抗肿瘤药物药效学实验方法及指导原则.docx

1、抗肿瘤药物药效学实验方法及指导原则抗肿瘤药物药效学实验方法及指导原则一、 基本原则1.抗肿瘤药物分类细胞毒类药物(cytotoxic age nt)：包括干扰核酸和蛋白质合成、抑制拓扑异构 酶及作用于微管系统的药物等；(2)生物反应调节剂(biological response modifier)；(3)肿瘤耐药逆转剂(resista nee reversal age nt)(4)肿瘤治疗增敏剂(oncotherapy sensitizer)肿瘤血管生成抑制剂(tumor angiogenesis inhibitor)；(6) 分化诱导剂(differe ntiati on in duci n

2、g age nt)； 生长因子抑制剂(growth factor inhibitor)；(8)反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide)。2.抗肿瘤药物药效学需研究内容2.1包括体外抗肿瘤试验，体内抗肿瘤试验。2.2评价药物的抗癌活性时，以体内试验结果为主，同时参考体外试验结果以 做出正确的结论。2.3 I类抗肿瘤新药应进行药物作用机制初步研究。二、 体外抗肿瘤活性试验1.试验目的1.1对候选化合物进行初步筛选；1.2 了解候选化合物的抗瘤谱；1.3为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考，如剂量范围、肿瘤类别等 。2试验方法选用10-15株人癌细胞株，根据试验目的选择相应细

3、胞系及适量的细胞接种浓度， 按常规细胞培养法进行培养；推荐使用四氮唑盐MTT还原法、XTT还原法、磺 酰罗丹明B(SR染色法、或51Cr释放试验、集落形成法等测定药物的抗癌作用。药物与细胞共培养时间一般为48-72小时，贴壁细胞需先贴壁24小时后再给药。 试验应设阳性及阴性对照组，阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药，阴性对照为 溶媒对照。3.评价标准以同一样品不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图可得到剂量效应曲线，然后采用 Logit法计算半数有效浓度(IC50值或EC50值)。体外试验至少重复一次。附注：评价药物抗癌活性的方法：1.MTT还原法1.1基本原理：四氮唑MTT,3-(4,5-dimethy

4、libiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与 NADP相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲月替(formazan),而死的细胞则无此功 能。用二甲基亚讽(DMSO)溶解甲月替后，在一定波长下用酶标仪测定光密度 值，即可定量测出细胞的存活率。1.2操作步骤：1.2.1选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞，用胰酶消化后，用含 10%小牛血清的RPMI 1640培养基配成5000个/ ml的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔接 种 200卩，37C，5%CO2 培养 24 h。1.2.2实验

5、组换新的含不同浓度被测样品的培养基，对照组则换含等体积溶剂的培养基, 每组设35平行孔，37C, 5% CO2培养45 d。1.2.3弃去上清液，每孔加入200卩新鲜配制的含0.2 mg/ml MTT的无血清培 养基.37T继续培养4 h。小心弃上清，并加入200卩l DMSO用微型超声振荡 器混匀后，在酶标仪上以试验波长为570 nm,参比波长为450 nm测定光密度值。1.3结果评定：按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：肿瘤细胞生长抑制率= (1- OD实验/OD对照)100%以同一样品的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图可得到剂量反应曲线， 从中求出样品的半数杀伤浓度IC50。合成化合物

6、或植物提取纯品的IC50V 10卩/m1 或植物粗提物的IC50V20卩/m1时，贝U判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作用。2.生长曲线法的基本原理：在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈指数生长，如取细胞数的对数与培养时间 作图可得一条直线，故称此时为对数生长期。随着细胞密度不断增高，由于代谢 产物的积聚及营养物的消耗，细胞生长逐渐减慢以致停止，此时称高坪期或稳定 期。因此药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反映出来。3.染料排斥试验的基本原理：活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、苯胺黑等的能力，而死细胞由于膜完整 性的破坏，可被着色。因此培养的肿瘤细胞中加入这些染料，一定时间后，对着 色和未着色的

7、细胞进行计数，即可算出被杀死的细胞比例。4.集落形成法的基本原理：克隆原细胞具有持续增殖能力，当单个细胞分裂6代或6代以上时，其后代所组 成的群体(集落)便含50个以上细胞。通过集落计数可对克隆原细胞作定量分析。 它反映了单个细胞的增殖潜力，故能较灵敏地测定抗癌药的活性，日前被认为是 一种较理想的检测方法。常用的集落形成法可分为贴壁法及半固体培养法两种。5.SRB法的基本原理：SRB(sulforhodamine -是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水。 SRB可与 生物大分子中的碱性氨基酸结合。其在 515 nm波长的0D读数与细胞数呈良好 的线性关系。故可用作细胞数的定量。 MTT法的一

8、个缺点是0D值可随放置时 间而变，而SRB法无此现象。因此更适用于进行大规模的试验。三、体内抗肿瘤试验体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型， 其中至少一种为人癌裸小鼠移植模 型或其它人癌小鼠模型。试验结果三种模型均为有效，再重复一次也为有效，评 定该化合物对这些实验性肿瘤具有治疗作用。鼓励使用人类肿瘤裸鼠移植瘤模型和多种类的移植瘤模型、原位接种模型和中空纤维测定(hollow-fiber assay)等方法。1.动物动物要求健康，符合等级动物要求，有实验动物合格证。雌雄均可，但同一批实验中动物性别必须相同。小鼠鼠龄为 5-6周，体重为18-22克。评价同一物质的活性时，不同批次的实验必须采用

9、同一品系的小鼠。2.肿瘤模型2.1小鼠肿瘤模型淋巴细胞白血病腹水瘤 L1210和P388、白血病L-615、宫颈癌U14、肝癌H22、 Lewis肺癌、黑色素瘤B16、网织细胞瘤M5076、肠癌26、肠腺癌38、乳腺癌CD8F1、艾氏腹水瘤(EAC)、肉瘤-180等，以及各种小鼠肿瘤的亚型和耐药株 等。2.2人癌裸小鼠移植瘤模型应选用体外试验敏感细胞株进行体内抗人癌裸小鼠移植瘤试验。 模型建立和使用应注意：(1)移植瘤一般由相应的细胞株移植而建立，对细胞株和移植瘤的化疗敏感性应予了解。(2)移植瘤复苏后一般应传2-3代后再用于体内抗肿瘤试验。(3)对模型生长情况应全面了解，尤其是生长快的模型(

10、4)为了保持移植瘤的生物学特性和遗传特性，复苏后移植瘤体内传代应少于15-20 代3.试验过程3.1接种：肿瘤接种方法主要有皮下接种、腹腔接种和原位接种。3.1.1皮下肿瘤模型选择肿瘤生长旺盛且无溃破的荷瘤小鼠， 颈椎脱臼处死，在无菌条件下(超净台或接种罩)，用碘酒、酒精或新洁尔灭消毒动物皮肤，切开皮肤，剥离肿瘤。将 瘤组织剪成1.5 mm3左右，用套管针接种于动物一侧或双侧腋窝皮下； 或制成细胞悬液，然后按一定比例加入无菌生理盐水， 一般每只小鼠接种肿瘤细胞数量为(1-5) X106o3.1.2腹水瘤模型无菌条件下，消毒动物皮肤，吸取生长良好的动物腹水，以生理盐水按一定比例 稀释后接种于动物

11、腹腔，接种细胞数量一般为(1-5) X106o3.1.3原位接种模型原位接种是指将来源于某脏器的肿瘤接种在动物的某脏器， 如将人肝癌接种在裸小鼠的肝脏。原位接种不是常规的方法，但有其优越性，是鼓励使用的方法。主 要有肺、肝、胃、肠、乳腺、颅内等原位接种方法。3.2动物分组3.2.1试验设阴性对照组、阳性对照组、治疗组。3.2.2治疗组设高、中、低三个剂量组。小鼠肿瘤和腹水瘤接种后次日将动物随 机分组，裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至 100 300mm3后将动物随机分组。3.2.3动物数普通小鼠每组10只，裸鼠6只。阴性对照组动物数为治疗组动物 数实验组数1/23.3剂量设置3

12、.3.1治疗组设高、中、低剂量治疗组，一般按4:2:1设置，高剂量使用最大耐受 量或LD10的剂量。3.3.2阴性对照组给予相应的溶剂；3.3.3阳性对照药选用对该动物敏感的、临床应用的抗肿瘤药物，3.3.4如受试物为一抗癌药物的衍生物或类似物时，必须选用该抗癌药物作为阳 性对照药。3.4阳性对照药选择原则疗效确切；与被试物质化学结构类似；与被试物质有类似的作用机理。3.5药物配制溶于水的药物，用生理盐水或蒸馏水配制；如用酸、碱溶解者，可先用小量酸(0.1-0.5N HCI)或碱(NaHCO3、Na2CO3、NaOH)溶解，调节 pH 在 4.5-9.0 的范围 内。用乙醇、丙二醇、吐温80、

13、DMSO助溶的药物，或用吐温60、吐温80、2-3% 淀粉、0.5%羧甲基纤维素制成混悬液的药物，可腹腔注射或口服，但必须设相同 浓度的溶剂对照组。用注射用花生油配制的溶液或乳剂可口服、 皮下或肌肉注射。3.6给药方案和给药途径分组当日开始给药，根据不同药物的代谢动力学和毒性反应等确定给药方案。给 药途径应与推荐临床用药的途径相同。 给药次数较多，或被试物质溶解性较差，静脉给药有困难时，可考虑使用腹腔给药，但在评价药效时要注意这两种给药途 径是有差别的。 可采取瘤周、瘤内、肌肉、皮下给药途径。腹水瘤试验时一般不能应用腹腔给药途径。4评价标准4.1腹水瘤模型接种给药后，观察和记录动物死亡时间，计

14、算生存天数。如阴性对照组20%动物 存活时间超过4周，表明腹水瘤生长不良，实验作废。采用中位生存时间(即 median survival time,MST )来评价每组的生存时间 ，其 计算公式为：每组鼠数的中间数-中间生存天数前死亡的鼠数MST=(中间生存天数-0.5)+中间生存天数死亡的鼠数治疗组与对照组的比较，采用 T/C( %)来表示，计算公式为：T MSTT/C % = X 100%C MSTT MST :治疗组 MST ; C MST :阴性对照组 MST。评价标准以125%为界，当T/C% 125%时。视为有效，反之则无效。4.2裸鼠移植瘤模型推荐使用测量瘤径的方法，动态观察受试

15、物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数 根据移植瘤的生长情况而定，一般为每周 2-3次,每次测量同时还需称鼠重。肿瘤体积(tumor volume,TV)的计算公式为：V = 1/2 aXb2 或 n /6 X aX bXc其中a、b、c分别表示长宽高。两公式的相关性极好，可采用任一公式。根据测量结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume， RTV)， RTV = Vt /V0。其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿 瘤体积。抗肿瘤活性评价指标为相对肿瘤增殖率 T/C (%)TRTVT/C % = X 100%CRTVTRTV:治疗组RTV

16、; CRTV :阴性对照组RTV。疗效评价标准：T/C % 60 %为无效；T/C % 60%并经统计学处理P0.05为 有效。4.3小鼠肿瘤模型生长较慢小鼠肿瘤采用与裸鼠移植瘤同样的测量瘤径的评价方法。生长较快小鼠肿瘤可采用称瘤重的方法评价。 试验结束后处死动物，称体重，解 剖剥离瘤块，称瘤重。阴性对照组肿瘤平均瘤重小于1克，或20%肿瘤重量小于 400毫克，表示肿瘤生长不良，试验作废。疗效评价公式：给药组平均瘤重-阴性对照组平均瘤重肿瘤生长抑制率 = X 100%阴性对照组平均瘤重评价标准：肿瘤生长抑制率 40%并经统计学处理 P100%。4.肿瘤血管生成抑制剂4.1体外试验体外试验模型有

17、：(1)人血管内皮细胞模型：人脐静脉血管内皮细胞和人微血管(肺、皮肤等)内皮细胞。(2) 血管形成促进因子等刺激细胞 DNA合成、增殖、迁移、血管形成 (tube formatio n)来观察药物的抗血管形成作用。如血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)或碱性成纤维细胞 生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)(3)肿瘤细胞模型：主要应用国内已建立的人实体癌细胞系，确定 VEGF、FGF等高分泌的细胞株。检测细胞增殖、转移能力及血管形成因子的基因表达状况来评价药物。4.2体内试验4.2.1血管抑

18、制试验经典的血管形成评价方法有：鸡绒毛膜尿囊和卵黄膜囊( CAM )、啮齿动物虹膜 和角膜等。也可用如皮下移植塑料或多孔的 polytetrafluoroethylene管、皮下移植 无菌的海绵；一些自然的或化学修饰的物质如 Matrigel和纤维凝胶等用于体内 模型。4.2.2抗肿瘤试验通过观察新生血管生成抑制剂的体内抗肿瘤效应检测移植瘤的血管密度、 血管生成因子和抑制因子的分泌和表达，以及肿瘤的转移情况等综合评价肿瘤血管生成 抑制剂的作用和作用机制。5.分化诱导剂分化诱导剂的药效学研究包括体外和体内研究模型； 目前的药物主要能对急性白血病进行有效的分化治疗。阳性对照药选用维甲酸类 (ret

19、in oid )化合物。5.1体外试验5.1.1白血病的分化诱导常用的细胞株有人急性早幼粒白血病细胞株 HL-60、NB4细胞、人红白血病K562细胞等。可选择以下试验方法研究并判断结果：(1、四唑氮蓝(NBT)还原试验：对照组细胞的还原能力 10%候选化合物的还原能力50%(2、细胞形态学观察：可在光学显微镜与电镜下观察候选化合物作用后细胞的形态学变化， 对照组的早幼粒细胞应90%-95%,候选化合物组细胞分化，成熟粒细胞占比例越高，说明 该化合物的分化效果越好。5.1.2实体瘤细胞的分化诱导常用细胞株：人肝癌HepG2、SMMC7721试验方法及评价标准：主要测定细胞的甲胎蛋白（AFP）、

20、白蛋白含量，y谷氨酸转移酶（心T）、酪氨酸转 氨酶（TAT ）活性及观察细胞形态。分化细胞AFP含量、TAT和yGT活性明显降低，白蛋白含量增加，细胞胞质增 加、核缩小。5.2体内试验常用人癌细胞小鼠肾囊膜下移植试验、小鼠髓单核细胞白血病试验和人癌细胞裸 小鼠移植瘤模型等。可选两种模型，根据肿瘤鼠生存时间、肿瘤的体积及形态变化，观察分化诱导效 果。重复试验一次。6.肿瘤治疗增敏剂增敏剂主要是指放射治疗增敏剂，能增加临床上恶性肿瘤放射治疗或其它治疗的 疗效及降低治疗后的复发率。6.1体外试验分别选择对放射、化疗药物具有中、低度敏感的人肿瘤细胞株，采用MTT、SRB 或细胞集落形成方法进行化合物的细胞毒性试验，以 IC50值作为评价指标。6.2体内试验选用对射线及化疗药物敏感性较小的三种实体瘤模型进行试验， 其中至少有一种人癌裸鼠移植瘤模型。由强致癌物或病毒等因素诱发的肿瘤，或者不是在同一品系动物身上移植传代的 肿瘤往往会出现免疫反应，因此都不能用于肿瘤治疗增敏剂研究。疗效评价可参照体内抗肿瘤试验 。