基于痛觉通路及其分子机制的慢性疼痛基因治疗策略.docx

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基于痛觉通路及其分子机制的慢性疼痛基因治疗策略

基于痛觉通路及其分子机制的慢性疼痛基因治疗策略

第二军医大学东方肝胆外科医院麻醉科

董刚俞卫锋殷正丰

摘要慢性疼痛是一种疾病状态，需要同原发疾病一起治疗，而基因治疗有望成为慢性疼痛更好的治疗手段。

实施基因治疗时要根据参与痛觉传导和调制通路的组织、分子选择相应的载体系统将治疗基因导入靶细胞，以达到治疗目的。

关键词痛觉通路；慢性疼痛；基因治疗

疼痛很常见，通常的（急性）疼痛是一种正常的平衡和保护机制，使得机体减少或避免受到伤害；但它也可能持续存在，成为一种神经系统的疾病状态即慢性疼痛[1]。

实际上，自然界不存在自发控制持续性疼痛的有效机制，所以很明显，慢性疼痛对机体是有害的，应该与原发性疾病一起治疗[2]。

目前我们对疼痛信号从外周到中枢的神经传导通路、其中的参与分子等方面都有了更多了解，但慢性疼痛的治疗却没有太大进展。

临床治疗中常用的镇痛药主要有通过抑制环氧酶途径阻断前列腺素合成的非甾体类解热镇痛药和直接激活阿片受体的麻醉性镇痛药[3]。

由于前列腺素和阿片受体在人体内分布广泛，所以此类镇痛方式必然会引起一系列较严重的不良反应。

另外，对于某些慢性疼痛，特别是神经病理性疼痛的治疗仍然很困难。

在这种情况下，基因基础上的治疗方法[4]1：

在原位产生治疗性蛋白2：

或是相反，对疼痛诱导产生的蛋白的抑制，可能成为慢性疼痛更好的治疗手段。

很明显，疼痛加工信号的哪个水平（疼痛信号的产生、传递、调制或是最终导致疼痛感受的整合）是基因治疗干预的最佳选择、哪些分子可以作为治疗靶位以及如何选择合适的载体将治疗基因靶向性的转移到治疗部位，是慢性疼痛基因治疗进一步获得发展前需要回答的关键问题。

1．痛觉通路[5]上可供选择的基因治疗靶点

当各种伤害性刺激激活伤害感受器时，初级神经元将转化后的疼痛信号传递到脊髓背角，其末梢与那里的次级神经元形成突触，通过释放谷氨酸盐和肽类激活这些神经元。

传递痛觉的次级神经元轴突交叉到对侧象限后上行，末端中止于脑干及丘脑内的神经元。

然后这些神经元再投射到介导疼痛感受不同方面的各个皮层区。

同时，痛觉的传导和加工也受到上位中枢的有效控制。

中脑导水管周围灰质－延髓头端腹内侧区－脊髓背角被认为是疼痛传递主要的调控通路。

了解疼痛传输、调制过程中涉及的外周和中枢神经系统的神经化学和神经解剖学，将帮助确定可能的止痛靶点。

1．1伤害性感受器[1][6]上可以选择的基因治疗靶点[2]

伤害性感受器是那些胞体存在于背根神经节和三叉神经节中，感受和传递伤害性冲动的初级感觉神经元的外周部分，它们在形态学上是初级感觉神经元的神经末梢，广泛分布于皮肤、肌肉、关节和内脏器官中，其中80%为多型伤害性感受器，即该感受器可感受多种刺激，如热、机械及化学性刺激，并可将这些伤害性信息换能为动作电位后传递给中枢[7]。

伤害感受器上产生和传导疼痛信息的特异性细胞受体、离子通道和次级信使系统，都是潜在的基因治疗靶点。

（图1）

辣椒素受体（TRPV1）

TRPV1是伤害性感受器上的配体门控的非选择性阳离子通道，可以被热刺激或辣椒素激活，是热诱发疼痛发生过程的关键分子，也参与了痛觉过敏的产生（如H＋和前列腺素E2可以调制其活动）。

H＋及其受体

局部组织酸中毒的程度与疼痛或不适明显相关。

H+至少可以激活外周神经末端的两个受体，TRPV1通道和ASIC（酸敏感离子通道）。

质子对TRPV1的功能主要有两种影响：

当细胞外PH值低于6时，在室温下就可以激活TRPV1；在PH值6-8之间时可以加强对辣椒素或热的反应，这与各种类型的组织损伤引起的局部酸中毒的幅度相一致。

ASIC作为机械性刺激感受器的钠通道家族的成员，也对局部酸中毒有反应，并且此通道是特异性或优先表达在神经系统上的。

前列腺素合酶途径

炎症和组织损伤时转录因子NF-κB被IL-1β激活，导致外周组织、外周神经元及中枢神经系统中磷脂酶A2和前列腺素合酶（COX2）表达的明显上升，激活了前列腺素系统，膜磷脂最终被转变为不同的前列腺素物质，作用于前列腺素受体后引起发热和疼痛，并导致外周敏化。

针对于这一系统可能的基因治疗靶点包括COX2、IL-1β、磷脂酶A2和外周的前列腺素受体。

细胞因子及其受体

在炎症过程中有多种细胞因子释放，其中一些细胞因子直接的或通过促进其他介质（例如前列腺素）释放间接的刺激伤害感受器，使感觉神经末梢敏感化。

炎症发生后，细胞因子（如IL-1β,IL-6,IL-8,TNF-a）能维持非免疫细胞的活性，使慢性炎症持续下去，所以它们可能是连接各种病理状态与疼痛的重要环节。

另外有些细胞因子具有免疫和神经调节的作用，例如已证明IL-2在外周和中枢神经系统具有镇痛作用。

这些细胞因子及其受体也代表了持续性疼痛基因治疗的潜在靶点。

特异性钠通道

电压门控性钠通道在初级感觉神经元的活化过程中起重要作用。

外周伤害感受器通过对河豚毒素不敏感的特异性的钠电流（TTX-RINa）形成的动作电压来传递信息，承担这一电流的钠通道（Nav1.8/1.9）只在感觉神经元上表达，所以这些通道作为治疗靶点时副作用会较小。

其他可能的基因治疗靶点包括大麻受体，酪氨酸激酶受体（TrkA）、缓激肽（B2）G蛋白耦联的受体、腺苷（A2）受体及嘌呤能受体（P2X3）等。

这些伤害性感受器上大量甚至是特异性表达的蛋白都可能成为慢性疼痛基因治疗的潜在靶点。

1.2初级感觉神经元与基因治疗靶位

初级感觉神经元的细胞体位于背根神经节，轴突离开胞体后分成两支,一支（周围突）至周围的伤害感受器，另一支（中枢突）将疼痛信号从外周传递到脊髓背角，并在那里与次级神经元形成第一个中枢性突触联系[8]。

初级感觉神经元含有兴奋性氨基酸（谷氨酸和天门冬氨酸）和P物质（SP）、降钙素基因相关肽等多种神经肽，也表达神经生长因子高亲和力受体TrKA和特异性ATP受体通道P2X3，共同参与痛觉的神经传递和调制。

损伤或炎症时周围生理环境的改变，可以使初级神经元内神经肽的合成、轴浆运输以及在周围突和中枢突的释放增加，直接使感觉神经末梢敏化。

还有一些初级感觉神经元表达脑啡肽前体及其主要的衍生物[Met5]脑啡肽。

炎症时阿片肽受体向周围突的运输增加，这可能是机体生理性的止痛系统[2]。

所以初级神经元（包括外周或是脊髓处的末梢）可以成为基因治疗的靶位，不仅是因为它们是疼痛信号传递的第一步，还因为在这一水平有多种潜在的可作为靶点的分子。

1.3作用于脊髓水平的策略――以初级感觉传入神经纤维中枢突、次级感觉神经元、中间神经元及高位中枢的下行性调制通路（图2）为靶位

初级感觉神经纤维中枢突与次级感觉神经元在脊髓背角形成它们的第一个中枢性突触。

在突触前膜上有大量的受体系统：

兴奋性氨基酸受体（NMDA）、电压门控性钙通道和嘌呤能受体与相应配体结合后可以通过增加递质的释放增强信息传递；而α2－肾上腺素能、五羟色胺能、阿片和GABA能受体可以通过减少递质的释放抑制疼痛传递。

现在发现环氧合酶产物PGE2很可能也存在于脊髓中，可以与伤害感受器中枢突上的受体相互作用[1]。

背角次级感觉神经元上拥有多种神经递质受体，其中的一些受体可以使次级神经元去极化，增加伤害性疼痛的传递，这包括NMDA和谷氨酸受体（mGluR），以及SP的受体神经激肽-1。

另一些受体的激活导致突触后神经元超级化，因而可以抑制疼痛刺激的传递，这些受体包括阿片受体，GABAA受体和5-HT受体[1]。

除了形成疼痛传递突触的神经元外，脊髓内还存在有几种抑制性的中间神经元。

阿片能中间神经元释放的脑啡肽通过作用于初级传入神经纤维和次级感觉神经元突触前和突触后的阿片受体，抑制疼痛神经递质的释放和疼痛的传递。

含有GABA的中间神经元是另一个重要的抑制系统，通过GABA受体发挥作用。

主要起源于脑干的脊髓下行通路，在脊髓水平调制和处理疼痛信号过程中起着复杂和重要的作用。

五羟色胺能、去甲肾上腺素能、多巴胺能系统是主要的下行抑制通路，它们通过以下途径起作用：

1.突触前抑制疼痛递质从初级传入神经的释放2.突触后调制抑制性或兴奋性脊髓中间神经元，和/或3.在突触后抑制将疼痛信息传递到脊髓上结构的次级背角神经元[9]。

另外，脊髓背角的胶质细胞同免疫细胞一样，可以被各种引起痛觉过敏的因素激活，合成和释放的细胞因子以及谷氨酸、前列腺素类化合物等，可以直接刺激初级和次级感觉神经元，与慢性炎症性和病理性疼痛密切相关[10]。

毫无疑问脊髓是疼痛信息综合处理的一个主要部位，这些细胞表面受体和细胞内表达、释放的生物活性物质都可能成为基因治疗的潜在靶点，因而是脊髓另一个可用于慢性疼痛治疗的靶位。

1.4脑结构[2]

来自脊髓的疼痛信息传递的上行通路的神经解剖学特别复杂，单突触和多突触投射参与了疼痛信号向大脑皮层的传递。

皮层结构，视丘核团，中脑导水管区，孤束核，脑干核团，是疼痛信息处理的主要区域。

对于涉及这一过程的神经递质和其他分子的了解还需更进一步。

综上所述，从外周到脊髓水平的神经传导、调制通路上的受体和参与分子都可能作为基因治疗的潜在靶点。

在确定了目标靶点及其所依托的不同组织和细胞（靶位）后，还需要结合载体的特点选择合适的转运系统，将目的基因导入相应的靶细胞。

2.慢性疼痛基因治疗中常用载体的特点

目前使用的基因治疗载体系统主要分为非病毒载体系统（例如裸DNA）和病毒载体系统。

由于非病毒载体介导的转染基因普遍表达短暂，不能达到有效的治疗目的，所以目前基因治疗临床试验中采用的载体大多数为病毒载体。

病毒载体主要包括①逆转录病毒（RV）②腺相关病毒（AAV）③单纯疱疹病毒（HSV）和④腺病毒（AD）载体，

由于RV和AAV可以整合到宿主细胞基因组中，可能引起人类基因的改变，所以也不适合于临床应用[2]。

在慢性疼痛基因治疗的临床前实验中使用最多的是HSV和AD载体。

病毒载体中，HSV载体具有诱人的生物学特性。

初级感觉神经元是HSV的天然靶位，病毒从破损的皮肤黏膜进入体内，在外周上皮细胞内进行几个循环的复制和繁殖后进入感觉或自主神经末梢，沿神经轴索逆行移动至神经节的感觉神经细胞体内停留下来。

HSV进入细胞核内仍然保持游离状态，而不整合到宿主基因组中，治疗基因可以在神经元内长期稳定表达。

[11]经改造后的复制缺陷性HSV对正常细胞的代谢没有或只有轻微的影响。

根据靶位组织的不同，可以通过摩擦皮肤或角膜（三叉神经节）来感染相应的神经节，应用方便。

另外HSV载体还有感染效率高，外源基因插入容量大（约40kb）等优点[12]。

还有一种常用的病毒载体是腺病毒载体。

人类是腺病毒的天然宿主，感染细胞时病毒DNA不整合到宿主染色体上,不存在激活致癌基因或插入突变等危险，所以比较安全；当腺病毒载体系统以人类细胞为宿主时，大多数人类蛋白都可获得高水平表达并且具有完全的功能。

复制缺陷性腺病毒可能是神经系统基因治疗中较有前途的载体系统[13]。

另外腺病毒载体可以将治疗基因带入多种细胞，如神经元、神经胶质细胞、室管膜细胞和脑脊膜细胞，并能产生足够量的活性蛋白。

通过腰椎穿刺给予腺病毒时，向上位脊髓扩散的范围有限，这可能与脑脊液的循行特点有关。

而通过增加注射剂量或采取足高头低位可能改善其分布。

在脑室内注射的腺病毒会沿着覆盖在脑和脊髓上的整个脑脊膜分布[14]。

3.载体的选择及慢性疼痛基因治疗的方式

综合上述内容可以发现，目前并没有某种载体适合于所有的基因治疗，实际上这些病毒的生物学特性提示，不同的基因转移方案需要使用不同的病毒载体，这取决于目标靶位（靶细胞类型是否容易转染），转移基因的大小，以及是否需要将外源基因整合入宿主细胞基因组等[15]。

对于治疗基因转移来说，外周组织比神经元细胞更容易接近，特别是伤害性感受器上的受体和通道，可以成为慢性疼痛外周水平治疗干预的相关靶位。

针对外周组织的基因治疗研究中使用过的载体或方式包括：

通过HSV和腺病毒载体携带治疗基因及基因枪转移（裸DNA）[2]等。

由于具有嗜神经性，当以外周神经系统特别是初级感觉神经元为特异性的靶位时，HSV改造后的载体是最合适的病毒载体。

应用重组HSV载体将治疗基因转入初级神经元内表达，产物将在囊泡内运输并被释放到突触间隙，作用于突触前或突触后受体[16]。

例如编码阿片肽的基因转入初级传入神经纤维后，表达产物可以作用于初级传入神经元中枢突突触前或周围突的阿片受体，缓解实验性痛觉过敏[15]。

另一种方法是利用HSV载体将反义DNA序列转入细胞体（即反义寡核苷酸或RNA干扰技术），通过减少疼痛相关肽的合成和释放来减轻痛觉。

例如将携带降钙素基因相关肽前体反义cDNA的HSV载体导入细胞后，发现可以逆转神经纤维的痛觉过敏[17]。

在脊髓水平或脊髓上中枢，腺病毒载体比较有吸引力。

Finegold等将β－内啡肽编码序列接入腺病毒载体后，直接注射到鼠蛛网膜下间隙，结果发现重组载体停留在软脑膜细胞中表达，脑脊液中β－内啡肽的浓度明显增加，且具有实验性抗痛觉过敏作用[18]。

直接将携带治疗基因的重组载体注射到脊髓内可能导致严重的脊髓损伤，因此此类方式仅限于动物实验，并不适合人类的基因治疗。

结语

目前在慢性疼痛领域公布的不断增加的试验数据使我们相信，随着疼痛机理和转运载体系统研究的不断进展，基因治疗的临床试验将在不远的未来实现。

基因治疗将会成为新的治疗手段，有望提高慢性疼痛患者的生活质量。

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图1.伤害感受器转化痛觉信息的机制和参与的分子.

缩写:

PAF：

TNF-α，肿瘤坏死因子-α;TTX-R：

对河豚毒素不敏感;PKA：

蛋白激酶A;

PKC：

蛋白激酶C;GIRK,G-蛋白耦联内向整合K+;ASIC：

酸敏感离子通道;NGF,神经生长因子;LIF,白血病抑制因子；IL-6,白介素-6

图2.脊髓内感觉处理过程中所涉及的神经化学示意图