卡托普利对性2型糖尿病心肌病大鼠模型心脏保护作用研究.docx

1、卡托普利对性2型糖尿病心肌病大鼠模型心脏保护作用研究卡托普利对实验性2型糖尿病心肌病大鼠模型心脏保护作用研究董世芬1，洪缨1，靳洪涛2，孙建宁1*（1. 北京中医药大学中药学院，北京 100102；2. 中国医学科学院北京协和医学院药物研究所新药安全评价研究中心，北京 100050） 【摘要】 目的 研究卡托普利对实验性2型糖尿病心肌病（T2DC）模型动物心脏保护作用和可能机制。方法 以高糖脂饲料负荷30 mg/kg剂量链脲佐菌素一次性腹腔注射建立T2DC大鼠模型，观察卡托普利45 mg/kg灌胃给药6周对模型动物血糖和血脂水平，心脏功能和结构变化，心肌脂肪酸含量以及心肌组织过氧化物增殖体激活

2、受体（PPAR ）和葡萄糖转运体4（GLUT4）基因表达等指标的影响。结果 与T2DC大鼠模型比较，卡托普利给药后，左心室收缩压、左心室最大收缩速率、左心室最大舒张速率的绝对值和心输出量分别显著增加15%、77%、52%和54%（P 0.05或P 0.01）；室间隔厚度降低40%（P 0.001）；血浆糖化血红蛋白和心肌组织游离脂肪酸含量分别降低31%和24%（P 0.01，P 0.05）；心肌组织PPAR 基因表达显著降低（P 0.05），GLUT4基因表达显著增加（P 0.05）。结论 卡托普利可以显著改善T2DC模型动物心脏功能、抑制心室重构，其作用机理可能同调节与能量代谢相关基因表达、

3、减轻心脏内脂肪积聚有关。 【关键词】2型糖尿病心肌病；卡托普利；心脏功能；心脏结构；能量代谢 【中图分类号】 R-332Protective effects of captopril on cardiac function and structure in experimental type 2 diabetic cardiomyopathy rat modelDONG Shi-fen1, HONG Ying1, JIN Hong-tao2, SUN Jian-ning1*(1. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of C

4、hinese Medicine，Beijing 100102, China; 2. Department of Evaluation of Drug Safety, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China)【Abstract】Objective To study effects of captopril on cardiac function and structure in the experim

5、ental type 2 diabetic cardiomyopathy (T2DC) rat model. Methods The experimental type 2 DC model rats were induced by feeding with high sucrose-fat diet and intraperitoneal (i.p.) injection with 30 mg/kg of streptozotocin. The model rats were intragastric given with captopril at the dose of 45 mg/kg

6、for six months totally. At the thirteenth week, the parameters of cardiac output (CO), left ventricular systolic pressure (LVSP), left ventricular end diastolic pressure (LVEDP), the maximum rate of myocardial contraction (+dp/dtmax) and the maximum rate of myocardial diastole (-dp/dtmax) were detec

7、ted using MP150 polygraph physiological signal recorder to evaluate cardiac function. The thickness of interventricular septal (IST) and left ventricular wall (LVWT) was measured to assess cardiac structure. Levels of fasting blood sugar (i.e., fasting plasma glucose (FPG) and glycated hemoglobin A1

8、c (HbA1c), blood lipid (i.e., total cholesterol (TC) and triglyceride (TG) and myocardial non-esterified fatty acids (NEFA) and creatine kinase (CK) were determined by ultraviolet spectrophtometric method. The genes expression of cardiac peroxisome proliferator activated receptor- (PPAR ) and glucos

9、e transporter-4 (GLUT4) mRNA were detected by real-time PCR method. Results When compared with the drug-untreated T2DC rat model, the parameters of LVSP, +dp/dtmax, absolute value of -dp/dtmax and CO were significantly increased by 15%, 77%, 52% and 54%, respectively, after treated with 45 mg/kg of

10、captopril. Meanwhile, the value of IST was decreased by 40% after treatment of captopril in T2DC rats. Levels of plasma HbA1c and myocardial NEFA were remarkably decreased by 31% and 24%, when compared with T2DC group. Furthermore, expression of PPAR was significantly decreased while GLUT4 mRNA incr

11、eased, when compared with drug-untreated model rats. Conclusion Captopril treatment could effectively attenuate the diastolic and systolic dysfunction and inhibit the cardiac hypertrophy in experimental type 2 diabetic cardiomyopathy rats, and the therapeutic mechanism might be relate to mediating e

12、nergy metabolism and lowering lipid accumulation in the heart.【Key words】 Type 2 diabetic cardiomyopathy; Captopril; Cardiac function; Cardiac structure; Energy metabolism 卡托普利（captopril，Cap）作为血管紧张素转化酶抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI），常用于高血压和充血性心力衰竭的治疗1，在治疗高血压时显示出防止和逆转心肌重塑等优势。动物研究证实卡

13、托普利还可以改善C57BL/6J-lepob（ob/ob）肥胖小鼠的心肌能量代谢异常2，抑制钙激活中性蛋白酶导致的心脏功能异常和心肌细胞凋亡3，并可通过抑制肾组织葡萄糖沉积4,5、减轻肾脏纤维化过程6等改善糖尿病肾病。糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DC）是糖尿病心脏病的一种特异性病变7，以发病早期出现左心室重量增加和心肌纤维化异常为特点8。肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）的激活在DC早期左心室肥厚的发生以及疾病发展过程中有重要的作用9。本研究采用高热量饮食负荷化学因素建立2型糖尿病

14、心肌病（type 2 diabetic cardiomyopathy，T2DC）大鼠模型，观察卡托普利对模型动物心脏功能和心脏结构变化的影响，并从血糖、血脂和心肌组织脂肪酸变化，以及与能量代谢相关基因表达等方面探讨卡托普利对糖尿病心肌病的可能作用机制。1. 材料和方法1.1 实验动物 SPF级Wistar雄性大鼠，来源于北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2007-0001】，体质量（18020）g。于室温2225，相对湿度65%，12 h明暗交替环境中适应7 d后进入实验。1.2 药品与试剂 高糖脂饲料（20%蔗糖+10%猪油+2.5%胆固醇+1%胆盐+66.5%基础饲料粉），来

15、源于北京科澳协力饲料有限公司【SCXK（京）2005-0007】；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）和卡托普利（captopril，Cap）由Sigma公司提供，批号分别为38K152和77K1623。葡萄糖、糖化血红蛋白（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、游离脂肪酸（non-esterified fatty acids，NEFA）和肌酸激酶（creatine kinase，CK）生化测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，批号20090601。主要re

16、al-time PCR试剂：TRIzol试剂，无RNA酶的水，无RNA酶的糖原，10000 Sybergreen，Invitrogen life technologies提供，美国；RNA酶抑制剂，MMLV反转录酶，10 RT缓冲液（250 mM Tris-HCl，pH 8.3，200 mM KCl，40 mM MgCl2，5 mM DTT），Epicentre biotechnologies 提供，美国；2.5 mM dNTP混合液（dATP，dGTP，dCTP和dTTP各2.5mM），HyTest Ltd. 提供，美国；Taq聚合酶，Promega 提供；Random 9，上海生工生物工程

17、有限公司提供；100 bp DNA Ladder，天根生化科技（北京）有限公司提供。过氧化物增殖体激活受体（peroxisome proliferator activated receptor-, PPAR ）引物信息为5ATTTGCCAAGGCTATCCCA3（正向），5CAGCATCCCGTCTTTGTTCA3（反向），葡萄糖转运体-4（glucose transporter-4，GLUT4）引物信息为5TCCTTTCCTCGCAGCACTT3（正向）和5CCACAGCCTAGCCACAACAC3（反向），甘油三磷酸脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrog

18、enase，GAPDH）引物信息为5GGAAAGCTGTGGCGTGAT3（正向）和5AAGGTGGAAGAATGGGAGTT3（反向）。 1.3 主要实验仪器 紫外分光光度计：AGILENT 8453，Agilent Techologies，德国；Biopac System MP150，Biopac System Inc.，美国；Gene Amp PCR System 9700，Applied Biosystems，美国；TaKaRa PCR Thermal Cycler，大连宝生物工程有限公司；DYY-8型稳压稳流电泳仪，上海琪特分析仪器有限公司提供；H6-1微型电泳槽，上海精益有机玻璃制

19、品仪器厂提供；Rotor-Gene 3000 Real-time PCR仪，Corbett Research提供，澳大利亚；引物设计软件：Primer 5.0，Rotor-gene 6.0，Corbett Research提供，澳大利亚。 1.4 实验方法1.4.1 实验动物分组与处理 Wistar大鼠45只，按体重随机取15只作为正常对照组（control），常规饲养；另外30只大鼠喂饲高糖脂饲料，每2周监测血脂水平，确认血脂明显升高后（约6周），按照30 mg/kg剂量一次性腹腔注射（i.p.）STZ（以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释，pH 4.5，4配制，随配随用），control大鼠i.p

20、.同体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。72 h后，测定血糖，以禁食12 h血糖 7.8 mmol/L为是糖尿病模型成功标准，24只动物血糖合格，按血糖水平随机分为2型糖尿病心肌病模型组（T2DC）、卡托普利45 mg/kg治疗组（T2DC+Cap），每组12只。药物以0.5% 羧甲基纤维素钠（CMC-Na）混悬，灌胃给药开始于注射STZ 72 h后，给药容量为1 ml/100 g体重，每日一次。Control组和T2DC模型组给相应体积0.5% CMC-Na混悬液，共给药6周。给药期间，control组继续常规饲养，其余2组同前给高糖脂饲料，自由进水，直至实验结束（共12周）。1.4.2 心功能测定

21、 容积阻抗法测定心输出量：给药结束后（第13周），大鼠禁食12 h，称重，按照35 mg/kg剂量i.p.戊巴比妥钠溶液麻醉，仰位固定。将Biopac System MP150生物采集器的心电图和心排量针式电极按照说明插入大鼠四肢皮下，固定阻抗电极间距离，将听诊器固定于大鼠心脏二尖瓣搏动最强处，实时采集心电图、容积阻抗图和心音图，测心率和每搏输出量，计算得到心输出量（cardiac output，CO）。左心室插管法测定左心室血流动力学指标：心输出量测定完毕，分离右颈总动脉，将20G静脉留置针经颈总动脉插管至左心室，采集左心室收缩压（left ventricular systolic pres

22、sure，LVSP）、左心室舒张末期压力（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）和左心室最大收缩/舒张速率（the maximum rate of myocardial contraction and the maximum rate of myocardial diastole，dp/dt max）。1.4.3 左心室前壁和室间隔厚度测量 沿大鼠心脏左心室赤道面横切，取适量心肌组织，加10倍量福尔马林固定，石蜡包埋，切片（厚度4 m），常规HE染色。显微镜下观察左心室形态，用Image-ProPlus 5.0专业图像分析软件测定左心室前壁

23、厚度（left ventricular wall thickness，LVWT）和室间隔厚度（interventricular septal thickness，IST）。每组3只动物，每只动物观察2张切片，取平均值。1.4.4 生化法测定血糖、血脂和心肌组织游离脂肪酸 心脏功能测定完毕，颈总动脉取空腹血（肝素抗凝），3000 r/min，离心15 min，分离血浆，按试剂盒说明测定空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）、HbA1c、TC和TG。留取适量同部位心脏组织，预冷生理盐水充分洗净，加生理盐水冰上制作10%匀浆，3500 r/min，离心10 min，留取上清

24、，生化法测定心肌组织NEFA。1.4.5 实时定量PCR法测定心肌组织PPAR 和GLUT4 mRNA表达 取适量大鼠左心室组织心尖部分，液氮速冻，-80储存备用。按试剂盒要求，TRIzol法抽提总RNA，转录合成cDNA。合成的cDNA用于实时定量PCR反应，反应条件为GAPDH：95，5min；35个PCR循环（95，10秒；59，15秒；72，20秒；84（收集荧光），5秒）；PPAR ：95，5 min；40个PCR循环（95，10秒；59，15秒；72，20秒；81（收集荧光），5秒）；GLUT4：95，5 min；40个PCR循环（95，10秒；59，15秒；72，20秒；85（收

25、集荧光），5秒）；为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后继续从72缓慢加热到99（每5秒升高1）。各样品的目的基因和管家基因分别进行real-time PCR反应。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。1.4.6 统计学处理 实验数据结果采用表示，用SPSS11.0统计软件分析比较。两组组间、组内比较用t检验；多组比较用单因素方差分析（One-way ANOVA，LSD法）。2. 结果2.1卡托普利对实验性2型糖尿病心肌病大鼠模型血糖、血脂生化指标的影响如表1所示

26、，与正常对照大鼠比较，实验性2型糖尿病心肌病大鼠模型（T2DC）的血糖（FPG、HbA1c）和血脂（TG、TC）指标均显著增加（P 0.01或P 0.001）。卡托普利45 mg/kg灌胃给药6周，仅出现对HbA1c增高的抑制作用，与T2DC组比较，T2DC+Cap组HbA1c值显著降低31%（P 0.01），FPG、TC和TG指标有下降趋势，但未通过统计学检验。表1 卡托普利对实验性2型糖尿病心肌病大鼠模型血糖、血脂生化指标的影响 (s, n=12)Table. 1 Effects of captopril on plasma sugar and lipid levels in experi

27、mental type 2 diabetic cardiomyopathy rat model (s, n=12)组别Groups空腹血糖FPG（mmol/L）糖化血红蛋白HbA1c（A/10 g Prot）总胆固醇TC(mmol/L)甘油三酯TG (mmol/L)正常对照组Control3.60.3*267*1.70.2*0.80.3*2型糖尿病心肌病模型组T2DC18.85.645155.22.61.30.7卡托普利组T2DC+Cap14.08.0318*4.01.81.10.6注：与2型糖尿病心肌病模型组比较，* P 0.01, * P 0.001Note: Compared with

28、the T2DC group, * P 0.01, * P 0.0012.2卡托普利对实验性2型糖尿病心肌病大鼠模型心功能的影响如表2所示，T2DC大鼠模型心脏出现收缩和舒张功能损伤，与control大鼠比较，LVSP、+dp/dtmax以及LVEDP和-dp/dtmax的绝对值均显著下降（P 0.01，P 0.05，P 0.001，P 0.01），同时CO显著降低36%（P 0.05）；与T2DC大鼠模型比较，T2DC+Cap组动物LVSP、+dp/dtmax水平以及-dp/dtmax绝对值分别升高15%、77%和52%（P 0.05或P 0.01），CO值增加54%（P 0.05）。表2

29、卡托普利对实验性2型糖尿病心肌病大鼠模型心功能的影响 (s, n=12)Table. 2 Effects of captopril on cardiac function in experimental type 2 diabetic cardiomyopathy rat model (s, n=12)组别Groups左心室收缩压LVSP(mmHg)左心室舒张末期压力绝对值LVEDP(mmHg)左心室最大收缩速率+dp/dt max(mmHg/s)左心室最大舒张速率绝对值-dp/dt max(mmHg/s)心输出量CO (mL/min)正常对照组Control15018*11.66.8*111

30、902285*87781698*154*2型糖尿病心肌病模型组T2DC123166.42.0613016335478175593卡托普利组T2DC+Cap14212*6.41.7108742898*83682518*157*注：与2型糖尿病心肌病模型组比较，* P 0.05, * P 0.01, * P 0.001Note: Compared with the T2DC group, * P 0.05, * P 0.01, * P 0.0012.3卡托普利对实验性2型糖尿病心肌病大鼠模型心脏结构的影响 如表3所示，与control大鼠比较，T2DC大鼠IST和LVWT显著增加（P 0.001和

31、P 0.05），心室壁肥厚出现。Captopril治疗后，模型动物IST显著降低40%（P 0.001）；同时LVWT降低6%，但未见明显差异。表3卡托普利对实验性2型糖尿病心肌病大鼠模型心脏结构的影响(s, n=12)Table. 3 Effects of captopril on interventricular septal thickness and left ventricular wall thickness in experimental type 2 diabetic cardiomyopathy rat model (s, n=12)组别Groups心室间隔厚度IST (mm)左心室前壁厚度LVWT (mm)正常对照组Control1.040.11*2.300.42*2型糖尿病心肌病模型组T2DC1.860.143.061.11卡托普利组T2DC+Cap1.100.46*2.860.56注：与2型糖尿病心肌病模型组比较，* P 0.05, * P 0.001Note: Compared with the T2DC group, * P 0.05, * P