BD FACSCalibur中文操作手册CellQuest软件.docx
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BDFACSCalibur中文操作手册CellQuest软件
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BDFACSCalibur中文培训手册
第五章CellQuest软件
学习本章后应能够:
用CellQuest从流式细胞仪获取3色或4色样本
用CellQuest从流式细胞仪分析3色或4色样本
将统计结果输出为电子表格
应用Region（区）和Gate（门）生成统计
获取和分析3色免洗绝对记数样本
5.1概述
CellQuest是从流式细胞仪上进行获取和分析数据的通用软件。
CellQuest软件功能强大且灵活，并与Macintosh的多任务环境完全兼容。
也可通过CellQuest调节仪器条件，设定获取最佳条件并可将其储存。
5.1.1获取
即收集并储存流式细胞仪上数据的过程。
在获取前，需用您的样本来优化仪器的条件。
5.1.2分析
将获取的数据进行进一步分析。
在分析时，将读取数据文件，然后可画Region（区）、设置marker（标尺）和进行统计。
在CellQuest中，可画单参数直方图、双参数点图、密度图和等高图。
5.1.3从获取到分析
在CellQuest中，从获取到分析的功能允许在数据获取结束后可从获取图转换到分析图。
刚刚获取的数据及在获取时限定的格式出现在图中，如region,marker,color等。
5.2工具板
工具栏可用来画图、region,marker和文字等。
点击选择。
5.2.1工具板按钮（见图1）
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1.等高图:
点击，可画等高图，可自定义图的大小。
2.选择:
点击，可选择一个或多个目标，进行改大小或移动。
3.3维图:
点击，可画3维图，可自定义图的大小。
4.直方图:
点击，可画直方图，可自定义图的大小。
5.密度图:
点击，可画密度图，可自定义图的大小。
6.点图:
点击，可画点图，可自定义图的大小。
7.直方图marker:
点击，可在直方图上定位marker的左边界和右边界。
8.象限marker:
点击，可在点图、密度图和等高图上定位marker。
9.缩小:
点击，然后点击图，将放大图缩小到原大小。
10.放大:
点击，然后点击图，将缩小图放大到原大小。
11.矩形region:
点击，然后在点图、密度图和等高图中点击，然后拖动对角线至所需
大小。
12.多边形region:
点击，然后在点图、密度图和等高图中点击形成起始点，然后拖动鼠
标画出多边形顶点并在起始点处点击完成多边形region。
13.直方图region:
点击，可在直方图上定位region的左边界和右边界14.椭圆形region:
点击，然后在点图、密度图和等高图中点击，然后拖动对角线至所需
大小。
15.箭头:
点击，然后在实验文件中点击，拖出直线。
16.文本:
点击，然后点击定位插入点并编辑文字。
17.计算器:
如果自动复计算关闭，点击进行数据复计算。
5.3CellQuest的文件:
FCSlistmode数据文件:
是流式细胞仪的标准格式数据文件（FCS2.0）。
当AqusitionControl窗口的Setup前未打，时，进行获取后自动保存的文件格式。
该文件含有从流式细胞仪获取的平均2000-10000个颗粒数的数据。
一个含有4参数10000细胞数的数据文件若256道分辨率则文件大小为45kb，若1024道分辨率则文件大小为85kb。
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CellQuest实验文件:
您设置的图、region、gate、统计（statistics）、markers、文字、颜色等都将保存。
数据文件不在实验文件中保存。
CellQuest实验文件的菜单由File菜单下New、open、close、save及saveas等（同MicrosoftWord）。
注意:
实验文件和它的数据文件之间存在一定限制。
若数据文件未改变目录或被删除，实验文件可找到其数据文件。
若二者联系丧失，需将丢失的数据文件放在其实验文件同一目录，实验文件才能找到其数据文件。
若实验文件的目录改变，二者的联系不会改变，实验文件仍可找到其数据文件。
实验文件可以后打开以恢复获取和分析。
实验文件可以通用模板储存以用于常规获取和分析。
除数据文件外所有条件（包括region、gate、statistics）都可以通用模板储存。
实验文件可转化为文具薄。
在实验文件中，有3种图:
获取、分析和获取到分析。
一个实验文件可含上述3种图的组合，但获取图不能用来分析，分析图不能用来获取。
5.4CellQuest的仪器控制:
在数据收集之前，需用样本优化仪器条件。
在优化之前需运行FACSComp.。
需为每一组样本选择适当的对照，如:
判断非特异性结合的同型对照。
在CellQuest软件中，仪器的控制菜单位于Cytometer菜单中。
在用CellQuest进行3色或4色分析中，应用同型对照和调补偿用对照进行仪器条件设置。
同型对照包括下列试剂:
小鼠IgG1-FITC/小鼠IgG1-PE/小鼠IgG1-PerCP/小鼠IgG1-APC。
它将用于调节FSC、SSC、FSC阈值、设淋巴细胞region、确认FL1/FL2/FL3/FL4的设置及象限设置。
调补偿用对照包括单阳性荧光试剂和同型对照试剂，如:
调FITC补偿对照包括下列试剂:
CD3,FITC/小鼠IgG1-PE/小鼠IgG1-PerCP/小鼠IgG1-APC。
调节探测器和放大器可使所需信号出现在数据图的适当位置。
颗粒通过激光束时产生光信号，然后转换成电信号，并在点图上相对应于一个道值。
依据所选的分辨率的不同，道值有从0,255、0,1023不同范围。
探测器:
在流式细胞仪中有二种探测器:
光电二极管和光电倍增管（PMTs）。
光电二极管对光的敏感度低于光电倍增管。
光电二极管用于探测FSC，因为FSC是强信号。
可通过电压而选择对FSC信号的不同放大。
（见图2）
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0E00:
将信号放大1（10）倍。
1E01:
将信号放大10（10）倍。
2E02:
将信号放大100（10）倍。
3E03:
将信号放大1000（10）倍。
-1E-1:
将信号放大0.1（10）倍。
光电倍增管（PMTs）用于探测SSC、FL1、FL2、FL3,因为它们是弱信号。
PMTs的电压调节从150,999。
当电压上升时，信号增加，数据出现在道值较高处。
可通过点击,,来选择或直接拖动滑标上下移动。
（见图2）
放大器:
可对信号进行微调。
对FSC、SSC、FL1、FL2、FL3可设置放大模式和放大增益。
若放大模式选择Lin（线性），放大器的增益可在1,9.99之间调节。
可通过点击,,来选择或直接拖动滑标上下移动（见图2）。
若放大模式选择Log（对数），放大器的增益则不可调节。
对数常用于分开阴性信号和弱阳性信号。
阈值:
可用来设置低于该道值的数据信号不被处理，只有高于或等于阈值道数的信号才传送到计算机进行处理。
每次只能有一个参数设置阈值（FSC、SSC、FL1、FL2、FL3）。
在免疫表型中，在FSC上设阈值。
在DNA分析中，在FL2上设阈值。
可通过点击,,来选择或直接拖动滑标上下移动（见图3）。
新版的CellQuest软件有双重阈值设定。
补偿:
当样本用2色或3色荧光染色时需调节补偿以消除光谱重叠。
因为荧光素发射一定波段的荧光，因此在探测某种特定荧光素的探测器上有来源于另一种荧光素的荧光信号。
FITC主要出现在FL1探测器上，但也有部分重叠到FL2探测器上。
PE主要出现在FL2探测器上，但也有部分重叠到FL1和FL3探测器上。
补偿调节如下:
FL2,,FL1:
从FL2探测器上减去重叠的FL1
FL1,,FL2:
从FL1探测器上减去重叠的FL2
FL3,,FL2:
从FL3探测器上减去重叠的FL2
FL2,,FL3:
从FL2探测器上减去重叠的FL3
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补偿调节量依赖于探测器的电压。
当补偿过后的群体与阴性群体一致时，补偿调节正确。
补偿调节可通过点击,,来选择或直接拖动滑标上下移动。
（见图4）
状态:
用来在获取的任何时候查看流式细胞仪的运行状态，以利解决仪器运行中出现的问题。
在菜单位于Cytometer菜单中（见图5）。
测试脉冲:
在FACSCalibur中可从status菜单中选择FSC（仅FSC探测器上产生的信号）或
ALL（所有探测器上产生的信号）或OFF。
状态:
显示仪器运行模式
NotReady:
激光器正在预热、鞘液桶空、废液桶满
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Ready:
样本管插在SIP上且支撑臂位于中位（即管下），样本管加压，仪器在RUN
状态
Standby:
仪器在Standby状态或仪器在Run状态而无样本管在SIP上或支撑臂位
于侧位（即不在管下）或样本管未完全加压。
Standby时仪器的激光器电源
降低。
激光器电源:
以mW表示，在RUN时，为15mW;在Standby时，为3,6mW。
激光器电流:
显示激光器电流值，当高于某值时，在显示屏上会出现提示信息
样本电压:
显示样本压力和鞘液压力之间的差异。
当插上样本管于SIP时，样本压力和鞘
液压力之间的差异增加，该样本电压降低。
鞘液:
显示鞘液桶是空或OK。
废液:
显示废液桶是满或OK。
5.5CellQuest的视图
在实验文件中，可画图和作统计图。
它们在显示上有三种形式（见图6）:
激活:
外框呈灰色。
点击除框以外的任何地方即可激活。
每次只能激活一个图。
任何命令
只针对此激活的图。
被选择:
在每个角出现黑色方块。
点击图框即可选择该图。
一次可选择多个图。
任何命令可
影响被选择的图。
可通过下列2种方式选择多个图:
揿Shift键同时点击多个图框或
在实验文件中点击任何对角线拖框包绕欲选的图。
若需全选，可从Edit菜单中选择
selectall。
只要被选图才可以更改大小、删除和移动。
去选择:
图框的每个角无黑色方块。
点击图外的任何地方即可去选择。
去选择的图不受任何
命令影响。
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5.6练习:
3色或4色数据获取
在此练习中，您将:
用FACSComp软件进行仪器质控。
在CellQuest中用样本细胞进行优化。
?
编辑试剂目录及组合，以便在获取时使用。
在获取中，设定数据收集和储存。
获取和分析下列样本:
小鼠IgG1-FITC/小鼠IgG1-PE/CD45-PerCP/小鼠IgG1-APC。
CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC。
CD3-FITC/CD16，CD56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC。
建立模板
输出统计结果
5.6.1质控,运行FACSComp
在此练习中，您将用FACSComp软件进行仪器质控。
3色:
用FACSComp进行PMTs设置、补偿调节、敏感度测试。
4色:
用FACSComp进行PMTs设置、时间延迟校准、补偿调节、敏感度测试。
在进行3色或4色获取时依下列程序进行:
1.先开仪器后开计算机，以确保仪器和计算机之间的正常通讯。
2.准备运行FACScomp用的标准微球
3色:
管,1:
1ml鞘液中加一滴未标记的标准微球
管,2:
3ml鞘液中各加一滴未标记的标准微球、FITC,、PE,、PerCP-标记
的标准微球
4色:
管,1:
1ml鞘液中各加一滴未标记的、APC,标记的标准微球
管,2:
3ml鞘液中各加一滴未标记的标准微球、FITC,、PE,、PerCP-、
APC,标记的标准微球
3.启动FACScomp:
从苹果菜单中选择FACScomp
4.在Signin窗口中输入必要信息后点击Accept
5.选择Lyse-Wash设置，在Setup窗口中输入必要信息（如标准微球的ID号）后点击Accept。
6.运行FACScomp:
依据图条下方的提示框内的信息进行。
3色:
将用FACSComp进行PMTs设置、补偿调节、敏感度测试。
4色:
将用FACSComp进行PMTs设置、时间延迟校准、补偿调节、敏感度测试。
由于不同激光束在空间位置上的分离而导致一个颗粒在不同的时间产生信号。
如图7所示。
一个细胞首先通过红色激光束，几微秒后通过蓝色激光束。
红色激发信号（FL4）需延迟后才能与蓝色激发信号（FSC、SSC、FL1、FL2、FL3）同时到达电子分析部分。
FL3和FL4经不同PMTs探测。
时间延迟校准电子部件决定了细胞通过二个激光束之间需多少时间。
若该时间在既定的标准范围内（19us+2）,时间延迟将设置等于该时间，从而成功校准，因此使一个颗粒产生的所有脉冲信号同时到达电子分析部分并一起处理。
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7.当FACSComp运行结束后，移去标准微球管并插上双蒸水管。
8.退出FACSComp。
当打印对话框出现时，点击OK。
将打印一份总结报告。
5.6.2优化:
在此练习中，您将:
建立CellQuest实验文件。
调节FSC、SSC探测器和FSC阈值
画淋巴细胞门
调节荧光补偿
FACSComp用标准微球调节仪器设置之后需用样本优化仪器设置。
上述优化步骤不仅适用于溶解的全血细胞，而且适用于任何感兴趣的细胞。
必须记住按上述步骤次序进行。
为按上述步骤进行优化，需准备下列样本:
小鼠IgG1-FITC/小鼠IgG1-PE/小鼠IgG1-PerCP/小鼠IgG1-APC。
CD3-FITC/小鼠IgG1-PE/小鼠IgG1-PerCP/小鼠IgG1-APC。
小鼠IgG1-FITC/CD8-PE/小鼠IgG1-PerCP/小鼠IgG1-APC。
小鼠IgG1-FITC/小鼠IgG1-PE/CD45-PerCP/小鼠IgG1-APC。
小鼠IgG1-FITC/小鼠IgG1-PE/小鼠IgG1-PerCP/CD4-APC。
1.先开仪器后开计算机，以确保仪器和计算机之间的正常通讯。
2.启动CellQuest软件
3.点击实验文件的右上角的放大钮，将实验文件窗口放大。
4.从File菜单中选择Documentsize:
出现文件大小对话框。
5.点击黑矩形右边的矩形，点击OK。
将文件增至二页。
6.从工具板中选择点图:
点击工具板中点图图标。
7.在实验文件的空白区点击，然后拖动对角线至所需大小。
出现点图对话框。
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8.点击Plotsource（点图来源）,选择aqusition（获取）。
9.X和Y轴默认FSC、SSC
10.在颜色框中点击MulticolorGating.。
门内颗粒将出现颜色。
11.点击OK。
出现FSC/SSC点图。
12.从Acquire菜单中选择ConnecttoCytometer。
出现AcqusitionControl对话框。
将其拖至空白区。
13.从Cytometer菜单中选择Detectors/Amps。
出现Detectors/Amps窗口。
将其拖至空白区。
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14.从Cytometer菜单中选择Threshold。
出现Threshold窗口。
将其拖至空白区。
5（6（3调出储存的由FACSComp生成的仪器条件
1（从Cytometer菜单中选择InstrumentSettings，出现对话框
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2（点击Open，选择目录及文件（如:
BDFiles\CalibFile），点击Open
3（点击Set、点击Done。
5（6（4调节FSC/SSC探测器（电压）及FSC阈值
在FSC/SSC点图上调节FSC放大器增益和SSC电压是为了将所感兴趣的细胞显示在图中。
调节FSC阈值是为了去除碎片和噪音。
所有样本管都可用来调节，一般用同型对照管来调。
1（使仪器处于RUN，插上同型对照管
2（点击AcqusitionControl窗口中的Acquire（注意Setup前需打叉，即不储存数据）
3（选择FSC/SSC为LIN（线形放大），将FSC电压置于E00，调节FSC放大器增益;调节
SSC电压;调节FSC阈值，观察图的改变。
5（6（5设置淋巴细胞Region
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该Region在调节荧光探测器时使用。
1（在工具板中选择多边形的Region。
2（在FSC/SSC点图上设淋巴细胞Region，在Region外点击，将R1拖至空白区。
3（移去同型对照管，点击AcqusitionControl窗口中的Pause。
5（6（6调节FL1、FL2、FL3的探测器（电压）
在上同型对照管时，可能需基于门内的淋巴细胞调节FL1、FL2、FL3的探测器（电压）。
若必要，将这群细胞调在所有图的左下角。
用于同型对照的抗体为小鼠抗钥孔嘁血蓝素（KLH）。
当用于测定人的细胞时，所发生的结合是非特异结合。
抗体的这种非特异结合现象是由于抗体的Fc端与细胞膜上的Fc受体结合。
这和自发荧光都是背景荧光。
特定抗体Fab端与细胞表面上特定抗原的特异结合所发的荧光为阳性荧光。
若必要，用同型对照管，在所有荧光点图上调节FL1/2/3的电压来调节背景荧光。
1（选择点图
2（在出现的对话框内选择X轴:
FL1，Y轴:
FL2
3（选择G1=R1
4（点击OK，FL1/FL2的点图出现
5（点击FL1/FL2点图的边框并将之拖至FSC/SSC图的右侧
6（同样建立一个FL3/FL2的点图，并选择G1=R1。
如获取4色样本，进行下一步。
如
获取3色样本，跳至第8步。
7（同样建立一个FL3/FL4的点图，并选择G1=R1。
若无FL4参数，请确认
Detector/Amps窗口中Fourcolor前是否选中。
8（在工具板中选择象限标尺,在FL1/FL2点图上以同型对照管的门内细胞画象限,这
些象限指定了阴性/阳性区域。
19（点击FL1/FL2点图，拖动Marker的柄将它设定在10处。
10（从Status窗口选择QuadrantStas（象限统计）。
11（在其余的图上，重复8-10步。
12（插上同型对照管
13（点击AqusitionControl窗口中的Restart。
14（若必要，调节FL1、FL2的电压（在Detector/Amps窗口中），使这群细胞调在
所有图的左下角。
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15（若必要，调节FL3的电压（在Detector/Amps窗口中），使这群细胞调在所有图
的左下角。
注意:
勿调节FL4的PMT电压，其电压值有FACSComp设定。
16（点击AqusitionControl窗口中的Pause。
17（移去同型对照管。
18（关闭Detector/Amps和Threshold窗口
5（6（7调节荧光补偿
优化的最后一步是调节光谱重叠。
若3色样本，必要时需调节FL2-%FL1，FL1-%FL2，FL3-%FL2，FL2-%FL3的补偿。
若4色样本，必要时需也要调节FL3-%FL4，FL4-%FL3。
选择适当的试剂用来调节补偿很重要。
每种荧光素的补偿应用染色最强的细胞群来设置。
如一个Panel中有:
CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-FITC，则FITC的补偿应用CD8-FITC来设置。
补偿的调节依赖于由同型对照管设定的探测器电压。
一旦电压设定，补偿用单阳性管调节。
1（从Cytometer菜单中选择Compensation
2（插上CD3-FITC/小鼠IgG1-PE/小鼠IgG1-PerCP/小鼠IgG1-APC管。
3（点击AqusitionControl窗口中的Restart。
4（若必要，调节FL2-%FL1使FITC+细胞在FL1/FL2点图的右下象限。
5（移去此管，插上小鼠IgG1-FITC/CD8-PE/小鼠IgG1-PerCP/小鼠IgG1-APC管。
6（点击AqusitionControl窗口中的Pause、Restart。
7（若必要，调节FL1-%FL2使PE+细胞在FL1/FL2点图的左上象限。
8（若必要，调节FL3-%FL2使PE+细胞在FL3/FL2点图的左上象限
9（移去此管，插上小鼠IgG1-FITC/小鼠IgG1-PE/CD45-PerCP/小鼠IgG1-APC管。
10（查看FL2-%FL3的补偿，应为0.0%,若必要，调节该补偿。
若作3色，跳至14步。
11（查看FL4-%FL3的补偿，应为0.0%,若必要，调节该补偿。
12（移去此管，插上小鼠IgG1-FITC/小鼠IgG1-PE/小鼠IgG1-PerCP/CD4-APC管。
13（查看FL3-%FL4的补偿，应为0.0%,若必要，调节该补偿。
14（关闭Compensation窗口。
15（点击AqusitionControl窗口中的Pause、Abort。
16（移去样本管，插上双蒸水管。
17（将仪器处于Standby状态。
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5（7实验练习:
3色/4色预获取
在此练习中，您将:
设定Acquisition（获取）和Storage（储存）的条件。
设定文件储存参数
创建试剂组合
5（7（1设置Acquisition&Storage窗口
在此窗口可设定获取和储存的颗粒数及类型。
也可设定储存的参数及其分辨率。
1（从Acquire菜单中选择Acq
升级会员 