人类多种疾病相关

15、联 ，如心肌肥大，家族性渗出性玻璃体视网膜病变和精神割裂症等7。最近几年发现，心肌细胞增殖、分化和凋亡进程伴有WntFzd信号通路分子的参与。例如，WntFzd信号通路参与心肌细胞凋亡和干细胞向心肌细胞分化并与心力衰竭发病有关。Wntcat信号在胚胎干细胞向心肌细胞分化中起双重作用：胚胎发育初期，该信号提高胚胎于细胞向心肌细胞分化而阻止其向血细胞和光滑肌细胞分化；胚胎发育晚期，其作用正好相反。SFRP一2在心脏发育初期通过抑制Wnt3acat信号通路从而抑制心肌细胞分化。因此，经典WntFzd信号通路在胚胎发育的不同时期对心肌细胞分化起着不同的调节作用。Wnt 蛋白的受体发育进程中，在特定的时

16、间和特定的环境诱导下，某些组织或细胞群体分泌 Wnt蛋白。分泌的 Wnt 蛋白通过与基质中的蛋白质（如 FRPs，Dally 等）彼此作用后，与细胞膜上的受体彼此作用。遗传表型分析实验表明Frizzled（Fz）家族是 Wnt 蛋白的膜上受体，而 LRP 作为作为新近发现的共受体在 Wnt信号途径中也起着重要作用8-14。 Wnt-fz通路参与了胚胎背腹轴的形成、细胞极性成立、细胞命运决定等多个发育进程。在神经管闭合进程中，胚胎基因的异样是一种被普遍观察到的现象另外，Wang等15 的研究表明FZ3和 FZ6的异样与小鼠内耳毛细胞发育异样和神经管闭合不全发生存在关联。Ishikawa等16的研

17、究表明 FZ5基因的缺失在小鼠胚胎发育初期则更是致命的。2实验材料与方式.材料2.1.1. 动物：Rhopilema esculentum （海蜇）2009年9月，在中国江苏省射阳县东海岸收集野生成体海蜇重量（2600g-3300g），然后运至位于中国山东省荣成市的海蜇养殖厂进行养殖。2.1.2. 质粒与菌种：pMD18-T载体、大肠杆菌Top102.1.3.主要试剂和酶：Taq polymerase（聚合酶）、10LA PCR Buffer II（Mg2+Free） dNTP Mixture、ddw、6loading buffer、marker、试剂盒、LB液体培育基等2.1.4.主要仪器：

18、微量可调移液器、恒温摇床、水浴锅和超净工作台、超低温冰箱、冰箱、制冰机、高压灭菌锅、凝胶电泳系统 、高速冷冻离心机Mikro 22R 、微量离心机LX-100 (江苏其林贝尔)凝胶分析系统Quantity one (Bio-rad)、PCR仪 PTC-200(Bio-rad)、全自动凝胶成像仪 Gel Doc XR(Bio-rad).方式：2.2.1海蜇cDNA文库构建与Frizzled EST分析提取海蜇螅状幼体、横裂体、蝶状幼体和水母体RNA，等量混合后用SMART cDNA Library Construction Kit构建cDNA文库，然后用Roche Next Generation

19、 Sequencer GS FLX System 454 测序) 进行半板测序，该工作是由夏威夷大学的ASGPB完成。用Roche 454s Newbler (版本 组装后，共取得332674条高质量ESTs（100bp）。利用BLAST分析所有序列显示其中一个海蜇的单基因(isotig11452)与frizzled基因高度相似(CAJ32309)。这一EST序列被挑选出来作为进一步从海蜇中克隆的frizzled基因。2.2.2.水母总RNA的提取： 所有的RNA的分离都是用TRIzol试剂(Invitrogen)别离的从螅状幼体、横裂体、蝶状体、和水母提掏出来的。并电泳检测总RNA的完整性。

20、然后依照相应的比例混合。 总RNA提取具体操作步骤如下：（1）将样品从80中掏出，放入液氮中，取适量样品于研钵中，加入液氮研磨，直至成粉末状。加1ml Trizol猛烈震荡，后静置5min。（2）加200l氯仿，猛烈震荡，室温静置5min。（3）12000 r. p. m 4 离心8分钟。（4）取上清至新管，重复2，3。（5）取上清至新管，加入等体积异丙醇，上下倒置离心管混匀后，15到30下静置10min。（6）12000 r. p. m 4 离心10分钟（有沉淀见于管底）。（7）倾弃上清，缓慢沿管壁加入75%乙醇1ml（切勿触及沉淀）（250l DEPC水750l乙醇）上下倒置，洗涤管壁。（

21、8）12000 r. p. m 4 离心7分钟后弃乙醇，重复7。（9）12000 r. p. m 4 离心7分钟，弃乙醇，室温干燥，加DEPC水溶解RNA。2.2.3.海蜇frizzled基因cDNA全长克隆 基于被识别的单基因，设计两个特殊引物(FZF696 和 FZR1049)通过5-RACE和3-RACE放大frizzled cDNA序列的全长(Table 1)。 首先进行cDNA第一链的合成:取总RNA 1g,引物Oligo (dT)18Primer (25M ) 1L ,在M2MLV逆转录酶的作用下合成cDNA第一链,操作依照TaKaRa的M2MLV逆转录酶利用说明书进行。2.2.3

22、.1. Frizzled cDNA的3-RACE 用引物序列FZF696和反向引物T7进行【各类引物序列】引物名称 引物序列（53）3RACE Adaptor 含有由 TaKaRa 独特设计的 dT 区域及 Adaptor Primer 部份引物名称引物序列（53）3RACE Adaptor含有由 TaKaRa 独特设计的 dT 区域及 Adaptor Primer 部分3RACE Outer PrimerTACCGTCGTTCCACTAGTGATTT3RACE Inner PrimerCGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG3RACE Control Outer Pr

23、imerGAGTGCAGGACATTGTGGTAGGG3RACE Control Inner PrimerATCTTTGACTGCCGTTCTCGACC 利用TaKaRa LA Taq （TaKaRa Code：DRR02AM）进行PCR反映时的实验操作如下。 Outer PCR 反映。反映体系及反映条件如下：反映体系:上述反转录反应液X l*21cDNA Dilution Buffer II10-X lGene Specific Outer Primer（10 M）2 l3RACE Outer Primer（10 M）2 l10LA PCR Buffer II（Mg2+Free）4 lMgC

24、l2（25 mM）3 lTaKaRa LA Taq （5 U/l） ldH2O lTotal Volume50 lPCR反映的程序设置为：94 C 、4 min； 94 C 、50 s； 58C 、 50 s； 72 C 、 55 s； 额外的延伸：72 C 、10 min； 33 个循环。PCR 反映结束后，取 510 l 的 PCR 反映液进行琼脂糖凝胶电泳，确认 PCR 扩增产物。此 PCR 扩增产物于-20保留。 2.2.3. cDNA的5-RACE 【各类引物序列】引物名称引物序列（5 3）长度5RACE Outer Primer5RACE Inner Primer5RACE Con

25、trol Outer Primer5RACE Control Inner PrimerCATGGCTACATGCTGACAGCCTA 23 mersCGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG 34mersAGGTAGGTGATGTTCCGAGAGCGT 24 mersTTGGAGTCGCCCTCAGCAGAGAT 23 mers用T3引物和反向引物FZR1049在25 l的反映体系中进行，包括：10 PCR buffer lMgCl2 (25 mmol l1) ldNTP mmol l1) leach primer (10 mol l1)1 lPCR-grade wa

26、terlTaq polymerase（聚合酶） (Promega) l (1 U)cDNA mix1 l PCR的温度曲线为94 C 为 4 min, 94 C 45 s, C 45 s, 72 C 50 s, 和最终延伸为 72 C - 10 min. 33 个循环PCR产物通过纯化和克隆链接到pMD18-T载体(Takara宝生物)。通过转化进入大肠杆菌Top10，重组体培育在含有氨苄青霉素的LB培育基通过蓝白斑进行挑选。PCR产物纯化和测序，结果序列进行聚类分析。.海蜇frizzled基因cDNA的生物信息学分析用BLAST在NCBI（National Center for Biotec

27、hnology Information）上对Frizzled进行相似性序列的分析，用Simple Modular Architecture Research Tool 对feizzled的蛋白质的结构域进行预测。用（）中SignalP Server 对frizzled的信号肽进行预测，对frizzled进行相似性序列的分析的基础上，用Mega 的临近法构建系统树。3结果与分析.核苷酸及氨基酸序列生物信息学分析水母frizzled基因的 cDNA 全长 2488bp，1541912bp 为编码区序列，编码 585 个氨基酸。 相对分子质量 : ；Theoretical pI（等电点）: 。利用生

28、物信息学软件分析 frizzled氨基酸序列，预测结果表明 Frizzled 家族蛋白结构特征：28145 个氨基酸残基段为半胱氨酸富集区（cystein rich domain, CRD），含有 10 个保守的半胱氨酸；245556 氨基酸区段为七个跨膜的 螺旋疏水区；C-端尾部位于胞内，含有磷酸化位点。 通过人（human, ）、类人猿（Pan troglodytes,）、小鼠（Musculus,）、斑马鱼（Danio ,）、爪蟾（Xenopus,）、斑马（Taeniopygia,）的基因序列进行比对。其他物种如曼氏血吸虫的 Fz9蛋白和爪蟾Fz9进行氨基酸序列的比对。结果显示，在 CRD

29、 区内均含有 10 个保守的半胱氨酸，且跨膜区序列相当保守。Fig2.水母frizzled的核苷酸和氨基酸序列: 起始、终止密码子均用方框标出,下划线处为跨膜区段. 如图2所示，水母frizzled基因的 cDNA 全长 2488bp，1541912bp 为编码区序列，编码 585 个氨基酸。其中包括持续 10 个半胱氨酸为保守的 CRD 结构。 和 7次跨膜区域 。 Fig3.用PROSITE数据库分析取得：如上图所示frizzled蛋白间存在五个二硫键，下游编码G蛋白偶联受体（）Fig4.运用Tmap进行序列分析：如图所示，显示的七个峰值表示frizzled蛋白的七个跨膜区域. 不同物种f

30、rizzled氨基酸序列:Fig5.不同物种frizzled氨基酸序列比对:对不同物种frizzled氨基酸序列进行了比对。其中S1代表Rhopilema esculentum （海蜇），Homosapiens（人类），Musmusculus（小鼠），Danio rerio（斑马鱼）Clytia hemisphaerica（纤细美螅）、Hydra vulgaris（淡水水螅）；Hydractinia echinata（贝螅）如Fig3所示frizzled蛋白具在不同物种间具有高度的保守性。. 不同物种的frizzled序列进化树:Fig6.不同物种的frizzled序列进化树: （S1代表Rh

31、opilema esculentum （海蜇），Homosapiens（人类），Musmusculus（小鼠），Danio rerio（斑马鱼）Clytia hemisphaerica（纤细美螅）、Hydra vulgaris（淡水水螅）；Hydractinia echinata（贝螅）（比例尺，表示物种间的进化距离）进化树分析显示，海蜇frizzled与其它几种水螅聚在一路，而且在进化树种中位于底部，与其分类地位相一致。.用ORF Finder (Open Reading Frame Finder)进行开放阅读框的识别。Fig7.水母frizzled基因ORF测序：如上图所示，水母frizzled基因含12个ORF的位置和长度蛋白信号肽预测蛋白信号肽预测，如图所示，在第23和24个氨基酸之间存在剪切位点。D值显示此信号肽为分泌蛋白。（S值：每一个氨基酸对应一个S值，信号肽区域S值较高；C值：剪切位点处最高；Y值：为S值峻峭的位置和具有高C值的位点；D值：区分是不是为分泌蛋白）（# Measure Position Value Cutoff signal peptide? max. C 24