基于顺铂抗癌药物的合成及DNA键和性质的研究.docx

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基于顺铂抗癌药物的合成及DNA键和性质的研究

基于顺铂抗癌药物的合成及DNA键合性质的研究

【摘要】癌症是严峻要挟人类健康和生命的常见病和多发病，已经成为人类死亡的第二大病因。

自1967年发觉顺铂具有抗癌活性以来，通过30连年的进展，铂类金属抗癌药物的合成应用和研究取得了迅速的进展。

与此同时，研究药物和DNA的彼此作用是药物发觉和药品研发进程中最重要的课题之一。

G-四链体是富含鸟嘌呤碱基的DNA通过氢键彼此作用形成的四链螺旋结构。

这种结构能够有效的抑制端粒酶的活性，它能够阻碍端粒酶对端粒DNA引物的识别，使细胞正常凋亡，从而达到抗肿瘤的成效，最近几年来，以G-四链体为靶点的抗癌药物研究引发了人们的普遍注意。

本文的工作重点是合成配合物，通过紫外滴定和荧光滴定手腕研究已有钌配合物对G-四链体稳固性、DNA对金属离子的特异性识别。

【关键词】铂（II）配合物，G-四链体，DNA，钌（II）配合物。

ApplicationofBjerrumFunctioninDeterminationofStabilityConstants

【Abstract】Cancerisacommonandfrequently-occurringdiseasesseriouslythreateninghumanhealthandlife,whichhasbecomethesecondlargesthumandeathcause.Sincecisplatinwasfoundhavinganti-canceractivityin1967,after30yearsofdevelopment,thesyntheticapplicationsandresearchofmetalanti-cancerdrugsofplatinumobtainedarapiddevelopment.Atthesametime,theresearchofthereactionbetwwendrugsandDNAisoneofthemostinportantissuesintheprocessofdiscoveryanddevelopmentofdrugs.G-quadruplexisrichinguaninebasesofDNAwhichformedthroughthehydrogenbondinginteractionoftheformationofthefourchainspiralstructure.Thisstructurecaninhibitthetelomeraseactivityeffectively,hindertelomerasetotelomereDNAprimersrecognition,andmakenormalcellapoptosis,soastoachieveantitumorpurpose.Inrecentyears,theG-quadruplextargetcancerdrugresearchhasattractedwidespreadattention.Thispaperisfocusedonthesynthesisofcomplexes,usingtheultraviolettitrationandfluorescencetitrationmethodtostudythestabilityofexistingmetalrutheniumcomplexestoG-quadruplexandDNA'sidentificationtothespecificityofthemetalions.

【Keywords】Pt（II）complexes,G-quadruplex,DNA,Ru（II）complexes

概述

DNA结构

G-四链体与端粒、端粒酶和肿瘤的关系

G-四链体

G-四链体与端粒、端粒酶和肿瘤的关系

配体的合成

铂配合物的合成

不同辅助配体的多吡啶配合物与G-四链体DNA的彼此作用的研究

缓冲溶液的配制

配合物与DNA浓度的确信

配合物与G-四链体彼此作用的紫外——可见光谱滴定

配合物与G-四链体作用的荧光光谱滴定

1引言

金属抗癌药物的进展

1965年Rosenberg偶然发觉顺二氯二氨合铂（cis-[Pt（NH3）2Cl2]，又称顺铂）对大肠杆菌的割裂有抑制作用，并于1969年第一次报导了顺铂具有很强的抗癌活性。

1975年顺铂成为第一个用于临床的金属配合物抗癌药物。

从此以后，金属药物及其抗肿瘤机理成为人们关注的研究热点。

可是顺铂水溶性差，且仅能注射给药，减缓期短，并伴有严峻的肾、胃肠道毒性、耳毒性及神经毒性，长期利用会产生耐药性。

为此，人们开始展开对其它铂系抗肿瘤药物的研究，但结果并非睬想。

铂系抗肿瘤药物在临床利用上具有毒副作用大和耐药性的问题，促使研究者踊跃寻觅非铂系抗肿瘤药物。

目前非铂系金属抗肿瘤药物研究要紧集中在钌、铑、锡、锗等金属配合物，专门是钌配合物。

作为铂类配合物的对照物，钌配合物很早就被运用于抗肿瘤实验。

与顺铂相较，钌配合物毒性相对较小，在生物体内易于吸收，也易于代谢而且钌配合物有在肿瘤组织中发生聚集的特点，能够与DNA分子以共价键或非共价键（静电结合、沟面结合和插入结合）方式缔合。

从上世纪八十年代以来，钌配合物作为抗肿瘤药物的研究已经成为药物化学、化学生物学、配位化学和生物无机化学的热点研究领域之一。

金属铂抗癌药物的进展

自1967年美国密执安州立大学教授RosenbergB.和CampV.发觉顺铂具有抗癌活性以来，通过30连年的进展，铂类金属抗癌药物的合成应用和研究取得了迅速的进展。

顺铂、卡铂的开发成功和临床应用给癌症的医治带来了一场新的革命。

有数听说明，DNA链中许多相邻的碱基间两个氮原子距离为340pm，而顺铂中两个氯原子间的距离为330pm，二者恰好匹配，形成的铂化DNA寿命较长且不易被细胞蛋白如高移动组（HMG）蛋白识别并修复，因此将破坏肿瘤细胞DNA的复制，抑制细胞割裂，最终杀死肿瘤细胞。

此刻，顺铂和其他铂化合物已显示出它与病毒、细菌、寄生菌作斗争的潜力。

除此另外，铂化合物也有希望用来诊断一些疾病。

自从顺铂的抗癌活性被发觉以来，铂类抗癌药物的研究和应用取得了迅猛的进展。

现在，顺铂和卡铂已成为癌症化疗中不可缺少的药物。

1995年，世界卫生组织对世界上近百种抗癌药物进行评判，顺铂的疗效、市场等综合评判得分名列前茅。

顺铂和卡铂所取得的成绩极大地鼓舞了各国学者踊跃研究更好、更有效的铂类抗癌新药。

目前铂类配合物的合成已历经三代。

顺铂是第一代铂类抗癌药物（结构如下图），该药的利用局限性是它的耐药性及剂量毒性人体器官尤其是对肾脏的损害较大。

第二代铂类配合物（结构如下图），其中以卡铂为代表（结构如下图），其水溶性优于顺铂，肾毒性低于顺铂，要紧不良反映为骨髓抑制。

第三代铂类代表化合物乐铂（结构如下图），乐铂全称是环丁烷乳酸盐二甲胺合铂（Ⅱ），研究说明，该药的抗肿瘤成效与顺铂、卡铂的作用相当或更好，毒性作用与卡铂相同，且与顺铂无交叉耐药。

图第一代要紧铂类抗癌药物的结构

图第二代要紧铂类抗癌药物的结构

图第三代铂类抗癌药物结构

目前铂类配合物研究的方向是:

寻觅比顺铂和卡铂疗效更好，不良反映更小，药学特性取得改善的化合物、扩大抗癌谱、开发与顺铂和卡铂无交叉耐药性的新型药物。

1.3.1概述

组成生命物质的两类要紧大分子是蛋白质和核酸。

核酸是由许多核苷酸聚合而成的生物大分子化合物，普遍存在于所有动物、植物细胞、微生物内，与蛋白质组成生命物质的两类要紧的大分子。

生物体内核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。

核酸是生物体的重要组成物质，在蛋白质的生物合成上占重要位置，与生物的生长、发育等正常生命活动和癌变、突变等异样生命活动中起决定性的作用。

因此，核酸是现代生物化学、分子生物学和医学的重要基础之一。

衰老和癌变是人类的两大医学难题，二者与端粒和端粒酶有紧密关系。

端粒是真核细胞染色体结尾富含鸟嘌呤的DNA重复序列及一些结合蛋白组成的特殊结构。

端粒除提供非转录DNA的缓冲物之外，还能爱惜染色体结尾免于融合和退化，在染色体定位、复制、爱惜和操纵细胞生长及寿命方面具有重要作用，并与细胞凋亡、细胞转化和永生紧密相关。

在生理状况下，随着细胞割裂次数增加，端粒在复制割裂进程中将慢慢丢失碱基，从而使端粒渐进性缩短。

当端粒缩短至必然长度时细胞将进入生长停止衰老死亡时期，即显现细胞的凋亡。

研究发觉，端粒酶能保证端丽的正常复制。

除胚胎组织、生殖细胞和少数造血肝细胞中具有端粒酶火星外，绝大多数体细胞中无端粒酶活性，可是，85%以上的肿瘤细胞端粒酶表达呈阳性。

因此，以抑制端粒酶活性为目标的肿瘤基因医治研究已成为一种新的药物作用靶点，而且极有希望成为最平安、有效的医治肿瘤的理想途径。

核酸是生物体内的高分子化合物。

单个核苷酸是由碱基、戊糖和磷酸三部份组成的。

依照所含戊糖的不同，核酸可分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两大类。

核苷酸中的碱基分为嘌呤和嘧啶两类。

DNA要紧由含腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）的核苷酸组成。

RNA要紧由含腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U）的核苷酸组成。

1.3.2DNA结构

DNA之因此能含有生物物种的所有遗传信息，是因为其结构超级复杂，每一个人体细胞的DNA约含有100亿个碱基。

DNA分子的结构，有以下三种：

第一，DNA的一级结构。

四种脱氧核糖核酸依照必然的顺序，通过3’-5’-磷酸二酯键连结，由一个核苷酸的戊糖环第3’位羟基与另一个核苷酸的戊糖环第5’位的磷酸以酯键相连，具有必然的方向性。

碱基间遵循碱基互补配对原那么，即腺嘌呤（A）必然与胸腺嘧啶（T）配对，鸟嘌呤（G）必然与胞嘧啶（C）配对。

（如图1-4）因为它是指组成核酸的核苷酸之间连键的性质和排列的顺序，因此DNA的一级结构也被称为DNA碱基序列。

图1-4核酸一级结构模型

第二，DNA的二级结构。

它是指磷酸和碱基依照必然顺序排列时，由于扭转角度和各类碱基排列方式不同而产生各类各样构型的DNA。

DNA双螺旋结构是DNA二级结构的一种重要形式，它是指两条脱氧多核苷酸链反向平行盘绕所形成的双螺旋结构。

由Watson和Crick两位科学家于1953年提出来的一种结构模型。

在不同湿度和盐浓度下，DNA的双螺旋有着不同的构象。

DNA的二级结构分为两大类：

一类是右手螺旋，如A-DNA、B-DNA、C-DNA、D-DNA等；另一类是左手双螺旋，如Z-DNA。

双链DNA的构象与其核苷酸序列和碱基组成有紧密关系。

一样地，含随机的碱基组成和序列的DNA双螺旋分子通常只能形成A、B、C构型；但严峻重复的寡聚核苷酸那么可形成其它的构型，如D、E、Z和P构型。

改变必然的外界环境条件，如温度、相对湿度、盐的浓度和有机溶剂等能够使这些构型进行彼此的转化，而且这些转变从本质上都是改变核酸分子的内在运动来实现的。

图1-5A-DNA、B-DNA和Z-DNA

第三，DNA的三级结构。

它是指DNA中单链与双链、双链之间的彼此作用形成的三链或四链结构，由DNA双螺旋进一步扭曲，包括线状双链中间可能有的扭结和超螺旋、多重螺旋及环状DNA中诸如超螺旋和连环之类的各类拓扑学状态。

在双螺旋DNA的大沟中存在多余的氢键给体和受体，这些氢键给体和受体能够和专一的结合分子（如蛋白质）发生彼此作用，形成专一的复合物，也能够与单链DNA分子结合形成三螺旋DNA。

三螺旋DNA一样是由一条寡核苷酸链通过与双链DNA形成Hoogsteen键或反Hoogsteen键，在其大沟处紧密缠绕而成。

三螺旋DNA的组成结构基元是三碱基体，这些碱基体也具有专一性，具体体此刻T、C、G、A别离要接在AT、GC、GC和AT碱基对上（见图1-6）。

形成三螺旋DNA的第三条链的抗酶括性、水溶性、脂溶性和毒副作用等因素直接阻碍其作为医治药物的可能性。

因此合成能抗核酸酶能力强、水溶性和脂溶性适当、毒副作用小的寡聚核苷酸片段和提高三螺旋DNA稳固性的主链修饰方式仍是目前的研究热点。

图1-6三螺旋DNA结构

G-四链体与端粒、端粒酶和肿瘤的关系

1.4.1G-四链体

G-四链体（G-quadruplex）是一类特殊的DNA二级结构，在基因组中的一些鸟嘌呤富集区域，具有形成这一特殊结构的偏向。

这些区域包括端粒结尾G重复序列，和一些重要基因的启动子区域，因此G-四链体的形成或拆散可能涉及到体内的一些重要生理进程的调控，比如细胞凋亡、细胞增殖、信号转导和肿瘤形成等。

另外，G-四链体结构作为一种特殊的DNA二级结构，与一般双链具有显著的结构不同，能够成为药物选择性识别的靶点。

因此，研发与G-四链体彼此作用的小分子抗癌药物受到了普遍的关注。

四链体结构是由富含GDNA单链，在特定离子强度和pH值条件下，由单链之间或单链内对应的G残基形成Hoogsteen碱基配对，从而使四条或四段富GDNA单链旋聚成一段特殊的DNA二级结构。

由于富GDNA中的G残基都是成串排列的，因此，当四条或四段富G单链DNA的G残基并肩形成Hoogsteen碱基配对时，就形成了一个由4个G残基的杂环平面联合形成的G-quartet平面。

在4条链中相应的的G之间形成的四分体平面层层堆叠，就形成一段极为稳固的四链体DNA结构（见图1-7）。

由于这段四链体是以G残基为主形成的，故称为G-quadruplex。

其中每一个G碱基既是氢键的受体，又是氢键的给体，他们在结构上是等价的。

在两个相邻的四碱基体的中央会形成一个空腔，空腔内有负电性的羰基氧存在，使得此处易于结合阳离子。

四链体四链体之间通过π-π作用彼此堆积结合在一路。

G-quadruplex特殊结构使得它能够成为特异性的DNA靶点。

图1-7G-quadruplex结构

大量研究说明含不同G序列所形成的四螺旋结构是不同的，即便是相同的序列也能够按不同的方式进行组装。

G-四链体DNA能够通过单链，双链和四链形成三种不同的四螺旋结构，每种结构又有多种异构体（见图1-8）。

大量研究说明含不同G序列所形成的四螺旋结构是不同的，即便是相同的序列也能够按不同的方式进行组装。

此刻普遍以为通过操纵适当的条件，如温度、DNA浓度、缓冲液中的Na+和K+的浓度等能够改变G-四链体的构型。

图几种典型的G-四链体结构

a：

分子间四聚体结构（平行）；b：

分子间二聚体邻位发夹型结构（反平行）；c：

分子内椅状结构（反平行）；d：

分子内蓝状结构（反平行）；e：

分子内螺旋桨状结构（平行）；f：

分子内混合型结构

1.4.2G-四链体与端粒、端粒酶和肿瘤的关系

端粒是由高度重复序列的端粒DNA和端粒结合蛋白组成的复合物。

20世纪三四十年代，HermannMuller和BarbaraMcClintock同时提出了端粒的概念。

它是染色体结尾的一种特殊结构，能避免染色体DNA降解、结尾融合、缺失及非正常重组维持染色体的完整和稳固，并保证细胞正常分化。

端粒的主体是双螺旋结构，富GT链与富CA链配对，但3’结尾突出为一段单链悬挂。

由于缺乏模板的引导，染色体合成进程中传统的DNA聚合酶就无法完全合成那个结尾悬挂，从而造成端粒缩短，这确实是所谓的“结尾复制问题”。

端粒是真核细胞染色体结尾的一种特殊的核蛋白复合体，由高度重复序列的端粒DNA和端粒结合蛋白组成[17]。

不同物种的端粒DNA序列存在不同，但都以富含鸟嘌呤（G）的重复序列为特点。

人的端粒约有15kb反复串联的TTAGGG组成的，而且以50-200bp／次割裂进行缩短，要紧组成部份为5-15kb长的双链DNA和3′结尾100-200bp长的G-单链悬垂（G-overhang）DNA。

端粒的主体是双螺旋结构，富GT链与富CA链配对，但3′结尾突出为一段单链悬挂。

这段单链在名为Shelterin[18]/Telosome[19]的蛋白结构催化下折回到端粒内部双链，并将该端区域的一段自身链置换出来，取而代之与互补链配对，形成T-loop（telomereloop）结构，而3’结尾单链被“包埋”在T-loop中，端粒结尾便形成了一个与外界隔间的闭合结构。

正是由于那个闭合结构，端粒显现出了关于染色体的稳固及其基因组的完整超级重要的作用，它为染色体结尾提供爱惜性，避免染色体相互融合、重组及一些外切酶、连接酶的作用，避免DNA的损伤，并计数在线性DNA复制时显现的结尾DNA片断的丢失。

同时，这种结构也使端粒酶不可能持续与端粒3’结尾单链发生作用，从而保证了端粒长度的恒定。

图左图为人染色体结尾的端粒DNA；右图为人端粒结构示用意

正常细胞的端粒随着细胞割裂进行性缩短，在每一次的复制循环中端粒都要减少50-100个碱基对，细胞在进行大约50次割裂后就开始衰亡。

端粒的长短在细胞癌变和衰老中起着重要作用。

而端粒的长短可由端粒酶调剂。

1985年Greider和Blackburn第一次从四膜虫细胞提取液合成端粒的实验中，发觉了端粒酶活性并同时证明了端粒酶具有维持端粒长度的作用。

端粒酶是一种核酸蛋白质复合物，它能以自身RNA为模板，将真核生物染色体结尾端粒DNA加以延伸的酶，因此它又被称为特化RNA依托性DNA聚合酶、反转录酶、端粒结尾转移酶。

端粒酶由三个部份组成，包括端粒酶RNA（hTR），逆转录酶催化亚基（hTERT）和端粒酶其它聚合蛋白（TEP1）[2]，端粒酶的生物功能是合成染色体结尾的端粒，是一种依托于RNA的特殊的DNA聚合酶，属于逆转录酶类型。

在胚胎发育期，端粒酶的活性很高，而在成熟体细胞中端粒酶的活性那么会被关闭，以此来调控细胞的生长、分化和衰老。

可是在大部份肿瘤细胞（>85％）中，端粒酶那么表现出了很高的活性，而在癌周围组织和正常组织中端粒酶几乎是没有活性的。

在正常的体细胞中，端粒酶的活性取得抑制，因此细胞每割裂一次，端粒就会缩短一些，当达到一个临界长度时，细胞染色体就会失去稳固性，然后细胞将发生衰亡和凋亡。

而在肿瘤细胞中，端粒酶的活性被激活，使得它能够维持端粒的长度，从而维持肿瘤的继续割裂、增殖和生长，因此那个细胞不能进入正常的老化和衰亡，从而取得一种永生性。

由此说明端粒酶与细胞的恶性转化及维持割裂增殖具有紧密的关系。

因此，以抑制端粒酶活性为目标的肿瘤基因医治研究已成为一种新的药物作用靶点，而且极有希望成为最平安、有效的医治肿瘤的理想途径。

端粒酶抑制剂的研究要紧针对其不同的组分及不同的结构，由于G-四螺旋能阻断RNA聚合酶，因此当基因密码区的富含G重复序列形成G-四螺旋而又不易解聚时，会起到抑制RNA聚合酶的作用，从而引发初期转录的停止。

靶向端粒酶集中在以下三个方面：

第一个方面以端粒酶RNA为靶点，第二个方面是抑制端粒酶逆转录酶活性，第三个方面是G-四链体的稳固剂，第四个方面是开发端粒酶抑制剂的新靶点。

G-四螺旋结构的稳固剂或G-四螺旋形成诱导剂的优势在于G-四螺旋结构具有特异性，故具有更强的选择性，从而大大降低了传统化疗药物的毒性。

由此，以G-quadruplex为靶点来寻求能够诱导、稳固或识别四链体结构的小分子是当前研究开发抗肿瘤药物重要途径之一。

综合以上所述，G-四链体与端粒、端粒酶和肿瘤的关系能够归结为下面那个流程图。

图G-四链体与端粒、端粒酶和肿瘤的关系示用意

本文所做的工作

本文将合成一种顺铂配合物，用荧光光谱、紫外光谱观看金属配合物与DNA的G-四链体的键合作用及性质。

要紧做了以下工作：

（1）合成配体dpq-df。

（2）合成铂配合物

（3）对所合成的配合物进行核磁与质谱检测。

（4）用荧光光谱、紫外光谱观看两种不同辅助配体的钌配合物与DNA的G-四链体的键合作用及性质。

2理论部份

配合物与DNA作用的大体形式

作用于G-四链体的小分子配体是通过识别和稳固G-四链体而抑制端粒酶活性的，研究说明，小分子配体和不同结构的G-四链体结合模式不同。

分子模拟显示，配体能够非共价键结合形式堆积在结尾G四分体上，结合在沟上、环上或插入两个G四分体平面之间。

据文献报导，小分子配体与G-四链体的作用模式要紧有两种:

外部堆积模式和插入模式（如图2-1所示）。

1）外部堆积模式。

即小分子配体和G-quadruplex的结尾G-四链体形成共轭结构；

2）插入模式。

即小分子配体插入到两个G-四链体之间；

3）非特异结合模式。

通过氢键和静电作用于沟槽、Loop上。

由于溶液中小分子配体G-四链体之间的结合处于动态平稳状态，致使NMR图谱很难解析，因此，关于复合物的NMR结构数据超级缺乏，给研究小分子配体的结合模式带来了困难。

总的来讲，插入模式由于只有一部份碱基和配体结合，易失衡，从而致使整个G-quadruplex结构的分解。

外部堆积模式来有许多结构特点来维持整个分子能量稳固，结尾G-四分体更易与配体形成共轭结构，结合位点较易识别，动力学稳固，化合物的作用模式更偏向于外部堆积模式。

图2-1小分子与G-四链体的作用模式

（a）外部堆积模式（b）插入模式（c）非特异性结合

DNA与配合物作用的研究方式

2.2.1光谱学方式

2.2.1.1紫外-可见光谱或电子光谱

由于比较灵敏、直观、方便，它是研究金属配合物与DNA作用最经常使用的方式之一。

一样来讲，DNA加入金属配合物后，会对配合物的光、氧化还原等化学物理性质产生阻碍，通过研究DNA加入前后配合物性质的转变可对配合物与DNA的彼此作用进行初步研究。

吸收光谱是研究配合物与DNA彼此作用比较直接的一种方式。

配合物与DNA结合后，使合物所处的环境发生改变，吸收光谱波长和吸收强度发生转变，配合物与DNA作用方式不同，那么波长和吸收强度转变不同。

依据电子跃迁的机制，可将配合物的电子吸收光谱分为三种类型：

1）以金离子Mn+为中心的d-d跃迁所产生的配位跃迁光谱；

2）配体至金属或金属离子（LMCT）或金属离子至配体（MLCT）的电荷迁移光谱，简称荷移光谱；

3）以配体L为中心的配体间的电子转移光谱（IL）。

其中金属离子向配体的电子跃迁发生在金属离子具有充满的或接近充满的t2g轨道，而配体具有最低空Π轨道的配合物中。

核酸分子由于其嘌呤和嘧啶碱基具有共轭双键体系，因此在紫外区260-290nm处有特点的吸收，这种吸收随分子中各碱基的种类、所占比例和碱基间的堆积方式等的改变而有所不同。

一样来讲，结构越有序，吸收值越低。

因此，咱们可利用紫外吸收光谱对上述各核酸分子结构的形成进行初步判定。

当配合物插入到DNA碱基对时，对应的吸收峰产生明显的减色效应，并伴有必然程度的红移。

2.2.1.2荧光光谱

荧光光谱法是研究小分子与核酸彼此作用的要紧手腕。

荧光物质在激发光的激发下，由基态跃迁到较高的能级（激发态）后，第一通过内转换进程消耗一部份能量，回到第一电子激发态的最低振动能级，同时以光量子的形式发射能量，即为荧光。

配合物以插入方式与DNA作用后，由于它的振动模式受到抑制，或免受水分子的淬灭，配合物受到了DNA碱基疏水环境的爱惜，其发光强度一样会增强。

并依照强度的转变来判定与DNA作用的强弱。

2.2.1.3圆二色谱及DNA解旋技术

圆二色谱能够检测有无旋光物质的存在[51，52]，或比较左、右旋物质的混合物中哪一