第七篇遗传毒物与细胞死亡.docx
《第七篇遗传毒物与细胞死亡.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第七篇遗传毒物与细胞死亡.docx（84页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
第七篇遗传毒物与细胞死亡
p178
第七章遗传毒物与细胞死亡
细胞死亡是细胞对内外环境不利或有害因素的一个最悲剧性反应。
遗传毒物也可通
过各种途径引起细胞死亡。
近年来对细胞死亡特别是凋亡发生机制的研究发展非常迅
速。
已有可能对细胞凋亡的发生进行干预，成为控制病理状态甚至疾病发生发展的一种
可选择的手段。
本章将首先对细胞死亡，特别对细胞凋亡的基本概念作一介绍，然后阐述
遗传毒物诱发细胞凋亡的主要信号通路，最后对确认细胞凋亡的技术进行简要的评述。
第一节细胞凋亡和非凋亡性死亡
高等生物的细胞死亡有两种形式，细胞凋亡（apoptoticelldeath）和非凋亡性细胞死亡
non-apopototiccelldeath。
细胞的非凋亡性死亡，即细胞坏死（necrosis）是由于有害刺激或
细胞内环境的严重紊乱导致细胞急剧死亡。
其特征是细胞膜通透性增加，大量水分进入
细胞，细胞因肿胀而破裂，细胞内容物释放而诱发进一步的损伤和炎症反应。
因此细胞非
凋亡性死亡又称为细胞的意外死亡（accidentalcelldeath）。
细胞凋亡（apoptosis）曾被称
为细胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）则是由于细胞内外因子诱发了细胞内一
个特殊的蛋白酶级联反应而发生的有序死亡。
apoptosis出自希腊语，指细胞的死亡犹如
秋天树叶的凋落。
细胞凋亡形态学上表现为细胞皱缩、染色质浓缩和出现凋亡小体。
凋
亡小体具有完整的膜结构，内含部分胞质、细胞器和破碎的细胞核成分，形成的凋亡小体
由邻近的正常细胞或吞噬细胞清除，其内容物不会因外泄而引起炎症反应。
在细胞凋亡
的最后阶段，核小体连接部的DNA会被核酸内切酶降解成不同倍数的180～200bp左右
的寡核苷酸片段。
在琼脂糖凝胶电泳上呈现梯型图式（ladderpattern），是凋亡细胞常出
现的一种相对特征的表现。
有关细胞凋亡和细胞坏死的比较，见表7-1。
表7-1细胞凋亡和细胞坏死的比较
特征
细胞凋亡
细胞坏死
定义
在形态学上表现为细胞皱缩，核碎
裂、胞浆生芽和形成凋亡小体
为病理性袭击的结果，质膜的完整性突然消
失、膜电化学梯度消失和细胞内容物释出
诱发刺激
生理性或病理性
病理性
形态表现
成泡
有（细胞器呈泡状）
有（无细胞器呈泡状）
质膜完整性
保持
破损
细胞大小
缩小——细胞皱缩和形成凋亡小体
增大——细胞肿胀并溶解
炎症反应
无
有
细胞内容释出
不
是
生化表现
大分子（蛋白质）合成
有些情况下必需
非必需
基因表达
有些情况下必需
非随机裂解为50、300kb，随后再裂
非必需
DNA裂解
解为180bp为倍数的碎片（大小由涉及的核小体数决定）
随机裂解
调控
高度受控
不受调控
半胱天冬酶级联反应
必需
非必需
p179
细胞凋亡可在各种异常情况下发生，细胞处于不利生长环境如培养细胞遭遇血清和
其他生长因子的剥夺，细胞遭遇温度、pH和渗透压改变等应激状态，以及细胞遭遇各种类
型的打击，如DNA损伤、线粒体损伤、病原体感染或恶性转化都可通过诱发细胞凋亡以
除去不健康的细胞；凋亡也见于生理条件下，在胚胎发育和变态过程（metamorphosis）中
的，以及内分泌依存性组织的萎缩和细胞死亡及正常组织更新中的细胞死亡都由凋亡过
程中介。
如在胚胎发育过程中，手形成时除去指间空隙中的细胞；受体基因未经重排的，
以及可识别自身组织的胸腺细胞也通过凋亡而除去；在成体动物，衰老细胞也必需除去代
之以新生细胞以维持其稳态[1～5]。
第二节细胞凋亡概论[6～13]
一、细胞凋亡执行器与蛋白酶半胱天冬酶级联反应
凋亡过程的执行器（executor）为细胞的蛋白酶，不论何种因素诱发的细胞凋亡，虽其
具体的信号通路有别，但最终无例外都是激发以蛋白酶组成的级联反应这个中心环节。
其早期证据来自细胞毒T细胞和自然杀伤细胞胞浆颗粒组分中发现的穿孔素（perforin）
及一系列蛋白酶。
蛋白酶中的颗粒酶8与断裂素一2（granzymeB／fragmentin2）有独特
特性，它可裂解天冬氨酸残基。
靶细胞接触穿孔素和颗粒酶8的纯制品就足以诱发细胞
凋亡。
蛋白酶在细胞凋亡调节过程中处于中心位置的直接证据来自对秀丽新小杆线虫
（Caenorhabditiselegans）发育过程中发生的细胞死亡的研究。
在线虫的l5个死亡相关基
因中，ced一3，ced一4是指令死亡基因，而ced一9是抑制ced一3／ced一4的存活基因。
在哺乳动物中，也发现了与上述基因同源的基因。
其中与ced一3同源的基因是ICE，即
编码半胱天冬酶一l的基因；与ced一4的同源基因是编码凋亡蛋白酶活化因子（apoptosis
Droteaseactivatingfactor一1，Apaf一1）的基因，而与ced一9同源的是bcl一2基因家族。
ICE编码的白介素一lβ转化酶（interleukin—lp—convertingenzyme，ICE）可在天冬氨酸
残基之后将33kDa的IL一1β前体裂解为17．5kDa的活性酶，因此该酶属半胱氨酸蛋白
酶（cysteinprotease）。
目前已发现l4个对细胞凋亡及（或）炎症有重要作用的ICE蛋白酶
超家族成员，称为半胱天冬酶一l～14，其中包括3个在人类还未找到相应对等物的小鼠
半胱天冬酶一ll、一l2和一l4。
根据其序列同源性被分为三个亚家族；ICE一样、ICH一1
样和CPP32样蛋白酶。
它们具有保守的底物结合和酶促序列，并都在天冬氨酸残基后将
底物裂解。
因此近年来这个酶家族统一用半胱天冬酶（caspase）命名，该名取自cysteine
asDartate-specificproteinase，并把ICE一样、ICH一1样和CPP32样蛋白酶亚家族分别称为
半胱天冬酶一l、半胱天冬酶一2和半胱天冬酶一3亚家族（表7—2）。
半胱天冬酶在细胞凋亡发生中的重要地位来自以下证据：
半胱天冬酶的激活与细胞
凋亡的发生相关联，它的抑制使凋亡过程减弱；缺乏CED一3半胱天冬酶的线虫C．ele一
gans突变体完全不会发生发育性程序性细胞死亡；半胱天冬酶基因剔除技术更进一步确
认半胱天冬酶在凋亡和炎症中的作用。
缺乏半胱天冬酶一3、半胱天冬酶一8和半胱天冬
酶一9的动物由于发育性细胞程序性死亡的严重缺陷而在围产期死亡。
半胱天冬酶一l缺
如的果蝇引起蛹期死亡并促进黑色素性肿瘤的发生。
缺乏半胱天冬酶一2的小鼠可发育
p180
表7-2半胱天冬酶的特征（修改自WolfBB和GreenDR[11]）
酶原
（kDa）别名
前功能域
长短
和基序
活性
亚单位
kDa
激活作用
接头蛋白
优先作
用四肽
序列8
凋亡启动因子ICH-1样半胱天冬酶-2亚家族
半胱天冬酶-2（51）ICH-1
长，CARD
20/12
RAIDD
DXXD
半胱天冬酶-8（55）FLICE、MACH、Mch5
长，DED
18/11
FADD
（L/V/D）EXD
半胱天冬酶-9（45）ICE-LAP6、Mch6
长，CARD
17/10
APAF-1
（I/V/L）EHD
半胱天冬酶-10（55）Mch4
长．DED
17/12
FADD
不明
凋亡执行因子CPP32样半胱天冬酶-3亚家族
半胱天冬酶一3（32）CPP32、Yama、apopain
短
17/12
不需
DEXD
半胱天冬酶-6（34）Mch2
短
18/11
不需
（V/T/I）EXD
半胱天冬酶-7（35）Mch3、ICE-LAP3、CMH-1
短
20/12
不需
DEXD
细胞因子加工因子ICE样半胱天冬酶-1亚家族
半胱天冬酶-1（45）ICE
长，CARD
20/10
7CARDIAK
（W/Y/F）EHD
半胱天冬酶-4（43）ICErel-Ⅱ、TX、ICH-2
长，CARD
20/10
不明
（W/L/F）EHD
半胱天冬酶-5（48）ICErel-Ⅲ、TY
长
20/10
不明
（W/L/F）EHD
m半胱天冬酶-11（42）
长
20/10
不明
不明
m半胱天冬酶-12（50）
长
20/10
不明
不明
半胱天冬酶-13（43）
长
20/10
不明
不明
m半胱天冬酶-14（30）
短
20/10
不需
不明
无脊椎动物半胱天冬酶
CED-3（56）
长，CARD
17/14
CED-4
DEXD
DCP-1b（36）
短
22/13
不需
不明
a：
四肽序列方向为P4一Pl，蛋白水解只发生在Pl后的天冬氨酸；X指有较宽氨基酸特异性部位；列出一个以上氨基酸时，其先后按优先次序排列。
b：
为果蝇半胱天冬酶-1;m：
指鼠类
正常，但这些动物的细胞凋亡有的减弱有的促进，因不同组织来源而不同。
这种区别可能
与促凋亡性或抗凋亡性半胱天冬酶-2同工型的组织特异性表达有关。
半胱天冬酶-1
或半胱天冬酶-11基因剔除小鼠的白介素-lβ生成缺陷但可正常发育，而细胞凋亡的缺
陷却很轻微。
二、半胱天冬酶的结构
X线晶体图像资料提示所有半胱天冬酶都有共同结构。
每一种酶原有-N末端前
功能域（prodomain）、一个大亚单位和一个C末端小亚单位。
在大、小亚单位保守的
QACXG基序（motif）中含有半胱氨酸活性部位。
前功能域与大亚单位由一天冬氨酸裂解
部位分开，大和小亚单位则由接头隔开，接头位于大、小亚单位的含有一或两个天冬氨酸
裂解部位的功能域之间。
酶原的激活伴随有接头的蛋白水解和随后发生的前功能域的切
去。
活性酶为一四聚体，后者由两个大小亚单位的异源二聚体组成（图7-1）。
每一个异
源二聚体都有一个活性部位，它来源于大和小亚单位的氨基酸残基。
每一活性部位含有
一带正电荷的S．亚部位，它可与其底物中的带负电荷的Pl天冬氨酸残基结合。
Sl结合
部位是高度保守的，因此所有半胱天冬酶只在天冬氨酸残基后裂解其底物。
各个半胱天冬酶间有两个主要的结构差异。
第一，尽管Pl结合部位绝对要求天冬氨
酸，但S2-S4底物结合部位有明显变异而形成P2-P4不同的底物特异性。
用一合成重组肽
p181
图7—1半胱天冬酶的结构及其激活（引自Thornberry等[10]）
库（svntheticcombinatorialpeptidelibrary）最近已确定了lo种半胱天冬酶的最适四肽底物。
它们的序列选择性大致与不同半胱天冬酶作为凋亡启动、凋亡执行和细胞因子加工的不同
功能相一致。
这种序列选择性显然并不是绝对的，也不能代表各自的酶动力学。
例如半胱
天冬酶一3和半胱天冬酶一7都选择DEXD为基础的肽，但它们各自的水解作用动力学却有
显著区别。
第二，半胱天冬酶前功能域的长度和序列不同。
长前功能域半胱天冬酶的作用
是凋亡或促炎信号的信号整合器（signalintegrator），它含有促进与激活因子相互作用的序列
基序（motif）。
凋亡启动半胱天冬酶（i11itiatorcaspase，半胱天冬酶一2、一8、一9、一l0）的作用
一般在短前功能域的凋亡执行半胱天冬酶（effectorcaspase）（半胱天冬酶一3、一6、一7）的上
游。
反之，半胱天冬酶一1和半胱天冬酶一11主要的功能为细胞因子加工。
半胱天冬酶
一4，一5，一l2和一l4的功能所知甚少，但它们与半胱天冬酶一l的序列相似性高于凋亡
性半胱天冬酶。
因此，也把它们归之于细胞因子加工器。
总之，半胱天冬酶的功能取决于半
胱天冬酶的底物特异性、前功能域的长度和序列。
三、半胱天冬酶的激活
半胱天冬酶级联反应是细胞发生凋亡的核心环节，任何原因诱发的细胞凋亡都发生
如下反应（图7—2）。
图7—2半胱天冬酶级联反应
p182
亲和性标记实验证明半胱天冬酶酶原有很低的但可检出的蛋白水解活性，提示在一
定条件下它有潜在的自身激活作用。
此外，野生型半胱天冬酶的过度表达可导致半胱天
冬酶的加工和激活，但无酶促活性的突变体则无此现象，这就足以说明高浓度的半胱天冬
酶可发生自身激活。
前半胱天冬酶（procaspase）一8、前半胱天冬酶一9或CED一3的强
制性寡聚化有助于酶原的自身激活和促进细胞凋亡。
这个过程使酶原相互靠近，限制其
活动，提高自身酶原的局部浓度，而促进自身的激活作用。
接头分子（adapterm01ecule）将凋亡传感器如死亡受体和线粒体与前半胱天冬酶相联
系。
接头分子一般都具有一个使接头分子与传感器耦联的功能域和另一个与长前功能域
前半胱天冬酶相结合的功能域。
这些功能域包括死亡功能域（deathdomain，DD）、死亡
效应子功能域（deatheffectordomain，DED）和半胱天冬酶募集功能域（caspaserecruitment
domain，CARD）等。
DD、DED和CARD都有相似三维折叠排列的6个反向平行（anti-
parallel）的a一螺旋，并通过同类相互作用（1ike—likeinteraction）结合。
但疏水性相互作
用（hydrophobicinteraction）是DED—DED相互作用的重要形式，而静电性相互作用（elec—
trostaticinteraction）对于CARD—CARD相互作用是关键性的。
接头分子FADD（Fasassociatedproteinwithdeathdomain），具有死亡功能域的Fas结
合蛋白）将Fas死亡受体与前半胱天冬酶一8相耦联，它含有一可与Fas上相似的功能域
相互作用的DD功能域，它还含有一个可与前半胱天冬酶一8上的DED相结合的DED功
能域。
Fas的激活刺激受体DD与FADD上的相当的功能域相结合，从而通过DED的相
互作用而募集前半胱天冬酶一8。
继而的寡聚化促进前半胱天冬酶一8的自身激活作用。
FADD可能还可通过类似的方式激活前半胱天冬酶一l0。
含有两个DED功能域但无酶
促活性的半胱天冬酶一8样蛋白FLIP，可抑制Fas—FADD一前半胱天冬酶一8相互作用从
而抑制细胞凋亡。
线粒体感知并通过释放细胞色素c传输凋亡信号至接头分子凋亡蛋白
酶激活因子一l（apoptoticproteaseactivatingfactor一1，APAF一1），在腺苷酸存在下APAF一
1一细胞色素c复合物促进前半胱天冬酶一9的激活。
细胞色素c和腺苷酸看来是通过引
起其构型改变而使APAF一1CARD暴露。
暴露的APAF一1CARD转而通过CARD的
相互作用而募集前半胱天冬酶一9。
随后的前半胱天冬酶一9寡聚化有助于其自身激活。
最近有人证明半胱天冬酶一9的激活并不需要酶原的水解性加工，在胞浆辅助因子（推测
为APAF一1）存在时酶原本身就有明显活性。
Bcl—XL，一个抗凋亡Bc卜2家族蛋白成员，
可阻断这种相互作用从而抑制细胞凋亡。
另一个含有CARD的接头分子，含有一死亡功
能域的RIP（受体作用蛋白）结合ICH／CED一3的同源蛋白（homologousproteinto
RAIDD）[RIP（receptorinteractin9’protein）一associatedICH／CED一3hom01090usproteinwith
adeathdomain，RAIDD]可通过CARD．CARD相互作用使前半胱天冬酶一2与死亡受体
相耦联。
可见接头分子介导的蛋白质一蛋白质相互作用在凋亡性半胱天冬酶中广泛存
在。
对促炎性半胱天冬酶的激活机制了解甚少。
一个含有CARD的激酶，含有CARD的
白介素一lJ3转化酶结合激酶（CARD—containinginterleukin．1βconvertingenzyme—associated
kinase，CARDIAK）在体外通过CARD—CARD相互作用促进前半胱天冬酶一1的激活。
提
不CARD介导的寡聚化在前半胱天冬酶一l的激活中起作用。
CD40受体的连接促进前
半胱天冬酶一l的激活，但CARDIAK是否参与此激活过程不明。
半胱天冬酶一ll并不
能直接对前半胱天冬酶一1进行加工，但可促进酶原的非蛋白水解性相互作用。
p183
半胱天冬酶一旦激活就可转激活其他前半胱天冬酶，从而造成级联反应的放大作用
和正反馈调节。
例如半胱天冬酶一8可有效地激活前半胱天冬酶一3，激活的半胱天冬
酶一3可转而激活前半胱天冬酶一8。
虽然这种正反馈机制在理论上是可能的，但迄今尚
未证实。
由于半胱天冬酶有不同的底物特异性，单一半胱天冬酶的激活不能直接激活所
有的其他家族成员。
例如，半胱天冬酶一9可激活前半胱天冬酶一3和前半胱天冬酶一7，
但不能激活前半胱天冬酶一6。
因此，半胱天冬酶级联反应的扩布依存于细胞表达哪一种
半胱天冬酶、每一种半胱天冬酶的相对浓度，以及各个转激活反应的动力学效率。
另一种
半胱天冬酶激活为非一半胱天冬酶蛋白酶途径。
最好的例子是由细胞毒T细胞蛋白酶，
颗粒酶B（granzymeB）激活的途径。
颗粒酶B是一种天冬氨酸特异丝氨酸蛋白酶，它可激
活多种半胱天冬酶并强力地诱导细胞凋亡。
这个蛋白酶是前半胱天冬酶一3和前半胱天
冬酶一7的非常有效的激活因子。
颗粒酶8激活前半胱天冬酶一3的速度要比半胱天冬
酶一8快5．5倍，比半胱天冬酶一10快l7倍。
另一个丝氨酸蛋白酶，组织蛋白酶G
（cathepsinG）可通过裂解Gln一194以后的肽链有效地激活前半胱天冬酶一7，提示天冬
氨酸特异性并非半胱天冬酶激活所必需的。
但组织蛋白酶G（cathepsinG）还没有在细胞
凋亡中起作用的证据。
其他蛋白酶包括钙蛋白酶（calpain）、蛋白酶小体、凋亡性丝氨酸蛋
白酶P24和组织蛋白酶D已知可在凋亡发生过程中涉及。
但这些蛋白酶是直接的还是
间接地与半胱天冬酶相互作用还不清楚。
钙蛋白酶I诱发的凋亡可能与地塞米松、电离
辐射或大分子合成阻断诱导的凋亡有关。
已经证明钙蛋白酶可除去前半胱天冬酶一9的
CARD功能域而引起半胱天冬酶一9的激活。
半胱天冬酶的共同特征可归纳为：
①由单一30～50kDa的无活性的前体在Asp—X
的肽键被切割，生成17～20kDa和10～12kDa的大小亚基，酶的活性形式是由大亚基和
小亚基组成的四聚体。
②都有相似的催化部位，包括含有活性位点Cys残基的QACXG
基序和一个含His残基的SHG基序；③具有自身催化或相互激活的能力。
④Ca2+可直接
或间接地激活半胱天冬酶。
半胱天冬酶平时以无活性的酶原形式存在，细胞凋亡信号经
有关信号转导通路，通过该家族酶的级联反应使它们激活：
首先激活一启动半胱天冬酶
（如半胱天冬酶一8、一9，一l0）转而激活执行（效应）半胱天冬酶（如半胱天冬酶一3、一6、
一7）。
不同的启动子半胱天冬酶介导不同类型凋亡信号，如半胱天冬酶一8与死亡受体
参与的凋亡相关；半胱天冬酶一9则与细胞毒因子诱发的凋亡相关。
各种特异性蛋白酶
抑制剂如牛痘病毒的CrmA、杆状病毒（baculovirus）的P35蛋白因与半胱天冬酶形成稳定
复合体而抑制其活性；在神经原中表达杆状病毒P35基因的转基因小鼠对各种因素诱发
的凋亡和抽搐引起的神经变性呈现抗性[39|。
根据半胱天冬酶识别序列合成的四肽，如半
胱天冬酶一1的YVAD可竞争性抑制它的活性，也可抑制细胞凋亡的诱发。
四、半胱天冬酶的底物
凋亡不论由什么信号启动，均为立体型死亡（见图7—3）。
细胞浆萎缩、细胞膜起泡、
小泡形成，以及磷脂酰丝氨酸重新分布至细胞表面。
同时胞核收缩、染色质凝聚、DNA断
裂成大分子量的寡核小体片段。
因此确定半胱天冬酶的底物（substrateofcaspase）对于理
解细胞凋亡的进程有重要意义。
表7—3列举了5类半胱天冬酶底物的功能。
促一和抗
p184
表7-3凋亡性底物（仿自Cryns和Yuan[6]、Wolf和Greenn[11]）
底物类别
预计功能
底物举例
促一和抗凋亡蛋白
信号放大抑制因子
激活作用
前一半胱天冬酶，BCL-2，BCL-XL，BID，P28Bap31
半胱天冬酶激活脱氧核糖核酸酶抑制因子（ICAD）、肌动蛋白、胶溶蛋
凋亡机器成员
诱发凋亡表型
白（gelsolin）、P21激活的激酶-2（PAK2）．丝裂原激活的蛋白激酶一‘细
胞外信号调节激酶的激酶-1（MEKKl）、蛋白激酶Cδ（PKCδ）
核纤层蛋白、核有丝分裂器蛋白（nuclearmitoticapparatusprotein）、支架
结构蛋白和结
合分子
细胞完整性解体
细胞包装
附着因子-A（scaffoldattachmentfactor-A）、胞衬蛋白（fodrin）、Gas2[生
成停顿特异基因-2（growtharrestspecificgene-2）编码蛋白]、角蛋白、
肌动蛋白、rabaptin-5，p-连环蛋白，黏着斑激酶（focaladhesionkinase，
FAK）
DNA-依存性蛋白激酶酶促亚单位（DNAdependentproteinkinase
破坏大分子合成和细
catalyticsubunitDNA-PKcs）、多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ri-
稳态蛋白
胞修复机制
bose）polymerase，PARP、U1-70-kDa蛋白、复制因子C（replication
终止存活信号
factorC，RFC-140）、不均一核核糖核蛋白（HnRNP）、D4-GDP解离抑
制因子（GDPdissociationinhibitor，GDI）、转录因子
其他
不明
？
凋亡诱导
Huntingtin蛋白、早老蛋白（presenilin）、萎缩索-1（atrophin-1），ataxin
-3，胞浆磷脂酶A2
凋亡蛋白可能是凋亡刺激后最早被半胱天冬酶作用的靶分子。
这些裂解事件参与信号放
大和抑制因子的失活。
例如，前半胱天冬酶的转激活可生成足够的蛋白水解活性以消除
内源的半胱天冬酶抑制因子。
半胱天冬酶-3裂解BCL-2和BCL-xi以破坏它们的抗
凋亡功能，释放出有促凋亡作用的C末端片段；半胱天冬酶-8裂解促凋亡BCL-2家族
成员BID蛋白，释放出其C末端片段，后者可诱导线粒体细胞色素c的释出。
半胱天冬
酶-8也可裂解P28BAP31，它是一个存在在内质网上的BCL-2结合蛋白。
它的裂解
可促进凋亡信号，因为其N末端片段可诱发凋亡。
随着凋亡信号的扩布，半胱天冬酶激
活其他凋亡机器成员。
其中包括ICAD-DFF45（inhibitorofcaspase-activatedDnase，半胱
天冬酶激
升级会员 