《临床检验仪器与技术》复习指导.docx

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《临床检验仪器与技术》复习指导

《临床检验仪器与技术》复习提纲

第六章电泳仪器与技术

一、发展历程

1809年，俄国科学家列伊斯，发现电泳现象。

1897，Kohlausch导出了带电粒子移动的理论公式。

20世纪初，Hardy发现许多生物胶体粒子的迁移率取决于电解质溶液的pH。

1937年瑞典科学家Tiselius建立了界面电泳技术，证明了血清是由白蛋白、α1、α2、β和γ蛋白组成，获得1948年诺贝尔化学奖。

1950年后，区带电泳从发展到成熟。

1980年以来，毛细管电泳逐渐受到重视。

二、基本原理

不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，因此可使它们分离。

1、影响电泳速度的因素

1）内在因素

从公式V=EQ/6πrη，我们认识到：

不同物质颗粒具有不同的电泳速度；粒子的移动速度（泳动速度V）与电场强度（E）和粒子所带电荷量（Q）成正比,而与粒子的半径（r）及溶液的粘度（η）成反比。

2）外界因素

A、电场强度

B、溶液的pH值

pH值离等电点越远，颗粒所带的电荷越多，电泳速度↗；

蛋白质电泳：

pH8.2-8.8巴比妥或硼酸缓冲液

核酸电泳：

TAE、TBE、TPE

C、溶液的离子强度I

溶液的离子强度I↗，离子间的相互作用力越强，电泳速度↘

D、溶液粘度

粘度↗电泳速度↘

E、吸附作用（介质对样品的滞留作用）

吸附作用越强，电泳速度↘

三、常用电泳分析方法

1、醋酸纤维素薄膜电泳

电泳时经过膜的预处理、加样、电泳、染色、脱色与透明即可得到满意的分离效果。

此电泳的特点是分离速度快、电泳时间短、样品用量少。

因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。

2、琼脂糖凝胶电泳

以琼脂糖为支持介质进行的电泳。

具有大量微孔；较高的机械强度；无毒，不需要催化剂；具有热可逆性，低熔点琼脂糖回收样品容易；生物中性，与别的生物材料结合性低；具有高灵敏度放射自显影；胶凝温度34-43℃。

3、聚丙烯酰胺凝胶电泳

以聚丙烯酰胺凝胶作为介质，此凝胶机械强度好、弹性大、无电渗作用、分辨率高。

具有浓缩效应、分子筛效应和电荷效应。

其中的聚丙烯酰胺双向电泳（2-DE）第一向采用等电聚焦，根据复杂的蛋白质成分中各个蛋白质的PI的不同，将蛋白质进行分离。

第二向采用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳，按蛋白质分子量的大小使其在垂直方向进行分离。

其结果不再是条带状，而是呈现为斑点状。

4、毛细管电泳

是以柔性毛细管柱作为分离通道，以高压直流电场作为驱动力，对各种小分子、大分子或细胞等进行高效分离、检测或微量制备等有关技术的总称。

它具有热效应低；高效（每米塔板数为十万、百万、千万）；高速（几十秒内完成）；高灵敏度、高分辨率（10-19～10-21mol）；样品用量少（进样体积仅为纳升，样品浓度低于10-5mol/L）；毛细管内径很小（一般小于100um）；应用范围广（无机离子到整个细胞）；重复性好；进样的准确性的优点。

第七章流式细胞分析仪器与技术

一、流式细胞术是一种对处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析和分选的技术。

二、流式细胞仪包括液流系统、光路系统、信号检测系统、数据分析与显示系统和分选系统。

1、液流系统由样本和鞘液组成。

样本流和鞘液流分别在各自压力系统作用下经专门管道进入流动室。

鞘液辅助样本流，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔，保证被测细胞不会脱离液流的轴线方向并与激光正交。

2、光路系统主要由激发光源的激光器和各种滤光片构成。

3、信号系统包括光电检测器、放大电路和模数转换器。

受激发产生的光信号包括散射光信号和荧光信号。

散射光信号又分为前向角散射光（FSC）和侧向角散射光（SSC）。

FSC与细胞的大小有关；SSC与细胞的颗粒性及其内部复杂程度有关，反映细胞内的精细结构和颗粒性质等信息。

光电检测器包括光电二极管（photodiode）和光电倍增管（photomultiplier,PMT），光电二极管　　　光灵敏度低，用于测定强信号（如FSC）；PMT光灵敏度高，用于测定弱信号（如SSC,FL1,FL2,FL3,FL4）。

电信号的放大一般可以使用线性或对数两种方式。

一般FSC和SSC变异范围较小，故使用线性放大；而测定免疫细胞膜抗原等时，荧光信号变异范围较大且光谱信号较为复杂，故多使用对数放大。

光信号经PMT转变为电子信号时是以电子波形式被计算机系统接收而进行分析，计算机系统可以根据电子波的高度、宽度和面积来反映光信号的大小，信号越强这三个参数值越大，一般以面积代表光信号的大小比用高、宽度更准确，但有时可用高度表示信号大小，用宽度区分黏连的细胞。

4、数据分析及显示系统。

标准的FCM数据采用列表模式，记录了每个细胞的所有参数的信息。

分析后数据主要通过流式图的方式全面客观的展示，最常用的是散点图、伪彩图、等高线图、密度图和假三维图。

5、分选系统由液滴形成、充电和偏转三部分构成。

分选模式有纯化模式、富集模式和单细胞模式。

三、流式细胞仪主要性能指标

1、荧光灵敏度≤200MESF（FITC）；≤100MESF（PE）；FSC检测灵敏度：

≤1μm；

2、分辨率CV≤2%；

3、表面标志物检测准确性和重复性：

测定值在给定范围内和CV≤10%。

4、分析速度：

一般为3000～6000个细胞/秒。

5、分选指标：

1）分选速度：

一般为1万个细胞/秒左右

2）分选纯度：

一般可以达到98%以上

3）分选收获率：

一般可达95%以上

4）其它指标：

在荧光线性方面，FCM荧光强度的线性相关系数应不低于0.98；在仪器稳定性方面，在环境温度变化不超过设定温度的5%时，8小时内检测FSC及所有荧光通道峰值的波动范围应不超过10%；仪器的携带污染率应不大于1%。

四、操作流程

第十一章临床免疫学检验仪器与技术

一、免疫荧光染色

1、原理：

将荧光素标记在抗体上，免疫反应结束后使用特定波长的激发光照射标记的荧光素，荧光素吸收激发光的能量，产生可见的荧光。

时间分辨免疫荧光分析技术原理：

镧系元素的荧光寿命比非特异性荧光长，利用这一特点，使用镧系三价稀土离子及其螯合物作为标记物标记抗体（或抗原）进行免疫反应，待反应体系中血清、溶剂和其他成分的短寿命背景荧光完全衰变后，再测量镧系元素的特异性荧光，以有效地降低本底荧光的干扰。

这种技术称时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）。

二、免疫比浊技术原理：

当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度。

利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗原含量。

1、透射免疫比浊法原理：

抗原与抗体在一定缓冲液中形成IC，当光线透过反应溶液时，由于溶液内IC粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减少，IC越多透射光越少，可用吸光度表示。

2、散射免疫比浊法原理：

抗原抗体复合物对一定波长的光产生折射、偏转，偏转角度及散射光强度与复合物粒子的大小和量有关。

三、酶联免疫分析

1、原理：

是酶标记固相免疫分析技术；抗体、抗原进行免疫反应后，标记的酶水解反应底物而使之显色；显色程度与其浓度成一定关系，能对抗原（或抗体）进行定性或定量。

2、酶标仪的基本原理与结构：

基本工作原理和主要结构与光电比色计基本相同；相当于专用于ELISA的光电比色计或分光光度计。

四、化学发光免疫分析

1、基本原理：

通过免疫反应特异性地将待测组分从样本中分离，再通过化学发光反应显示分离的组分，并且化学发光的反应强度与待测组分的含量成一定的比例关系。

2、过程：

化学发光免疫分析包含两个部分,即免疫反应系统和化学发光分析系统。

免疫反应系统是将标记物质标记在抗原或抗体上,经过特异性免疫反应后,形成抗原2抗体复合物。

然后进行对标记物进行检测,来测定待检物。

化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化,形成一个激发态的中间体,当这种激发态中间体回到稳定的基态时,同时发射出光子,利用发光信号测量仪器光量子产率。

3、分类

1）化学发光酶免疫测定：

将酶标记于示踪抗体上，再以酶催化底物进行化学发光反应。

2）化学发光免疫测定：

用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。

常用标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物，通过启动发光试剂（NaOH和H2O2）作用而发光，强烈的直接发光在一秒内完成，为快速的闪烁发光。

3）电化学发光免疫测定：

是一种在电极表面由电化学引发的特殊的化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光两个过程。

4）光激化学发光免疫分析技术：

抗体包被感光微球，抗原包被发光微球，抗体与抗原结合，感光微球在680nm激发光照射下，产生单线态氧扩散至发光微球并传递能量，发光微球发射520～620nm荧光信号；单线态氧的半衰期只有4微秒（μs），在反应体系中只能扩散大约200nm；发光的量与样品中的待测抗原量成反比。

第十四章临床分子生物学检验常用仪器与技术

一、PCR扩增

PCR（polymerasechainreaction）聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。

近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。

1、基本原理：

用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段，类似于天然DNA的复制过程。

以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。

基本反应步骤分三步：

高温变性；低温退火；适温延伸

2、反应体系

1）缓冲液：

10～50mMTris-HCl（pH8.4）：

维持Taq酶作用环境的偏碱性。

25～50mMKCl：

促进引物退火，>50mM会抑制Taq酶的活性。

100μg/ml牛血清白蛋白（BSA）：

对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作用，建议使用乙酰化的BSA。

明胶、Tween-20、二硫苏糖醇（DTT）也有类似作用。

2）dNTPs:

dATP、dGTP、dCTP、dTTP——底物，dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。

0.02～0.2mM，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等，如其中任何一种浓度不同于其它几种时，就会引起错配。

3）MgCl2:

1.5～2.0mM

Taq酶具有Mg2+依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量，在一般的PCR反应中，各种NTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。

4）引物（Primer-P）：

0.2～1μM

预扩增核酸片段两端的已知序列，是PCR特异性反应的关键；PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度；理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

5）TaqDNA聚合酶：

耐高热；0.5～5U/100μl

特点：

以DNA为模板，从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将4种脱氧核苷酸以碱基配对方式，按引物5‘-3’的方向，合成新的DNA链；无Klenow酶所具有的3‘-5’外切酶活性，故无校正功能，错误频率为0.25％，即在25轮循环后，其扩增产物的顺序中400个碱基可能出现一个篡改（错误掺入）碱基。

6）模板DNA：

最低102～105bpDNA片段，实际用量远远超过此量，用量需在实验中摸索。

7）水：

去离子水，补足整个反应体积。

3、普通PCR仪分类：

1）水浴式PCR扩增仪

2）变温金属块式PCR扩增仪：

主要结构特点是在同一个金属块上完成高温变性、低温退火和适温延伸三个温度的交替变化。

3）变温气流式PCR扩增仪：

依据空气气流的动力学原理，以冷热气流为介质对PCR管进行升降温，实现三个温度循环。

4）梯度PCR扩增仪：

梯度PCR扩增仪的结构与变温金属块式PCR扩增仪的结构基本相同，在温度控制环节增加了梯度功能。

5）原位PCR扩增仪：

在细胞内进行PCR扩增，而组织细胞的形态不被破坏，它是原位杂交与PCR技术的结合。

二、全自动DNA测序仪

1、工作原理：

根据在某一固定的点开始核苷酸链的延伸，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A、T、C、G四组不同长度的一系列核苷酸链，在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行片段的分离和检测，从而获得DNA序列。

主要有：

Sanger双脱氧链末端终止法和Maxam-Gilber化学降解法。

前者更简便和更适合于光学自动探测，故在全自动DNA测序仪中应用广泛

2、双脱氧链末端终止法

1）测序原理：

普通的PCR反应体系中，加入的核苷酸单体为4种2’-脱氧核苷三磷酸（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）。

ddNTP在脱氧核糖的位置上缺少一个羟基，反应过程中虽然可以在DNA聚合酶作用下，通过其磷酸基团与正在延伸的DNA链的末端脱氧核糖-OH发生反应，形成磷酸二酯键而掺入到DNA链中，但它们本身没有-OH，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，从而使正在延伸的DNA链在此终止。

由于存在ddNTP与dNTP的竞争，生成的反应产物是一系列长度不同的多核苷酸片段。

2）分类：

多色荧光标记法：

包括荧光标记引物法和荧光标记终止底物法。

荧光标记引物法

定义：

将荧光染料预先标记在测序反应所用引物的5’端

一组（4种）荧光标记引物，其序列相同，但标记的荧光染料颜色不同

测序反应中，模板、反应底物、DNA聚合酶及标记引物等按A、T、C、G编号被置于4支微量离心管中，A、T、C、G四个测序反应分管进行，上样时合并在一个泳道内电泳。

特定颜色荧光标记的引物则与特定的双脱氧核苷酸底物保持对应关系

荧光标记终止底物法

定义：

将荧光染料标记在作为终止底物的双脱氧单核苷酸上

反应中将4种ddNTP分别用4种不同的荧光染料标记，带有荧光基团的ddNTP在掺入DNA片段导致链延伸终止的同时，也使该片段端标上了一种特定的荧光染料

经电泳后将各个荧光谱带分开，根据荧光颜色的不同来判断所代表的不同碱基信息

单色荧光标记法也包括荧光标记引物法和荧光标记终止底物法。

与多色荧光标记法不同的是单色荧光标记引物法和荧光标记终止底物法均需将A、C、G、T四个反应分别在不同扩增管中进行，电泳时各管产物也分别在不同泳道中电泳。

三、核算自动化提取

1、原理：

（磁珠分离法）

四、蛋白质测序仪

蛋白质测序仪工作原理：

执行全自动化的Edman化学降解反应和游离氨基酸的分离与鉴定过程。