铁皮石斛组织机构培养栽培试验实验.docx

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铁皮石斛组织机构培养栽培试验实验

铁皮石斛茎段组织培养与栽培

摘要:

为试验铁皮石斛茎段组织培养与栽培，以铁皮石斛茎段为外植体，结合铁皮石斛的生物学特性，综述铁皮石斛组织培养与栽培的过程技术。

观察研究基本培养基、天然附加物和植物生长调节剂对铁皮石斛生长的影响。

验证和探究铁皮石斛茎段组织培养技术并对铁皮石斛的组织培养与栽培管理技术进行了思考与展望。

关键词:

铁皮石斛;组织培养;茎段;移栽;驯化

0.引言

铁皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuraetMigo）是兰科（Orchidaceae）石斛属（DendrobiumSw．）多年生草本植物，又名黑节草，俗称铁皮枫斗，分布于云南、安徽、贵州、浙江、江西、广东和广西等地，是我国传统名贵珍稀中药材，其有效成分主要为石斛多糖、石斛碱、氨基酸等，其中石斛多糖的含量高达21.7%，能显著提高机体免疫功能，具有养胃出津、补肾益力、滋阴清热、耐缺氧、抗疲劳、抗肿瘤等功效。

现代药理学研究发现，石斛还具有抗衰老和扩张血管的作用。

铁皮石斛喜荫凉、湿润的环境，常附在高海拔悬崖峭壁或林内树干和岩石缝隙中。

由于其药用价值高、生长条件特殊和分布受局限，且经长期人为采挖，野生资源濒临灭绝。

铁皮石斛是2005版《中华人民共和国药典》收载的3种石斛属植物之一，为石斛之极品，它因表皮呈铁绿色而得名。

铁皮石斛蒴果成熟时易开裂，且种子粒径小，自然繁殖率低，是一种珍稀的药用植物和和名贵的室内观赏植物.。

铁皮石斛自然繁殖力极低,常规繁殖又较困难,且多年来对铁皮石斛的采集量远大于其生长量,野生铁皮石斛自然繁殖已濒临绝迹。

由于药用价值高，人为的过度开采与生态破坏，野生铁皮石斛已濒临灭绝，1987年国务院将其列为国家重点保护植物。

1材料与方法

1.1试验材料

野生云南铁皮石斛，取材于浙江农林大学组培实验室，取其茎段作为外植体进行组织培养。

1.2试验方法

1.2.1外植体消毒

取铁皮石斛的茎，去除多余叶片后用解剖刀将茎切成含3～4个节点的茎段，保留节点。

依次用中性洗涤剂清洗，自来水冲洗20min，用70%的乙醇浸泡10～60s，再转入0.1%的氯化汞中，灭菌5～11min后倒去氯化汞溶液，用无菌水反复漂洗材料3-5次。

用无菌纸吸去茎段上多余水分，将其切成1～2cm带一个芽点的茎段，接种到培养瓶中培养。

1.2.2培养基制备

铁皮石斛培养基均添加3%蔗糖，0.7%琼脂，pH值为5.8。

按不同目的在基本培养基中加入6-BA、NAA、IBA，每个培养瓶分装50m培养基，密封。

经过121℃高温灭菌25min。

不定芽的诱导培养基是在基本培养基MS中加入细胞分裂素和生长素，采用不用浓度水平的NAA和6-BA。

组培苗的壮苗与生根，将生长状态稳定的试管苗接种于添加不同激素组合的1/2MS培养基上。

（1）诱导培养基:

①MS+6-BA0.5mg／I。

+NAA0.05mg／L+AC（活性炭）29／L；

②MS+6-BAl．0mg／L+NAA0．1mg／L+AC29／L。

（2）增殖培养基:

花宝3号39／L+6一BA2．5mg／L+NAA0．25mg／I。

+AC29／L。

（3）生根培养基:

1／2MS+IBA0．5mg／L+AC29／L。

培养基中添加蔗糖209／L，pH5．2～5．4

1.2.3培养条件

接种铁皮石斛培养材料的组培苗在组织培养室中培养，培养温度为（26±2）℃，光照14h/d，光强1500～2000lx。

1.2.4诱导培养

用解剖刀将铁皮石斛的幼嫩茎段切下，接种在诱导培养基①中进行培养。

15～20天后，外植体开始萌动，茎段膨大，切面及顶部组织形成疏松组织。

继续培养20天后，转入培养基②中，切面及顶部膨大组织的表面形成凹凸不平的颗粒物，随着培养时间的延长，颗粒物长大形成直径1～2mm的类原球茎颗粒物。

1.2.5增殖培养

将诱导形成的原球茎转入到增殖培养基中，原球茎增殖速度很快，增殖倍数可达3～4倍，同时部分原球茎开始分化出芽点并长出1～2片小叶，原球茎的增殖与芽分化同时进行。

1.2.6生根培养

取诱导形成的不定芽，要求芽高2～3cm，带3～5片叶的不定芽，将其接种到不同处理的生根培养基上，进行培养。

培养30天左右，基部开始出现2～3条约1cm长的白色根，随后逐渐伸长，生根率达到90％以上。

2.移栽与驯化

2.1移栽前的准备

2.1.1炼苗

当苗高3cm以上、具3～4片叶时，便可炼苗。

移栽前先将瓶苗至炼苗房进行2~3周的炼苗，让瓶苗从封闭稳定的环境向开放变化的环境过渡，慢慢适应自然环境，等瓶苗生长健壮、叶色正常，根长3cm以上，肉质茎有3~4个节间、长有4~5片叶，叶色正常，根长3cm以上，有4~5条根，根皮色白中带绿，无黑色根，无畸形，无变异。

炼苗目的：

炼苗的主要目的是使组培苗适应外界的环境——温差，湿度差以及微生物环境。

炼苗方法：

1）将待炼苗的材料放置于欲移栽的环境，不开盖保持4-5天；

2）半开盖保持1-2天后，全开盖再炼苗2-3天

2.1.2出瓶

组培苗出瓶时，打开瓶塞将培养基与小苗一起轻轻取出，整齐放置于盆中待清洗，污染苗、裸根苗或少根苗分别放置。

正常组培苗先在自来水中洗净培养基，特别要洗掉琼脂，以免琼脂发霉引起烂根，再换自来水清洗一次。

裸根或少根组培苗经过上述清洗后，还需将小苗根部置于100mg/L的ABT生根粉中浸泡15分钟，以进行生根诱导。

污染苗经过清洗后，用1000倍多菌灵浸泡整株小苗10分钟。

后期管理得当可有效控制污染的发生。

栽种于已灭菌的基质中（移栽前浇透水），放置在遮光度50％～60％、湿度达80％以上的温室中，2个月后，成活率达90％以上。

2.1.3基质的准备

移栽铁皮石斛组培苗要选择适宜的基质。

铁皮石斛的根是气生根，有明显的好气性和浅根性，因此，要求基质以疏松透气、排水良好、不易发霉、无病菌和害虫潜藏者为宜。

可以选择水苔、石灰石、碎砖、树皮、刨花、蕨根、板边、菌糠、木糠等为移栽基质。

铁皮石斛不宜深植，种植时根系向四周均匀展开，将基质填充根部、基部必须露出，否则易造成烂根。

移栽后隔5天再浇水效果较好。

30天内每隔1天喷雾1次，水量不宜过多，期间勿施肥，待小苗恢复正常生长后才开始常规的水肥管理。

2.1.4栽培场地的选择

铁皮石斛喜温暖、多雾、微风、清洁、散射光环境，忌阳光直射和曝晒。

在移栽过程中要创造条件，为铁皮石斛创造最佳的生长环境。

铁皮石斛原产区大多处于温带和亚热带，全年气候温暖、湿润，冬季气温在0℃以上。

根据铁皮石斛的生长习性，要考虑场地的光照、温度、湿度、通风等自然因素。

笔者认为最好选择在大棚内移栽，而且要移栽在高架畦，这样容易满足铁皮石斛生长的最佳环境要求，而且很多自然因素容易控制。

在建造育苗大棚时要满足以下三个条件：

（1）育苗大棚要通电、通水、通路，要求棚宽6m、长30m、棚肩高107m以上、棚顶高2.8m以上，棚顶覆盖塑料无滴薄膜和70%遮荫度的遮荫网，棚内安装有自来水管，大棚四周和入口装有40目的防虫网。

有条件的，棚内还要装有自动或手动控制的喷雾系统（最好既能喷雾，又能喷肥、喷药），这样可以防晒、防雨、防虫、保温、保湿、透气，还能大大减少劳动量。

（2）棚内搭建畦底架空的高架种植畦。

可用角钢、砖头、木条或方条等材料作为种植畦的框架，然后铺设孔径为0.3~0.5cm的塑料平板作为栽培基质的支撑面，要求畦宽1~1.2m，畦长度可自定，畦底架空高度30~50cm。

种植畦上方装有可随时喷雾的喷头，喷雾饿时间最好能控制。

没有条件的，也可以用喷雾器来代替。

搭建高架种植畦的目的是为了使水分和透气容易控制，从而为组培苗生长提供最佳水分，保证通风透气，又能同时喷肥喷药，移栽成活率高，大面积移栽时能大大节省劳动力。

（3）在种植畦上铺5~8cm厚的基质，摊平。

移栽前用0.3%高锰酸钾或1000倍多菌灵药液对基质喷洒消毒。

2.2移栽

2.2.1移栽时间

移栽最佳季节应为日平均气温在15~30℃时，气温过低或过高均不宜出瓶移栽。

一般来说，在铁皮石斛主产地，除了最冷的1-2月以及最热的7-8月外均可栽培。

部分高海拔地区，除了12月至次年3月，其余时间均可栽培。

2.2.2移栽方法

用镊子将组培苗小心取出，洗去培养基后，即可移植到种植畦上。

移栽时用手指在基质挖2~3cm深的小洞，轻轻把石斛根部放入小洞，注意不要弄断石斛的肉质根，然后用基质盖好。

裸根苗或少根苗最好分开种，以便于管理。

移栽密度为500株/m2，株行距为4cm×5cm。

2.3移栽后的管理

2.3.1温度管理

人工移栽铁皮石斛组培苗要满足其冬暖夏凉的要求。

组培苗生长适宜温度为20~30℃。

夏季温度高时，大棚内须通风散热，并常喷雾来降温保湿，每天喷雾3~5次，每次喷雾2~5分钟；冬季气温低时，大棚四周要密封好，以防冻伤组培苗。

2.3.2湿度管理

刚移栽的组培苗对水分很敏感，缺水则生长缓慢、干枯、成活率低。

而喷雾过多则渍水烂根，温度高、湿度大时还易引发软腐病大规模发生。

移栽后一周内（幼苗尚未发新根）空气湿度宜保持在90%左右，一周后，植株开始发新根，空气湿度可保持在70%~80%。

种植畦干湿交潜有利于发根长芽。

2.3.3肥水管理

大棚移栽期间的施肥以叶面肥为主。

由于石斛为气生根，因此要喷施适宜的叶面肥作为营养液，以供给植株充足的养分，利早发根长芽。

叶面肥可以选择硝酸钾、磷酸二氢钾、腐植酸类等，以及进口三元复合肥和稀释的MS培养基等。

一般移栽后一周，植株新根发生后开始喷施千分之一的硝酸钾或磷酸二氢钾，7~10天喷一次，连续喷3次。

长出新芽后每隔10-15天喷3‰的三元复合肥等。

一般情况下，施肥后两天停止浇水。

若空气对流太大，则视基质干湿度适当喷雾补水。

3.病虫害防治

铁皮石斛的主要病害有软腐病、黑斑病、炭疽病等。

软腐病发病快，严重时整株腐烂解体呈湿腐状；黑斑病危害叶片，使叶片枯萎；石斛炭疽病危害叶片及肉质茎，受害叶片出现黑色或褐色病斑。

针对这些常见病害要加强棚内管理、注意通风透光、适当降低棚内湿度，及时施药并拔出病株带离。

铁皮石斛的主要虫害有蜗牛、菲盾蚧、红蜘蛛等。

其中，蜗牛是常见害虫，危害幼茎、嫩叶、花蕾和幼果。

可用诱杀、人工捕杀或撒石灰、茶麸防治；石斛菲盾蚧寄生于植株叶片边缘或背面吸食汁液，可将集中有菲盾蚧的老枝烧毁或用40％乐果乳油1000倍等喷雾杀灭；红蜘蛛可通过除周边环境的杂草或喷低毒杀螨剂800～1000倍防治。

铁皮石斛为珍贵药材，因此铁皮石斛的病虫害防治应尽可能以预防、物理防治和生物防治为主，不用或采用低毒农药；一旦发现有病虫害应及时采取相应措施，避免病虫害情的加重。

4.思考与展望

有效地控制污染是植物离体培养成功的关键。

外植体造成的污染最复杂，也最难控制，其原因可能是细菌引起的，也可能是真菌引起的。

微生物可能是腐生的，也可能是内生的，最难处理的则是内生菌。

铁皮石斛外植体含有较多的内生真菌，从铁皮石斛根中分离出内生真菌约25种，因此铁皮石斛的外植体消毒应特别注意也较为困难。

不定芽诱导和增殖的基本培养基以MS为宜，同时，植物生长调节物质对铁皮石斛的组织培养起重要作用，虽然用量小，但在植物组织培养中使用的激素包括生长素、细胞分裂素等，而NAA和6-BA组合常用于诱导不定芽和生根。

结果与其他研究报道的铁皮石斛不定芽诱导培养基配方有所不同，可能与培养的石斛品种有关。

同时，适宜的接种密度和不同的外植体部位都会对不定芽的诱导和增殖产生一定的影响。

试验结果表明，低浓度的NAA、IBA对组培苗根系生长具有显著的促进作用，而高浓度的NAA、IBA均对组培苗根系生长有明显的抑制作用。

适合铁皮石斛组培苗生根培养基为:

1/2MS+0.5mg/LNAA，其次为1/2MS+0.5mg/LIBA。

目前，铁皮石斛组织培养的研究大多集中在快速繁殖、扩大繁殖系数等方面，今后应加强铁皮石斛的基础性研究，如共生菌、光照、温度、湿度、栽培基质等对石斛生长发育的影响，从而深入掌握石斛生长发育的营养需求，物质合成与分解等新陈代谢规律，确定铁皮石斛类群生长的最佳生态环境，将研究方向和成果与大田栽培紧密结合起来，才能从根本上解决铁皮石斛培养困难，人工种植困难，产量低等问题。

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